Her præsenterer vi en eCLIP-protokol for at bestemme store RNA-mål for RBP-kandidater i testikler.
Spermatogenesis definerer en højt bestilt proces af mandlige kimcelle differentiering i pattedyr. I testis, transkription og oversættelse er afkoblet, understreger betydningen af post-transkriptional regulering af genekspression orkestreret af RBPs. At belyse mekanistiske roller af en RBP, Cross Linking immunopræcipitation (Clip) metode kan bruges til at indfange sine endogene direkte RNA mål og definere de faktiske interaktion sites. Den forbedrede CLIP (eCLIP) er en nyudviklet metode, der giver flere fordele i forhold til de konventionelle CLIPs. Men, brugen af eCLIP har hidtil været begrænset til cellelinjer, der opfordrer til udvidede applikationer. Her har vi ansat eCLIP til at studere MOV10 og MOV10L1, to kendte RNA-bindende helicases, i mus testis. Som forventet, finder vi, at MOV10 overvejende binder sig til 3 ‘ uover satte regioner (UTRs) af mRNA og MOV10L1 selektivt binder sig til Piwi-interagerende RNA (piRNA) forløber transkriptioner. Vores eCLIP-metode giver mulighed for hurtig bestemmelse af større RNA-arter, der er bundet af forskellige RBPs via mindre sekvensering af subkloner og dermed tilgængelighed af kvalificerede biblioteker, som en arrestordre til at fortsætte med dyb sekvensering. Denne undersøgelse fastsætter et relevant grundlag for eCLIP i pattedyrs testikler.
Mammale testiklerne repræsenterer en fremragende udviklingsmodel, hvor en indviklet Celledifferentiering program kører cyklisk at give talrige spermatozoer. En unik værdi af denne model ligger i fremkomsten af transkriptional inaktivering på visse stadier af spermatogenesen, typisk når meiotisk sex kromosom inaktivering (MSCI) forekommer1,2 og når runde spermatider gennemgår drastisk nuklear komprimering under spermiogenesis3. Disse sammenhængende transkriptionsmæssige hændelser nødvendiggør en regulering efter transkriptional gen, hvor RNA-bindende proteiner (RBPs) spiller en afgørende rolle, idet de danner transkriptomer og bevarer fertiliteten hos hanner.
For at identificere de bona fide-RNA-mål for en individuel RBP in vivo, blev Cross Linking immunopræcipitation (Clip) metodenudviklet til4,5, baseret på, men ud over den regulære RNA immunopræcipitation (RIP)6,7 , ved inkorporering af centrale trin, herunder ultraviolet (UV) Cross Linking, streng vask og gel overførsel for at forbedre signal specificitet. Den avancerede anvendelse af CLIP kombineret med sekvensering med høj gennemløb har vakt stor interesse i profilering af protein-RNA interaktion på genomdækkende niveauer8. Ud over genetiske undersøgelser af RBP-funktion har sådanne biokemiske metoder, der identificerer det direkte samspil mellem endogene proteiner og RNA, været uundværlige for nøjagtigt at belyse de RNA-regulerende roller for RBPs. For eksempel er MOV10L1 en testis-specifik RNA helicase kræves for mandlig fertilitet og Piwi-interagerende RNA (Pirna) Biogenese9. Parallogue MOV10 er kendt som en allestedsnærværende og multifunktionelle RNA helicase med roller i flere aspekter af RNA biologi10,11,12,13,14 , 15 af , 16 ud af , 17 ud af , 18. ved at ansætte den konventionelle Clip-SEQ, vi fandt, at MOV10L1 binder og regulerer primære Pirna prækursorer til at initiere tidlig Pirna behandling19,20, og at MOV10 binder mRNA 3 ‘ utrs og samt Noncoding RNA arter i testikel kimceller (data ikke vist).
Ikke desto mindre, CLIP er oprindeligt en besværlig, radioaktiv procedure efterfulgt af sekvensering bibliotek forberedelse med et bemærkelsesværdigt tab af CLIP Tags. I den konventionelle CLIP, er et cDNA bibliotek forberedt ved hjælp af adaptere ligeret ved begge RNA ekstremiteter. Efter protein fordøjelsen forbliver kryds sammenkædede korte polypeptider knyttet til RNA-fragmenter. Dette kryds bindende mærke delvist blokerer reverse transkriptase (rtase) progression under cDNA syntese, hvilket resulterer i afkortede cdnas, som repræsenterer omkring 80% af cDNA Library21,22. Således er det kun cDNA-fragmenter som følge af RTase, der springer over Cross Linking-stedet (læse-through), der er sekvenseret. For nylig, forskellige CLIP tilgange, såsom PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP og uvCLAP, har været ansat til at identificere crosslink sites af RBPs i levende celler. PAR-CLIP involverer anvendelse af 365 nm UV-stråling og fotoaktivatable nukleotidanalotter og er derfor eksklusivt til in-culturing levende celler, og inkorporering af nukleosid analoler i nysyntetiserede udskrifter er tilbøjelige til at producere bias hvor RNA fysisk interagerer med protein23,24. I iCLIP er det kun en enkelt adapter, der er ligeret til de 3 ‘ ekstremiteter af crosslinked RNA-fragmenter. Efter reverse transkription (RT), er både afkortet og læse-gennem cdnas opnået ved intramolecularly cirkularisering og re-linearisering efterfulgt af polymerase kædereaktion (PCR) amplifikation25,26. Effektiviteten af intramolekylær cirkularisering er dog relativt lav. Selv om ældre CLIP-protokoller har brug for mærkning af crosslinked RNA med en radioisotop, ultraviolet Cross linking og Affinity rensning (uvCLAP), med en proces med streng tandem affinitets rensning, er ikke afhængig af radioaktivitet27. Ikke desto mindre er uvCLAP begrænset til kultiverede celler, der skal transficeret med udtrykket vektor bærer 3x FLAG-HBH tag for tandem affinitet rensning.
I eCLIP blev adaptere ligeret først ved 3 ‘ ekstremiteten af RNA efterfulgt af RT, og derefter ved 3 ‘ ekstremiteterne af cDNAs i en intermolekylær tilstand. Derfor er eCLIP i stand til at indfange alle afkortet og læse-through cDNA28. Også, det er hverken begrænset til radioaktiv mærkning, eller at bruge cellelinjer baseret på dens princip, samtidig med at enkelt-nukleotid opløsning.
Her giver vi en trinvis beskrivelse af en eCLIP-protokol, der er tilpasset musens testikler. Kort, denne eclip protokol starter med UV tværbinding af testikel tubuser, efterfulgt af delvis RNase fordøjelse og immunopræcipitation ved hjælp af et protein-specifikt antistof. Dernæst er det proteinbundne RNA dephosphoryleret, og adapteren er ligeret til dens 3 ‘ ende. Efter protein gel elektroforese og overførsel af gel til membran isoleres RNA ved at skære membran arealet af et forventet størrelsesinterval. Efter RT er DNA-adapteren ligeret til 3 ‘ enden af cDNA efterfulgt af PCR-forstærkning. Screening af subkloner forud for sekventering med høj hastighed tages som en Biblioteks kvalitetskontrol. Denne protokol er effektiv til at identificere de vigtigste arter af protein-bundet RNA af RBPs, eksemplificeret ved de to testis-udtrykker RNA helicases MOV10L1 og MOV10.
Med stigende forståelse af den universelle rolle af rbps under både biologiske og patologiske sammenhænge, er klippet metoder blevet bredt udnyttet til at afsløre den molekylære funktion af rbps20,32,33, 34af35. Den protokol, der beskrives her, repræsenterer en tilpasset anvendelse af eCLIP-metoden til muse testikler.
En udfo…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Eric L Van Nostrand og gene W Yeo for en god vejledning i den oprindelige protokol. K.Z. blev støttet af National Key R & D program i Kina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), og National Natural Science Foundation i Kina (31771653). L.Y. blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (81471502, 31871503) og innovative og iværksætter program af Jiangsu Province.
Antibodies | |||
Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, China | 10370-1-AP | |
Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | provided by P. Jeremy Wang lab(University of Pennsylvania) |
HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
Rabbit IgG | Beyotime, China | A7016 | |
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242R | |
Digital sonifier | BRANSON,USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen,USA | 12321D | |
Mini Blot Module | Invitrogen,USA | B1000 | |
Mini Gel Tank | Invitrogen,USA | A25977 | |
Shaking incubator | Eppendorf, Hamburg, Germany | Thermomixer comfort | |
Tissue Grinder, Dounce | PYREX, USA | 1234F35 | only the "loose" pestle is used in this protocol |
TProfessional standard 96 Gradient | Biometra, Germany | serial no.: 2604323 | |
Tube Revolver | Crystal, USA | serial no.: 3406051 | |
UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
Materials | |||
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
Microtubes tubes | AXYGEN , USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
Reagents | |||
Acid phenol/chloroform/isoamyl alcohol | Solarbio, China | P1011 | 25:24:01 |
AffinityScript Enzyme | Agilent, USA | 600107 | |
Antioxidant | Invitrogen,USA | NP0005 | |
DH5α competent bacteria | Thermo Scientific, USA | 18265017 | these economical cells yield >1 x 106 transformants/µg control DNA per 50 µL reaction. |
DMSO | Sigma-Aldrich, USA | D8418 | |
DNA Ladder | Invitrogen, USA | 10416014 | |
dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
Dynabeads Protein A | Invitrogen, USA | 10002D | |
ECL reagent | Vazyme, China | E411-04 | |
EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | |
EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | add fresh |
Exo-SAP-IT | Affymetrix, USA | 78201 | PCR Product Cleanup Reagent |
FastAP enzyme | Thermo Scientific, USA | EF0652 | |
LDS Sample Buffer | Thermo Scientific, USA | NP0007 | |
MetaPhor Agarose | lonza, Switzerland | 50180 | |
MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | |
MiniElute gel Extraction | QIAGEN, Germany | 28604 | column store at 4 ℃; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14) |
MyONE Silane beads | Thermo Scientific, USA | 37002D | nucleic acids extraction magnetic beads |
NaCl | Invitrogen,USA | AM9759 |
|
NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
NuPAGE Bis-Tris Protein Gels | Invitrogen, USA | NP0336BOX | 4%–12%,1.5 mm, 15-well |
NuPAGE MOPS SDS Buffer Kit | Invitrogen, USA | NP0050 | |
PBS | Gibco, USA | 10010023 | |
Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube | TIANGEN, China | WM5-2302831 | |
PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems, USA | A25742 | |
proteinase K | NEB, New England | P8107S | |
Q5 PCR master mix | NEB, New England | M0492L | |
RLT buffer | QIAGEN, Germany | 79216 | RNA purification lysis buffer |
RNA Clean & Concentrator-5 columns | ZYMO RESEARCH, USA | R1016 | RNA purification and concentration columns |
RNase I | Invitrogen, USA | AM2295 | |
RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
RQ1 DNase | Promega,USA | M610A | |
Sample Reducing Agent | Invitrogen,USA | NP0009 | |
SDS Solution | Invitrogen, USA | 15553027 | 10% |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich, USA | 30970 | protect from light |
T4 PNK enzyme | NEB, New England | M0201L | |
T4 RNA ligase 1 high conc | NEB, New England | M0437M | |
TA/Blunt-Zero Cloning Mix | Vazyme, China | C601-01 | |
TBE | Invitrogen,USA | AM9863 | |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | |
Triton X-100 | Sangon Biotech, China | A600198 | |
Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 | |
Urea | Sigma-Aldrich, USA | U5378 | |
X-ray Films | Caresteam, Canada | 6535876 |