Summary
本研究では、ヒトの神経オルガノイド内のヒト神経オルガノイド内のヒト神経膠芽腫の発達を研究するための関連的かつ正確なモデルとして、2つの特定のヒト神経オルガノイドを導出するプロトコルを紹介し、説明する。三次元オルガノイドを生成する分化。
Abstract
インビトロニューラルモデルの欠如は、神経病理学の医学的進歩に重要な障害である。関連する細胞モデルの確立は、これらの疾患の病理学的メカニズムをよりよく理解し、新しい治療目標と戦略を同定するために重要である。適切にするためには、インビトロモデルは、ヒト疾患の病理学的特徴を再現する必要があります。しかし、神経変性疾患の文脈において、関連するインビトロモデルは、貴重な治療機会として神経細胞置換を提供すべきである。
このようなモデルは、治療分子のスクリーニングを可能にするだけでなく、神経プロトコルの分化を最適化するためにも使用することができます[例えば、パーキンソン病(PD)の移植のコンテキストで]。本研究では、ヒト神経オルガノイド内のヒト神経膠芽腫発達(NO)と2)ニューロンドーパミン作動性(DA)分化の2つのインビトロプロトコルを用いて、3次元(3D)オルガノイドを生成する。この目的のために、ヒト胚性幹細胞(hESC)分化に由来するサイズ校正された神経球の産生を可能にする、十分に標準化されたプロトコルが確立された。最初のモデルは、神経オルガノイド内の神経膠芽腫の発達中に起こる分子および細胞事象を明らかにするために使用することができ、DAオルガノイドはパーキンソン病の細胞治療に適したDAニューロンの適切な供給源を表すだけでなく、薬物検査に使用される。
Introduction
世界保健機関(WHO)は、アストロサイトーマを低等級(II等級)または高等級(グレードIIIおよびIV)に分類します。多形性膠芽腫(GBM)は、天体細胞腫グレードIVであり、原発性脳腫瘍の中で最も致死的であり、現在の治療形態の全ての形態に耐性である1。神経外科、化学療法、放射線療法を含む標準的なケア療法にもかかわらず、GBMは致命的なままであり、15ヶ月の全体的な生存率は過去15年間で劇的に変化していません2。GBM病因の理解を大きく進歩させるためには、関連するモデルの使用が重要です。これまでのところ、GBMの研究は、細胞株、げっ歯類の組織色異性スライス、および患者由来細胞のマウスまたはトランスジェニックマウスへの異種移植に依存しており、自発的腫瘍3,4を発症する。これらのモデルは、脳転移や腫瘍の攻撃性を研究するのに有用であったが、それらは種間の違いによって制限され、結果として生じる結論は誤ってヒト組織に翻訳される可能性がある。さらに、ヒト細胞を有する既存のモデルは、宿主組織/腫瘍相互作用3、4の不在によっても制限される。実験モデルは、基礎科学から治療目標への翻訳に不可欠です。したがって、GBMイニシニング細胞(GIC)と共培養したインビトロヒト神経オルガノイドを産生するプロトコルを記述することは、GBM開発の形態学的および機能的特徴を模倣する関連システムを提供することができる。このシステムは、侵入細胞や壊死領域の拡散移行など、GBM開発の生体内特徴の一部を再現し、腫瘍生物学に関連する遺伝子発現を強調する。以前に明らかにされたように、いくつかの重要なマイクロRNAは、3D神経組織5、6内のGIC開発中に誘導される。
PDは主要な神経変性疾患であり、複数の神経サブタイプ7の変性に関連する。症状の進行性の発症(例えば、ブラジキネシア、非対称休息振戦、剛性および姿勢不安定)が疾患を特徴付けても、その正確な病因は明確に確立されていない。実際、多くの研究は、主要な危険因子が遺伝的要因と環境要因の組み合わせから生じ得る証拠を強調しています。パーキンソン病の症状は、サブスタンシアニグラ(SN)におけるドーパミン作動性ニューロンの両側変性に関連し、線条体8、9に突出するドーパミン作動性(DA)軸の消失につながる。したがって、線条体ドーパミンレベルの低下は、PD患者における運動機能障害の進行と相関する。ドーパミン作動性ニューロンは、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)を含み、アミノ酸L-チロシンをL-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(L-DOPA、ドーパミン前駆体)に変換するカテコールラミン作動性神経伝達物質の合成における重要な酵素である。TH活性の早期喪失に続いてTHタンパク質発現の低下は、PDの特徴である。
本研究では、ヒト神経オルガノイドを用いた2つのプロトコルについて説明し、1つはTH陽性細胞を含む中脳様表現型に特異的に向いている。
Protocol
このプロトコルは、ジュネーブ大学の人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。
1. 未分化ヒト胚性幹細胞(HESC)の維持・培養
- 特定の細胞外マトリックスを使用した調理を事前にコーティングすることにより、フィーダーフリー状態でhSCのメンテナンスと拡張を行います。
- 4°C(典型的な範囲濃度18〜22mg/mL、氷の上に保つ)で細胞外マトリックスの300 μLを解凍し、細胞外マトリックスの早期ゲル化を避けるために15 mLの冷たいDMEM培地と穏やかに混合する。両方のT150フラスコに細胞外マトリックスの7.5 mLを追加します。
- 少なくとも1時間(最大一晩)37 °Cで細胞外マトリックスでコーティングされた皿をインキュベートします。
- 6.5 x 104セル/cm2の密度に培地とシード HESC を取り除きます。
- hESC培地および1%ペニシリン/ストレプトマイシンでH1(hESC細胞株)を維持する。
- 酵素手順で細胞を渡す:37°Cで1-2分の期間にわたってT75 cm2フラスコに酵素溶液の7.5 mLを追加します。細胞が完全に切り離されたら、DMEM-F12の7.5 mLを追加し、300 x gで5分間遠心分離機を追加します。より良い生存を可能にするために、細胞外マトリックスコーティング皿上に所望の密度で細胞を再プレートし、24時間のRho関連タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤(10μM)を含有する同じ培地に。
2. GBM研究のためのhESC由来神経オルガノイド
- 3D培養を開始する24時間前に、hESC培地を10μM ROCK阻害剤で補充した無血清培地に置き換える(両方の成分は、マイクロウェルの凝集段階における細胞生存および自発的な神経球形成をサポートするために必要である)プレート)。細胞は60%の合流度でなければなりません。翌日(0日目)、hESCコロニーを単一細胞として切り離す:培地を除去し、Ca2+/Mg2+なしでPBSですすいで、酵素溶解液の5 mLを加え、37°Cで1-2分間インキュベートする。
- ROCK阻害剤の10μMを含む無血清培地で細胞を集め、300 x gで5分間遠心分離し、上清を取り出し、10μMのROCK阻害剤を補充した無血清培地の10mLで細胞を数える。
- 並行して、マイクロウェルプレートを2mLの無血清培地で5分間1200xgで遠心分離し、神経球形成を防ぐことができます。
- 10 μM ROCK阻害剤を補充した無血清培地の12.5mLで細胞の28.2 x 106を調製する。1000細胞/マイクロウェルを分配します。細胞を300 x gで5分間遠心分離し、一晩37°C(最大36時間)でインキュベーターにプレートを置きます。例えば:30人のヒト神経オルガノイドを得るために、合流の70%-80%(約3000万細胞)で1つのT150フラスコを使用する。
- 翌日(1日目)、球体(P1000付き)を集め、6ウェルプレートに入れます。各ウェルに、B27培地及びDMEM-F12グルタマックス及びニューロベースル培地(1:1で混合)の2mLを添加し、1%のB27サプリメントおよび1%非必須アミノ酸(NEAA)を添加する。速い神経誘導を促進するために、10 μM TGFβ/アクチビン/結節阻害剤および0.5 μM骨形態素タンパク質(BMP)阻害剤で構成される二重SMAD阻害カクテルで培地を補う。このステップから、球は回転(60 rpm、軌道シェーカー)で培養される。回転は、球が一緒に、またはプレートに固執するのを防ぐために重要です。
- 2〜3日ごとに培地を変更する:プレートを曲げ、球が5分間落ちるようにし、培地の半分(2 mL)を取り除き、成長因子と阻害剤を補充した新鮮なB27培地の2 mLを加えます。球体を遠心分離しないでください。
- 次の時間コースに従って神経誘導を実行します。
- 1日目から4日目から、B27培地中の球を培養し、デュアルSMADを補充した。デュアルSMAD阻害カクテル(10 μM TGFβ/アクチビン/ノダル阻害剤および0.5 μM BMP阻害剤)は、神経誘導を促進する。
- 4日目から11日目から、hESC由来の神経ロゼット(球体中)の増殖を促進し、10 ng/mL表皮成長因子(EGF)および10 ng/mL基本線維芽細胞因子(bFGF)をデュアルSMADカクテルを添加したB27培地に添加する。
注:11日目に、ほとんどの細胞はネスチンに対して正の値を示す必要があります。 - 11〜13日目から、0.5μM BMP阻害剤を補充したB27培地中の球を培養する。
- 13-21日目から、B27培地中の球を10ng/mLグリア由来神経栄養因子(GDNF)、10ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)および1μMのγ-セクレクターゼ阻害剤で培養した。GDNFおよびBDNFは神経およびグリア分化を促進する。γ-分泌酵素阻害剤は、より大きな神経成熟を可能にする。
- 21日目には、6ウェルプレート用に設計された培養プレートインサートに堆積した親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜(直径6mm、0.4μm)に球体(約1,000球)をプレートします。この手順から回転を停止します。明視野顕微鏡で観察されたロゼットの存在は、神経分化の開始を示す。神経ロゼットは、PTFE膜上の球をめっきした後2〜3日後に観察することができる。
- 成長因子と阻害剤を補充したB27培地の1 mLを膜インサートの下の各ウェルに加え、2~3日(通常は月曜日、水曜日、金曜日)、次の3週間の分化を行う。
- 21日目から25日目まで、同じ神経成熟培地でヒト神経オルガノイドを培養する(Cf.ステップ2.7.4)。
- 25〜28日目から、B27培地を1μMγ-分泌酵素阻害剤で補体するだけである。
- 28日目から39日目から、γ-セクレクターゼ阻害剤の添加を中止し、B27培地のみでヒト神経オルガノイド培養を継続する。
注:3週間後、神経オルガノイドはGIC移植に使用する準備が整いました。神経成熟に伴い、神経未熟マーカーネスチンの減少と成熟した神経マーカーβ3-チューブリンおよびGFAPの増加が観察された。
3. 神経膠芽腫起細胞(GIC)の単離と培養
- 高品位のヒトGBM生検を断片化してGICを分離する。0.1 mM EDTA(4:1)で0.25%トリプシンを含むビーカーに腫瘍の部分を移し、30〜60分間37°Cでゆっくりと撹拌する(腫瘍サイズに応じて)。
- GIC培地で2,500~5,000個の細胞をGIC培地で2,500~5,000個メッキした75cm2組織培養フラスコに分散細胞をプレート:DMEM/F-12培地(1:1)を含む1%N2、1%B27、および1%G5サプリメント(GIC生存率を有利に)、bFGFおよびEGF(いずれも10)を補充ng/Ml,茎を促進する)およびペニシリン/ストレプトマイシンの1%。
- GIC が確立され、成長したら, GIC 培地から N2 と G5 サプリメントを削除します。.
- オルガノイドに細胞を追加する1日前に、GICを解離し、それらを数えます。
- マイクロウェルプレートを2mLのGIC培地ですすぎ、最大速度で遠心分離して気泡(1000 x g)を除去します。GIC を 1,000 セルに配置し、マイクロウェルごとに 1 つのグリオースフィアを得ます。37 °C(図1C)で一晩インキュベートします。このステップはキーであり、十分に校正されたGICを可能にします(壊死性および特大GICの例は図2A、Cに示されています)。
- GBMの侵入を開始するには、大きなボアピペット先端を持つ神経組織の上に1つの神経膠腫を追加します(図1F)。6ウェルプレートをインキュベーターに慎重に戻します。
4. PD研究のためのhESC由来ドーパミン作動性オルガノイド
- Day 0: 2D 培養中の HESC を最大 60% の合流性 (0 日目) に増幅し、HESC の多能性を維持するために使用される幹細胞培地を血清フリー培地に置き換えます。0.5 μM BMP阻害剤と10μM TGFβ/アクチビン/結節阻害剤(デュアルSMAD阻害カクテル)で培養培地を補って神経誘導を開始し、24時間の10μM ROCK阻害剤を加え、通過時の細胞の生存率を高めます。
- 1日目:0.5μM BMP阻害剤、10μM TGFβ/アクチビン/ノダル阻害剤、および10μM ROCK阻害剤を補充した無血清培地のウェル当たり2.5mLのマイクロウェルプレートを調製する。神経管の腹部パターンに向かって細胞を指定するには、100 ng/mLソニックヘッジホッグ(SHH)、100 ng/mL線維芽細胞増殖因子8(FGF8)、および2 μM平滑化アゴニストを追加する。マイクロウェルから気泡を取り除くために、プレートを1200 x gで5分間遠心分離します。
- 2Dで神経誘導の1日後に、培地を取り除き、Ca2+/MgCl2+なしでPBSで素早く洗浄する。T75 cm2フラスコに組換え酵素溶液の7.5 mLを添加することにより、単細胞懸濁液中のコロニーを解離する。37 °Cで2分間インキュベートし、DMEM-F12の7.5 mLで完了します。
- 細胞懸濁液と遠心分離機を300 x gで5分間回収し、上清を取り出し、マイクロウェルプレートを調調理するために使用するのと同じ培地の細胞を数えます。
- 培地量を調整して、マイクロウェルあたり1000個の細胞を含む神経球を形成することを可能にする細胞懸濁液を得る(例えば、ここで使用されるマイクロウェルプレートには、ウェルあたり4,700マイクロウェルが含まれている)。そこで、2.5mLの培地に470万個の細胞を用意し、プレートに既に配置された培地の前の2.5mLに加えます。
- 各マイクロウェルに細胞を正しく分配するために、プレートをゆっくりと振り、マイクロウェルプレート300×gを5分間遠心分離し、37°Cで24時間インキュベートして球体を生成する。
- 2日目:マイクロウェルを培地でゆっくりと洗い流し、回収してから、組織処理された6ウェルプレートで球を移します。1% B27、1x NEAA、2 mM L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシンの1%を補充したニューロベースル培地で培地を置き換えます。さらに、局所化因子SHH、FGF8、平滑化アゴニスト、および二重SMAD阻害小分子を追加する。
- 球体を37°C(60rpm、軌道シェーカー)で回転させ、2~3日ごとに新たに補充した半分の中程度を変更します。
- 3日目:神経誘導を増強し、中脳同一性を有する神経前駆体に変換するには、Wnt/β-カテニン経路を活性化する3 μM GSK-3β阻害剤で培地を補う。GSK-3β阻害剤を13日目まで培地に保持する。2つの新しい組織処理された6ウェルプレートに分割して、ウェルあたりの球密度を低減し、球体凝集を回避します。
注:8日目には、ほとんどのセルがネスチンに対して正の値を示す必要があります。 - 8日目:局所的成熟を開始する:局所化因子SHH、FGF8、滑らかなアゴニスト、およびデュアルSMAD阻害カクテルを0.5mMジブティリルcAMP(成熟を優先する)、ヒストンデアセチラーゼの20 nM阻害剤(細胞周期出口用)、μM γ-分泌酵素を置き換える阻害因子および成長因子は、10 ng/mL GDNF、10 ng/mL BDNF、1ng/mL形質転換増殖因子β3(TGFβ3)、および5ng/mL FGF20(いずれもDA前駆子生存を好む)である。2~3日ごとにメディアを変更します。
- 21日目:神経オルガノイドを生成する:PTFE膜上の空気液体界面条件下で約100個の神経球を種子(直径6mm)。培養板インサート(0.4mm)に膜を移し、前述のように神経球分化に使用する神経成熟培地の1.2 mLを追加する。
- この手順から回転を停止します。必要な分化の時点が達成されるまで、2~3日ごとに培地を変更します。
注:神経成熟に関しては、神経未熟マーカーネスチンの減少および成熟した神経マーカーβ3-チューブリンおよびGFAPの増加が観察された。高TH及びNURR1発式を観察し(図3C)し、神経オルガノイド成熟度11を確認した。
- この手順から回転を停止します。必要な分化の時点が達成されるまで、2~3日ごとに培地を変更します。
5. ドーパミン作動性分化の検証のためのTHおよびNurr1遺伝子発現の定量
- RNA抽出:分化の示された日に、350 μLのRLTバッファー(RNA抽出キットで提供される)を用いた40の神経球を2-メルカプトエタノールの3.5μLで補充した。製造元の指示に従ってRNA抽出キットを使用して、ライズされた神経球からRNAを抽出します。
- 総RNA濃度を定量する。
- 定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)のための逆転写キットを用いて全RNA抽出の300ngの逆転写を行い、製造業者の指示に従う。
- 非対称シアニン色素検出に基づいて、リアルタイムPCR検出システムでqPCR分析を実行します。グリセラルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)および伸長因子1-α(EF1)のデータをハウスキーピング遺伝子で正規化します。プライマーのシーケンスについては、表1に示します。
6. 高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)検出
- 高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)を電気化学的検出で使用してドーパミンの存在を検出します。ドーパミンを0.1N過塩素酸(HClO4)の100mLで100mLでライシングして抽出し、5分毎に活発な渦を用いて4°Cで15分間抽出した。遠心分離後、ドーパミン投与量のために-20°Cで上清を収集し、保存します。
- C-18カラム(5 μm、4.6 mm x 150 mm)を使用して、アイソクラティックモードの逆相 HPLC によって分析物を 1 mL/分の流量で分離します。ドーパミンの検出は、+200 mVの可能性に設定されたコンディショニングセルを持つクーロメトリック検出器を使用して行われるべきである。
7. マイクロエレクトロデアレイ(MEA)プラットフォームによる生データ記録
- 解剖顕微鏡を使用して、神経球を多孔質MEA装置の中心に移します。
- 電気生理学的記録には、アンプとデータ集録システムを使用します。信号対雑音比(SNR)を5分の記録時の電圧の標準偏差として測定し、同じ5分の期間に記録されたスパイクの平均ピークツーピーク電圧として信号を使用します。
Representative Results
このプロトコルの重要な手順は、適切に識別され、適切に処理される必要があります。したがって、各ステップのタイムラプスを示す培養条件の図と、分化プロトコルに使用される化合物を図1Aおよび図3Aに示すNOプラスGBMおよびDA神経オルガノイドについて、それぞれ図1Aと図3Aに示す。図1B,C,D,E,Fは細胞、球、およびNOを示し、各ステップの典型的な形態を示す。図1G,H,いくつかの神経マーカーを用いて免疫蛍光染色を示す。
図 1: ヒト神経オルガノイド(NO)差別化プロトコル。(A) ヒト胚性幹細胞(hESC)に由来するNOの生成に関する標準化プロトコル。(B) hESCは、hESC培地における細胞外マトリックス上に維持される。(C)マイクロウェルプレートを用い、較正された神経球を生成した。2週間で、神経球をPTFE膜を含むインサート上にめっきした(スケールバー=50μm)。(D) 6ウェルプレートの1つの井戸に挿入するNOのマクロ的なビュー。最初の日の間に、ロゼット(黒い矢印)が観察された(E)。(F) 上部の NO プラス GIC 球のマクロ図。(G-I)NOプラスGIC球の免疫蛍光分析(EGFR陽性;スケールバー= 50 μm)(G)とNO単独で、神経マーカーβIII-チューブリンに対する免疫反応性を示し、ネスチンに対してわずかに陽性であった。しかし、シナプシン1は弱いシグナル(H,I)を示した(スケールバー=それぞれ100μmおよび50μm)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:壊死球と未熟なNOのイラスト。神経球(A)およびNO(B)は、ウェルまたは特大(C)(スケールバー=10 μm)であまりにも多い場合に壊死を受ける可能性があります。(D) トマトレポーターに感染した1つのGICは、NO、スケールバー、10μmの腫瘍細胞の侵入を追跡するのに役立ち、神経管(E)および神経管を持たない未熟なNOの例(F)(スケールバー=50μm)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: DA神経オルガノイドの生成のための標準化されたプロトコル電気生理学的および形態学的分析。(A) DA神経オルガノイドの生成のための標準化されたプロトコル。(B) DA神経オルガノイドの免疫蛍光分析;TH-免疫反応細胞は、Nurr1を共発現し、中脳特異的マーカー(スケールバー=50μm)を発現する。データは平均±SEM(n=3)として表される。(C)グラフは、qRT-PCRによって評価されたTHおよびNurr1遺伝子発現の運動学を表す。(D)代表HPLC:ドーパミンピーク(矢印)は、DA神経オルガノイドリザートからHPLCにより検出された。(E) MEA プラットフォームで記録された生データの例。各スパイクは垂直線(タイムスタンプ)で表示されますが、残りのトレースはノイズです。(F) MEAに堆積した神経球を表す図。(G) 生データから検出された一般的なスパイク(青と赤の曲線)の重ね合わせ。黒い太字の曲線は、対応する赤い曲線の平均を示します。(H) 検出された各スパイクに関連付けられたタイム スタンプを示すラスター プロット。異なる色は異なった電極を強調する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子 | フォワード | 逆 |
| ヌル1 | グクトガアグキャットクツ | GTGAGGTCCATTAAACTTGACA |
| 番目 | GCACCTTCGCAGTTCT | CCCGAACTCCCCGTGAA |
| EEF1 | アッカアアアッガッカッカアッカアッチャッ | GCCTGGGGGGTTCagga |
| ギャップド | ガカアガガガアック | アグガガットカGTGTGT |
表 1: このプロトコルで使用されるプライマー。
Discussion
このプロトコルの最も重要な側面の1つは、細胞培養中のhESC多能性の維持と球および神経オルガノイド形態の密接なモニタリングを含む。hESCは非常に敏感であり、すべての操作は、細胞死と同様、早期制御されていない分化につながる可能性があります。実験の再現性を高め、異常な核型事象の発生を避けるために、染色体安定性の検証後、最も低い通路でHESCのいくつかのバッチを凍結保存することをお勧めします。また、実験ごとに新しいバイアルを解凍し、毎日細胞の挙動を確認することをお勧めします。球が異常に大きいサイズで屈折が少ない場合、それらは凝集し始め、死に始める可能性が高い。
このシステムの1つの改善は、灌流または血管化システムの実装(内皮細胞を追加することによって、または3D流体マイクロチップ内)12、13である。しかし、神経オルガノイド(≤300 μm)の厚さを制御することで、酸素や栄養の効率的な受動的な灌流を可能にし、壊死を防ぎます。もう一つの改善は、免疫細胞(ミクログリア)の導入である。これらの制限を念頭に置いて、神経オルガノイドとGICシステムは、いくつかの理由で関連するツールでありうる。まず、このシステムは、治療化合物がオルガノイドまたは腫瘍細胞にどのように影響するかを監視する薬物スクリーニングを可能にする。第二に、細胞間相互作用を研究することができ、個人および集団の侵略の根底にある微小環境決定要因を可視化し、5、6、13を探索することができる。
パーキンソン病の文脈では、DAニューロンに濃縮された神経オルガノイドは、疾患の発症を研究するために関連する正確な3Dモデルを表すことができます。以前の研究では、DAニューロンに向かって分化したパーキンソン病患者由来の多能性幹細胞が、影響を受けるニューロンサブタイプの研究に使用されている。なお、α-シヌクレインの蓄積や酸化ストレスに対する感受性などの疾患関連表現型が14,15に観察されている。また、神経オルガノイドは、治療分子をスクリーニングするツールとして用いてもよい。しかし, ドーパミン産生や電気生理学的活性などの DA ニューロンの生存と機能性を評価するために、特定の関連する読み出しを設定する必要があります。.全体として、このプロトコルは、神経オルガノイドを生成するために2つの標準化された正確な幹細胞ベースのアプローチを提供します。
Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、ラ・リーグ・ジェネボワス・コントル・ル・ガン(ジュネーブ、スイス)、ISREC財団(ローザンヌ、スイス)、クレイトン研究財団(米国ヒューストン、テキサス州)に対する財政支援に感謝しています。さらに、著者はHES-HOとワイスセンターの財政支援に感謝しています。クラウスの研究室で有益なディスカッションとサポートを提供してくださったことに感謝し、ハラ・クタッシュ博士の校正に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
| ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
| Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
| Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
| Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
| Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
| Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
| Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
| B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
| CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
| Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
| Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
| Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
| Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
| EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
| Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
| fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
| G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
| Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
| Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
| LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
| L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
| Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
| Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
| Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
| MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
| N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
| Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
| Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
| Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
| Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
| Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
| Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
| PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
| Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
| Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
| RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
| SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
| Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
| StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
| Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
| T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
| TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
| Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
| Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
| TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
| Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
| W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
| X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |
References
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