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Summary
この方法は、標準化されたマイクロ流体プラットフォームにおける40の浸透した3Dマイクロ容器としてiPSC由来内皮細胞の培養を記述する。このプラットフォームは、アナストモシスや、スケーラブルで高スループットな方法での血管新芽の安定化を含む、3Dでの勾配駆動血管新生芽芽の研究を可能にします。
Abstract
血管疾患の前臨床薬研究は、高スループットスクリーニングに修正可能な血管系のインビトロモデルを必要とします。しかし、十分なスループットを有する現在のインビトロスクリーニングモデルは生理学的関連性が限られており、インビトロからインビボへの所見の翻訳を妨げる。一方、マイクロ流体細胞培養プラットフォームは、インビトロで比類のない生理学的関連性を示しているが、多くの場合、必要なスループット、スケーラビリティおよび標準化を欠いている。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC-EC)由来の内皮細胞の血管新生を、灌流や勾配を含む生理的関連細胞微小環境で研究する堅牢なプラットフォームを実証する。iPSC-ICは、パターン化されたコラーゲン-1足場に対して40個の浸透3Dマイクロ容器として培養されます。血管新生因子の勾配の適用に際して、先端および茎細胞への分化および吸入可能な内腔の形成を含む血管新生の重要な特徴を研究することができる。蛍光トレーサー色素による灌流は、血管新生芽のアナストモシス中および後の透過性の研究を可能にする。結論として、この方法は、標準化されたスケーラブルな3D血管新生アッセイにおけるiPSC由来ECの実現可能性を示し、生理学的関連の培養条件を統合し、内で統合するために必要な堅牢性と拡張性を有するプラットフォームに組み合わせる薬物スクリーニングインフラ。
Introduction
インビトロモデルは、血管疾患の新薬標的の発見と検証において基本的な役割を果たす。しかし、十分なスループットしか持っていない現在のインビトロスクリーニングモデルは、生理学的関連性1が限られており、インビトロからインビボへの所見の翻訳を妨げる。したがって、前臨床血管薬の研究を進めるためには、高スループットスクリーニングと生理学的に関連する3D細胞マイクロ環境を組み合わせた血管系の改良されたin vitroモデルが必要である。
過去10年以内に、血管系の体外モデルの生理学的関連性を高めるために大きな進歩が見られた。組織培養プラスチックなどの平らな表面に内皮細胞を培養する代わりに、内皮細胞をフィブリンやコラーゲンゲル2などの3D足場に埋め込むことができる。これらのマトリックス内において、内皮細胞は、マトリックス分解および内腔形成に関連するより生理学的に関連する表現型を示す。しかしながら、これらのモデルは、細胞微小環境からの重要な手がかりがまだ欠けているので、血管新生発芽の間に生じる多くのプロセスのサブセットのみを示す。
マイクロ流体細胞培養プラットフォームは、血管系のin vitroモデルの生理学的関連性をさらに高めるために独特に適している。例えば、内皮細胞はせん断ストレスにさらされ得るが、これは血管系にとって重要な生体力学的刺激である。また、微小流体内の流体を空間的に制御する可能性により、生体分子勾配3、4、5、6の形成が可能となる。このような勾配は、血管新生時の形成およびパターニング中の生体内において重要な役割を果たす。しかし、マイクロ流体細胞培養プラットフォームは、従来の2Dおよび3D細胞培養方法に対して比類のない生理学的関連性を示しているが、多くの場合、薬物スクリーニングに必要なスループット、スケーラビリティ、標準化に欠けている。7.また、これらのプラットフォームの多くは市販されていないので、エンドユーザーは8を使用する前にデバイスを微細加工する必要があります。これは、製造装置と技術的知識を必要とするだけでなく、品質管理のレベルを制限し、再現性9に悪影響を及ぼす。
現在までに、原発性ヒト内皮細胞は、インビトロ10で血管新生をモデル化するために最も広く使用されている細胞源のままである。しかしながら、原発ヒト細胞には、スクリーニングアプローチにおける日常的な適用を妨げる多くの制限がある。第一に、一次細胞由来培養物をスケールアップして拡大する可能性は限られている。したがって、大規模な実験では、異なるドナーからのバッチを使用する必要があり、ゲノムの違いやバッチ間の変動が生じる。第2に、いくつかの通路の後、一次内皮細胞は、一般に、インビトロ11、12で培養すると関連する特性を失う。
ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する内皮細胞は有望な代替手段である:それらは一次細胞に似ているが、より安定した遺伝子型を有するが、精密なゲノム編集にも適している。さらに、iPSCは自己更新が可能なため、ほぼ無制限の量で拡張できるため、iPSC由来の細胞は、インビトロスクリーニングモデル13内で使用するための一次細胞に代わる魅力的な代替手段となる。
ここでは、内皮細胞を、標準化された高スループットマイクロ流体細胞培養プラットフォームで、含皮3Dマイクロ容器として培養する方法について説明する。灌流は、堅牢な動作を保証し、アッセイのスケーラビリティを向上させるロッカープラットフォーム上にデバイスを配置することによって適用されます。微小血管が連続的に浸透し、血管新生因子の勾配にさらされるように、血管新生芽は、より生理学的に関連する細胞微小環境で研究される。プロトコルは(一次)内皮細胞14、15の多くの異なるソースと互換性がありますが、我々は、このアッセイの標準化を高め、その統合を容易にするために、ヒトiPSC由来のICを使用することに焦点を当てた血管薬の研究の中で.
Protocol
1. デバイスの準備
- マイクロ流体384ウェルプレートを滅菌層流フードに移します。
- ふたを取り外し、マルチチャンネルまたは繰り返しピペットを使用して、40個の観測井戸(図1b、ウェルB2)のそれぞれに50μLの水またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えます。
注:プロトコルはここで一時停止できます。室温(RT)の滅菌培養キャビネットに蓋をしたままにしておきます。
2. ゲルとコーティングの準備
- 10 μg/mL フィブロネクチン(FN)コーティング溶液の2.5 mLを調製します。ダルベッコのPBS(dPBS、カルシウム、マグネシウムフリー)の2.5 mLで1mg/mLフィブロネクチン原液の希釈25μL。使用するまで37°Cの水浴に溶液を入れます。
- コラーゲン-1溶液を100μL調製します。10 μLのHEPES(1 M)をNaHCO3(37 g/L)の10°Lに加え、ピペットで混ぜます。氷の上にチューブを置き、コラーゲン-1(5 mg/mL)の80 μLを加え、4mg/mLの中和コラーゲン-1濃度を得ます。慎重に混合し、気泡の形成を避けるためにピペットを使用してください。
- 各マイクロ流体ユニットのゲル入口にコラーゲン-1溶液(4mg/mL)を1.5μL加えます(図1b、ウェルB1)。ゲルがチャネルに入るには、ゲルの液滴が各ウェルの中央に配置されていることを確認します(図 2aを参照)。
注:フェーズガイドは隣接するチャネルの充填を防ぎ、ゲルパターニングを可能にします。正しいゲルローディングは、「観察窓」(ウェルB2)を介して半月板形成を観察するか、プレートを逆さまに反転させることによって、明視野顕微鏡下で確認することができます。ゲルがチャネルを完全に満たさなかった場合は、1 μLの追加液滴を加えることができます。 - マイクロ流体プレートをインキュベーター(37°、5%CO2)に10分間入れ、コラーゲン-1を重合します。
注:重合のタイミングは非常に重要です。マイクロ流体に使用される体積が少ないため、15分のインキュベーション後に蒸発が既に観察され、ゲルの崩壊や収縮が生じます。 - プレートをインキュベーターから取り出し、滅菌層流フードに移します。
- すべてのマイクロ流体ユニットの上部灌流チャネルの出口ウェルに、10 μg/mL FNコーティング溶液の50 μLを追加します(図1b、ウェルA3)。ピペット先端を井戸の側面に押し付けて、気泡を閉じ込めずに井戸を正しく充填します(図2bを参照)。チャネルは充填する必要があり、液体はよく出口を満たさずに出口(ウェルC1)に固定する必要があります。
- プレートをインキュベーター(37°、5%CO2)に少なくとも2日間置きます。
注:プロトコルは、コーティング混合物と一緒にコラーゲン-1ゲルがインキュベーターで少なくとも5日間安定しているので、ここで一時停止することができます。コーティング混合物がリフレッシュされた場合、より長い期間が可能である可能性がありますが、これはテストされていません。これは、コラーゲン-1ゲルの脱水を防ぐため、FNコーティングのレベルです。
3. 細胞播種/マイクロ容器培養
- 胎児の子牛血清5mL、ペン/ストレップ2.5mLを基底内皮細胞培養培地の500mLに加え、0.22μmの細孔サイズのボトルトップフィルターを使用して殺菌をフィルタリングします。この培地は基底培地と呼ばれるようになりました。
- 血管成長培地を準備する:50μg/mL血管内皮成長因子(VEGF)の3μLと20μg/mLの基本的な線維芽細胞増殖因子(bFGF)の2μLを基底媒体の5mLに加えます。
- 凍結したiPSC-ICを37°Cの浴で急速に解凍し(<1分)、15mLチューブに移し、基底媒体で10 mL希釈します。
- セルをカウントします。
注:単一のバイアルは、0.5 mLの100万個の細胞を含み、生存率は>90%です。 - 5分間100 x gでチューブを遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく吸引性上清を吸引し、基底培地で再サスペンドして、2 x 107細胞/mLの濃度を得た。
- マイクロ流体384ウェルプレートをインキュベーターから滅菌層流フードに移します。
- 灌流入口からFNコーティング溶液を吸引する(ウェルA1)。入口井戸に基底媒体を25μL加えます(ウェルA1)。
- すべてのトップ灌流入口ウェルに1μLの細胞懸濁液を加えます(図1b、ウェルA1)。液滴は数秒で平坦化する必要があります(この「パッシブポンプ」方法の図については、図3a,bを参照してください)。
メモ:シーディングが均質であるかどうかを顕微鏡で確認してください。そうでない場合は、コンセントに別の1°Lを追加し、液滴が平らになるまで待ちます。 - マイクロ流体ウェルプレートを37°Cで1時間インキュベートし、5%CO2.この後、細胞は付着しているはずです。そうでない場合は、さらに 30 分間待ちます。
- 上部の灌流出口井戸から基底媒体を取り除きます(図1b、ウェルA3)。上部の灌流入口および出口に温血管培養培地を加えます(図1b、井戸A1およびA3)。ロッカープラットフォーム(7°角度、8分ロッキング間隔に設定)にプレートをインキュベーター(37°、5%CO2)に置きます。
- 1日目と2日目のポストシードで、明視野顕微鏡を用いてプレートを画像化し、細胞の生存率を確認します。2日後、コンフルエント単層は、コラーゲン-1足場に対して形成されるべきである。
注:チャネルが均等にコンフルエントでない場合、マイクロ容器をさらに24時間培養することができます。
4. 先端細胞と茎細胞形成を含む血管新生芽を研究する
- 4.5 μLのVEGF(50μg/mLストック)、4.5μLのPHORBOL 12-myristate-13-アセテート(PMA)(2μg/mLストック)、および2.25μLのスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)を補製することにより、血管新生発芽培地を4.5mL調製します。
- 血管成長培地(30 ng/mL VEGFおよび20 ng/mL bFGFを添加した基底培地)の8.5 mLを調製する。
- 井戸から培地を吸引し、トップ灌流入口および出口井戸およびゲル入口および出口井戸に50μLの新鮮な容器培養培地を加えた(図1b、井戸A1、A3、B1及びB3)。
- 底面チャネル入口および出口井戸のそれぞれに50μLの血管新芽混合物を加える(図1b、井戸C1およびC3)。
- 血管新生成長因子の勾配を形成するために、ロッカープラットフォームのインキュベーター(37°、5%CO2)にデバイスを戻します。
- 画像1日目および2日目に、自動化された段階を有する明視野顕微鏡を用いて血管新生成長因子を添加した。
注:マイクロ容器の培養を続けて解剖学を研究するか(セクション5に進む)、マイクロ容器を固定して染色し、2日目と6日目に芽を出す長さと形態を定量化します(セクション6に進みます)。
5. 研究アナストモシスとスプラウト安定化
- 自動化された段階が付いている明視野顕微鏡を使用したイメージ。
- 蛍光標識アルブミン(0.5 mg/mL)を上部の灌流入口(図1b、ウェルA1)に1μLを加え、50μLピペットを使用して混合します。
- 37°Cに設定された自動ステージとインキュベーターで、プレートを蛍光顕微鏡に移します。顕微鏡を10倍の客観的かつ正しい露光設定(例えば、テトラメチルロハダミン[TRITC]チャネル、20ms露光)に設定します。10分間毎分タイムラプス画像を取得します。
- 顕微鏡からプレートを取り出し、プレートを滅菌層流フードに移します。
- 井戸からすべての培地を取り除き、対応する井戸の血管培養培地と血管新生発芽培地の両方を交換します(ステップ4.3および4.4を参照)。
- デバイスをインキュベーター(37°、5%CO2)に戻し、血管新生芽を続けます。
- 手順 5.1- 5.6 を繰り返して、6 日目の透過性を調べてください。
6. 固定、染色、イメージング
- すべての井戸からすべての文化メディアを吸引。
注:マイクロ流体チャネルの残留媒体または液体は、その低体積が1−2°Lに起因する固定に影響を与えません。 - PBSに4%パラホルムアルデヒド(PFA)の25μLをすべての灌流入口(図1b、A1、C1)と出口井戸(図1b、A3、C3)に加えます。RTで10分間インキュベートし、デバイスをわずかな角度(±5°)の下に置き、流れを誘発します(例えば、プレートの片側を蓋の上に置くことによって)。
- 井戸からPFAを吸引する。ハンクのバランスのとれた塩溶液(HBSS)の50°Lで、すべての灌流入口と出口を2回洗浄します。井戸からHBSSを吸引。
- RTで10分間、すべての灌流入口および出口に0.2%の非イオン性界面活性剤の50°Lを加えることによって透過する。
- 井戸から非イオン性界面活性剤を吸引する。すべての灌流インレットと出口井戸に50°LのHBSSを加えて、灌流チャネルを2回洗浄します。井戸からHBSSを吸引。
- HBSSでホエヒスト(1:2,000)とF-アクチンを使用して核を染色します。40単位で2.2 mLを準備し、各灌流入口と出口によく25°Lを加えます。プレートをわずかな角度で置き、RTで少なくとも30分間インキュベートします。
- すべての灌流入口および出口で50°LのHBSSで2回洗浄します。
- 自動ステージ付きの蛍光顕微鏡を使用して直接画像を作成するか、後で使用するために4°Cで光から保護されたプレートを保存します。
Representative Results
マイクロ流体3D細胞培養プラットフォームは、パターン化されたコラーゲン-1ゲルに対する浸透した微小血管の血管新生発芽を研究するために使用される40個の浸透マイクロ流体ユニット(図1a,b)で構成されています(図1c)。これらのマイクロ容器は絶えず浸透し、血管新生成長因子の勾配にさらされる(図3a-d)。血管新生芽は、勾配暴露後2日で研究するか、解剖学および芽安定化を研究する勾配暴露後5日間以上培養することができる(図1d参照)。
パッシブポンプ法を使用して iPSC-IC をシードすると、均質なシード密度が得られます(図 4a,b)。連続的な灌流下での培養は、細胞がマイクロ流体チャネルの円周を完全に裏打ちし、パターン化されたコラーゲン-1ゲルに対してコンフルエント単層の形成を有する2日間でコンフルミクロ容器をもたらした。
血管新因性因子の勾配への暴露は、パターン化されたコラーゲン-1ゲル内の微小血管の方向性血管新生発芽をもたらした(図5a-g)。明確な先端細胞形成およびコラーゲン-1ゲルへの浸潤は血管新生勾配を添加した後24時間見え、一方、内腔形成を含む茎細胞は48時間後に見えた(図5a)。
固定および染色後、毛細管ネットワークは、F-アクチンを染色するためにファロイジンを使用し、Hoechst 33342を使用して核を染色することを可視化することができる(図5b,c)。これらの芽を定量することができる(例えば、形状および長さ14)。成長因子を添加しなければ、コラーゲン-1ゲルへの浸潤は認められない(図5d)。共焦点イメージングは、芽径を決定し、ルーメン形成を確認するために使用された(図5e-g)。
新芽は、勾配の方向に向かって成長し続け、血管新生成長因子を添加してから3〜4日以内に反対の灌流チャネルに達する。これにより血管ネットワークの改造が行い、血管新生芽の数が明らかに減少する(図6a)。ルーメン形成は、蛍光標識高分子(例えば、アルブミンまたはデックストランス)を有する血管ネットワークの灌流によって評価された。解剖学の前後に0.5mg/mL標識アルブミンを有するマイクロ容器を透過させることで、10分後の発芽透過性に明らかな差が明らかになった(図6b-e)。
図1:iPSC由来マイクロ容器のマイクロ流体細胞培養プロトコル(a)マイクロ流体細胞培養装置の底部には、384ウェルプレートの下に集積された40個のマイクロ流体ユニットを表示する図が示されている。大きなビューには、40 個のマイクロ流体ユニットの 1 つが表示されます。(b)各マイクロ流体ユニットは、3つの入口井戸と3つの出口井戸を備えた9つの井戸の下に配置されています。マイクロ流体チャネルは尾根(「位相ガイド」)で分離され、隣接するチャネル(「灌流チャネル」)との接触が残っている間、中央チャネル(「ゲルチャネル」)のヒドロゲルのパターニングを可能にします。(c)マイクロ流体装置内の浸透したマイクロ容器を培養する方法は、パターン化されたコラーゲン-1マトリックスを介して発芽する勾配駆動血管新生を研究するために用いられる。(d) 血管新生発芽および/またはアナストモシスを研究するためのタイムライン。この図は、ファン・デュイネンら14から改変されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ゲルおよび培地のローディング手順(a)正しい、または誤ったゲル堆積の例。正しいファイリング結果は、中間チャネルにパターン化されたコラーゲン-1ゲルをもたらし、その後重合される。(b) 井戸の正しい充填と誤った充填の例。ウェルは、マイクロ流体チャネル内の気泡トラップを防ぐために、1-4の順序で充填されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:連続静水圧駆動流れと勾配安定化(a) 井戸間の静水圧差は、マイクロ流体チャネル内のパッシブレベリングと流れを生じる。(b) デバイスを7°および8分サイクルタイムに設定されたロッカープラットフォームに配置すると、マイクロ流体チャネル内で連続的な双方向灌流が発生します。(c)勾配は、受動的な平準化によって連続的にリフレッシュされるウェル内に2つの異なる濃度を導入することによって形成される。(d)フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストランを用いた勾配可視化双方向の流れは3日まで勾配を安定させる。スケール バー = 200 μm。この図は、ファン・デュイネンら14から改変されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:細胞播種のためのパッシブポンプ方式。(a)パッシブポンピングは、表面張力の違いによって引き起こされる圧力差によって駆動される。これにより、液滴(高内圧)から貯留層(低内圧)に向かって流れます。(b)マイクロ流体チャネルの入口(白い輪郭)の上に置かれた液滴(灰色の輪郭)のタイムラプス(青い輪郭)。加算直後(図4b、i)は、入口の上の液滴が縮む(図4b、ii:1s;iv:2 s を加算した後)、流出口に向かって流れます。これは、液滴半月板が入口によって固定されるまで続きます(図4b、iv)。スケール バー = 400 μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
図5:iPSC-ECマイクロ容器の堅牢な3D発芽(a) 時間の経過につながった iPSC-EC の発芽。微小血管を48時間(右)に成長させ、50ng/mL VEGF、500 nM S1P、および2 ng/mL PMAを含む血管新生カクテルで刺激した。コラーゲン-1足場(中央)に侵入する最初の先端細胞は、暴露後24時間見える。最初のルーメンは露出後48時間(矢印)に見え、先端細胞は勾配の方向にさらに移行した。(b)VEGF、S1PおよびPMAで2日間刺激され、F-アクチン(黄色)および核(青色)に染色された15個のマイクロ容器のアレイ。スケールバー = 200μm(c) 刺激マイクロ容器(正制御)。(d) 未刺激のマイクロ容器(負の対照)。(e) ゲル内の単一の毛細血管の最大投影法。(f) (g) と同じですが、中央に焦点を当てています。点線は、パネル g. スケールバー (a-d: 200 μm; e-g: 20 μm) における直交図の位置を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:解剖学前後の血管新芽透過性の可視化(a)基底チャネルを有するアナストモシスは、血管新生芽の剪定および成熟を引き起こす。血管新生成長因子を有する刺激後2、4、6および7日の毛細血管ベッドのクローズアップ。(b)血管新生成長因子を添加してから2日後に血管新生芽が生じうる。血管新生芽はゲル内に形成されるが、底面融合チャネルにはまだ接続されていない。(c)マイクロ容器の灌流を0.5mg/mLアルブミン-アレクサ555溶液で行う。0および10分で得られた蛍光画像(d,e)パネルbおよびcと同じであるが、刺激の7日後。スプラウトは反対側に接続され、基底灌流チャネルにコンフルエントマイクロ容器を形成した。スケールバー = 100μm.ここをクリックすると、この図の大きなバージョンが表示されます。
| 問題 | 原因 | ソリューション |
| コラーゲン-1は完全にチャネルに入るか、または満たさない | コラーゲン-1液滴は入口の上に置かれてない | 慎重にゲルチャネルからの入口の上に液滴を置きます |
| コラーゲン-1の体積が少なすぎる | 1.5°Lのゲルを使用してチャネルを完全に充填する | |
| コラーゲン-1は粘性が高すぎる | コラーゲン-1の別のバッチを使用してください | |
| コラーゲン-1は灌流チャネルに流れる | コラーゲン-1はゲルチャネルの入口に直接ピペットされる | 慎重にゲルチャネルからの入口の上に液滴を置きます |
| コラーゲン-1は明確でない/繊維形成 | コラーゲン-1が正しく保存されない | コラーゲン-1を4°Cで保存し、凍結しないでください |
| NaHCO3とHEPESは、コラーゲン-1を追加する前によく混合されません | コラーゲン-1を追加する前にピペットでNaHCO3とHEPESを慎重に混合 | |
| パッシブポンプ法を使用して液滴が縮小しない | 液滴は井戸の側面に付着する | 吸引液滴と入口の上に新しい液滴を追加 |
| コンセントが少なくとも20°Lのミディアムで満たされていることを確認します。 | ||
| 発芽は認められない | 成長因子が追加されないか、アリコートが正しく保存されない | 新鮮な血管新生芽培地を準備する |
| 気泡ブロック灌流/勾配形成 | P20 または P200 ピペットを使用して気泡を除去する | |
| 井戸間の体積差 | すべての井戸の体積は、線形勾配を形成するために等しくする必要があります | |
| 実行可能でないセル | ロッカープラットフォーム/ロッカープラットフォームにプレートが置かれておらず、オフ | ロッカープラットフォームがオンで、正しいサイクル時間/角度(8分/7°)を持っていることを確認してください |
| 気泡の存在による灌流は不可能 | P20 または P200 ピペットを使用して気泡を除去する | |
| ルーメンは形成され、細胞は単一の細胞として移動する | 単層が形成される前に血管新生芽混合物を添加した | 血管新生成長因子を追加する前に、さらに24時間待ちます |
| 発芽密度の主な変動 | 播種後の細胞密度の違い | 細胞密度が均質で、マイクロ流体ユニット間で同等かどうかを確認します。必要に応じて、細胞懸濁液の別の液滴を追加します。 |
表 1: 一般的なエラーのトラブルシューティング
Discussion
この方法は、堅牢でスケーラブルなマイクロ流体細胞培養プラットフォーム内の40の浸透性内皮マイクロ容器の培養を記述する。従来の2Dおよび3D細胞培養法と比較して、この方法は、勾配および連続的な灌流を含む生理学的関連の細胞微小環境を、スクリーニングのための十分なスループットを有する3D細胞培養と組み合わせる方法を示す目的。
同等のマイクロ流体アッセイに比ぶ大きな利点の1つは、この方法が灌流用ポンプに依存せず、ロッカープラットフォームを使用してすべてのマイクロ流体ユニットで連続的な灌流を同時に誘導することです。これにより、アッセイが堅牢でスケーラブルであることが保証され、プレートをロッカープラットフォームに積み重ねることができます。重要なことに、すべてのマイクロ流体ユニットは個別にアドレス可能なままであり、これは用量応答曲線の生成を含む薬物スクリーニング内でこの方法を実施することを可能にする。さらに、ポンプなしで、イメージ投射および媒体の取り替えは(クロス)汚染のより少ないより少ないより簡単である。
この方法のもう一つの利点は、標準化された、事前に製造されたプラットフォームの使用であり、同等のマイクロ流体細胞培養プラットフォームは、エンドユーザーが製造する必要があります。この可用性は、他の学術および製薬研究グループの間でこのアッセイの採用を容易にし、標準化につながります。また、マイクロ流体プロトタイプとは異なり、384ウェルプレートインタフェースは、現在のラボ機器(例えば、アスピレータ、プレートハンドラ、マルチチャンネルピペット)との互換性を確保し、現在のスクリーニングインフラストラクチャ内の統合を容易にします。.
このアッセイを実行するには、いくつかの重要なステップがあります。コラーゲン-1ゲルは完全にゲルチャネルを充填する必要があります。ゲルローディング中に、この充填は、観察ウィンドウ(図2a)を介してマイクロ流体チャネルを検査するか、プレートを逆さまに反転させることによって観察できます(図1a参照)。充填中、コラーゲンゲルは、隣接する灌流チャネルに流れることなく、中心チャネルに留まるべきです。コラーゲン-1ゲルの品質は、適切なアッセイ性能のために重要であることに気づいた。粘度が高すぎるコラーゲン-1バッチは、ゲルチャネルの不完全な充填につながります。37°Cで重合の10分後、ゲルは均質で明確でなければなりません。コラーゲン-1が適切に保存されていない場合(例えば、冷蔵庫内の温度の変動による)、コラーゲンは明確に目に見える繊維形成を有するチャネル内で重合する。これは、血管新生因子を加えることなく、適切な内腔の発達なしに、ゲルにICの侵入をもたらす可能性があります。
細胞が播種されると、フィブロネクチンコーティング溶液はウェルから除去され、コーティング溶液で満たされたマイクロ流体チャネルのみを残します。マイクロ流体チャネルからのコーティング溶液の吸引は、ゲル破壊またはゲル吸引を引き起こす可能性がある。セルサスペンションは、このコーティング溶液を交換/変位させる必要があります。これは、セル懸濁液をチャネルに直接パイプ処理することで再現性の低いシード密度を示すので、パッシブポンプ法を使用して細胞懸濁液をシードする場合に最適です。
マイクロ容器がゲルに対して安定な単層を形成するので、これらの小さな違いは、結合に達するために必要な異なる時間をもたらすだけです。したがって、アッセイ開始点は、培養時間ではなく合流によって決定される。必要に応じて、培養時間はゲルに対して透明な単層が形成されるまで延長することができる。
井戸内では、気泡が井戸の不適切な充填によって閉じ込められることがあります(図2b参照)。これらの気泡は、デバイスがロッカープラットフォームに配置されている場合でも、媒体の流れを制限し、マイクロ容器の崩壊と不適切な勾配形成をもたらす。井戸の側壁にピペットの先端を押すと、井戸を完全に充填する成功が増加します。気泡が井戸内に閉じ込められている場合は、無菌ピペットチップをガラス底にそっと挿入することで除去できます。気泡は、マイクロ流体チャネル内でも発生する可能性があります。培地が井戸から取り除かれると、30分後(チャネル内のマイクロリットル体積による)後にマイクロ流体チャネルから媒体の蒸発が顕著になる。従って、中程度の変化は、可能な限り速やかに行うことが好ましい。蒸発した媒体を持つチャネルに媒体を加えると、気泡はマイクロ流体チャネル内に閉じ込められる。マイクロ流体チャネル内のこれらの気泡は、P20ピペットを入口または出口に直接配置し、反対側のウェルからマイクロ流体を介して媒体を強制することによって手動で除去することができる。気泡の除去に成功すると、他の井戸の体積が小さいながらも顕著に減少します。表 1に、一般的なエラーとそのトラブルシューティング方法を示します。
ロッカープラットフォームは、連続的な時間間隔で画像にユーザーを制限するので、ポンプの欠如は、連続的なイメージングが必要な場合の制限です。さらに、このプラットフォームの媒体の灌流は、せん断応力のレベルが低い双方向の流れから成り、生体内の血管系は、より高いレベルのせん断応力を伴う単方向の流れにさらされます。血管新生発芽に関する双方向流れの悪影響は観察しませんが、流れは重要な生体力学的刺激であり、好ましくは制御されます。しかし、市販のポンプセットアップがありますが、384ウェルプレートとのインターフェースは依然として困難であり、ポンプのセットアップはこのアッセイのスケーラビリティを著しく妨げます。
iPSC-ICを使用して血管新生発芽を研究する可能性は、疾患モデリングと薬物研究の新たな機会を開きます。一次ICとは対照的に、これらの細胞は安定した遺伝子型を持つほぼ無限の量で生成することができ、ゲノム編集技術を使用することで、遺伝子ノックアウトやノックインを含む細胞を生成することができます。ただし、IC と iPSC を区別するプロトコルは比較的新しいため、プライマリ EC を最もよく反映する iPSC-EC につながるもの、およびどのサブタイプを生成できるかはまだ不明です。また、彼らの関連性に関する疑問はまだ残っています。例えば、iPSC-ECは、内皮細胞に典型的な可塑性を示しているのでしょうか?そして、iPSC由来の細胞はどの程度まで細胞の微小環境に反応し、相互作用するのか?ここで紹介する標準化されたプラットフォームは、iPSC 派生 EC の vitro の使用状況をさらに検証するために、これらの質問の一部に答えるために使用できます。
このアッセイの最も簡単な将来の方向性は、骨球やマクロファージなどの血管新生の間に重要な役割を果たす他の細胞型の統合であろう。これは、新芽間のアナストモシス中のマクロファージの役割または毛細血管形成後のペリサイトの付着を研究する能力を促進する。また、細胞外マトリックス内または細胞外マトリックスに対して様々な他の細胞型を培養することが可能である(例えば、我々はニューロンおよび近位尿細管および小腸のような種々の上皮構造の培養を示した)、血管と組み合わせることができるこの方法を使用して生成されたベッド。最後に、合成ヒドロゲルの血管新生芽を研究することは興味深いものであり、その定義された組成物はアッセイの標準化をさらに増加させ、細胞とマトリックスの相互作用に影響を与える剛性および結合動機のチューニングを可能にするので、興味深い。
結論として、この方法は、標準化されたスケーラブルな3D血管新生アッセイにおけるiPSC由来ECの実現可能性を示し、生理学的関連の培養条件を統合し、内で統合するために必要な堅牢性と拡張性を有するプラットフォームに組み合わせる薬物スクリーニングインフラ。
Disclosures
P.ヴァルトとT.ハンケマイヤーはミメタスBVの株主です。V.ボルドルフとA.ライジャーケルクは、Ncardia BVの従業員です。V・ファン・デュイネン、W・スタム、V・V・オルロワ、A.J.ファン・ゾンネフェルトは情報開示を行っていない。
Acknowledgments
この作品は、オランダ保健研究開発機構(ZonMw)の「ミーア・ケニスがミンダー・ディエレンに会った」プログラム(プロジェクト番号114022501)とオランダ心臓財団CVONコンソーシアム助成金の研究助成によって一部支援されています。再接続。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2-10 μL Electronic repeater pipette | Sigma | Z654566-1EA | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-056 | |
| 3-lane OrganoPlate | Mimetas | 4003-400B | |
| 4% PFA in PBS | Alfa Aesar | J61899 | |
| Basal culture medium | NCardia | ||
| Collagen-1 | Cultrex | 3447-020-01 | |
| Combitips Advanced Biopur 2.5 mL | VWR | 613-2071 | |
| dPBS | Gibco | 14190-094 | |
| Eppendorf Repeater M4 pieptte | VWR | 613-2890 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F4759-1MG | 1 mg/mL in milliQ water |
| HBSS | Gibco | 14025-050 | |
| Hoechst | Molecular Probes | H3569 | 10 mg/mL solution in water |
| iPSC-derived endothelial cells | NCardia | ||
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 37 g/L in milliQ water |
| OrganoPlate Perfusion Rocker Mini | Mimetas | Rocker platform used to provide flow | |
| Pen/Strep | Sigma | P4333 | |
| Phalloidin | Sigma | P1951 | 1 mg/mL in DMSO |
| PMA | Focus-Biomolecules | 10-2165 | 2 μg/mL in PBS containing 0.1% DMSO |
| S1P | Ecehelon Biosciences | S-2000 | 1 mM in methanol containing 1% acetic acid |
| TRITC-albumin | Invitrogen | A34786 | |
| VEGF | Peprotech | 450-32-10 | 50 μg/mL in water containing 0.1% BSA |
References
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Tags
バイオエンジニアリング,問題153,3D細胞培養,マイクロ流体学,インビトロ,ヒト人工多能性幹細胞,内皮細胞,血管新生,勾配,ハイスループットスクリーニング,アッセイ開発Erratum
Formal Correction: Erratum: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro
Posted by JoVE Editors on 01/25/2022.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro. The Protocol section was updated.
Step 2.6 of the Protocol was updated from:
Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the outlet (well C1) without filling the outlet well.
to:
Add 50 µL of 10 µg/mL FN coating solution to the outlet well of the top perfusion channel of every microfluidic unit (Figure 1b, well A3). Press the pipette tip against the side of the well for correct filling of the well without trapping air bubbles (see Figure 2b). The channel should fill, and the liquid should pin on the inlet (well A1) without filling the inlet well.
Step 3.7 of the Protocol was updated from:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion inlet (well A1). Add 25 µL of basal medium in the inlet wells (well A1).
to:
Aspirate FN-coating solution from the perfusion outlet well (A3) and replace with 25 µL of basal medium in the outlet well (well A3).
