Summary
מחקר זה מציג ומתאר פרוטוקולים לגזור שני מסוימים נוירונואידים אנושיים האדם כמודל רלוונטי ומדויק עבור לימוד 1) התפתחות האדם הגלינובלסטומה בתוך אורגנואידים האדם באופן בלעדי בבני אדם ו 2) תא העצב הדואמיאנרגיות בידול היוצר אורגאיד תלת מימדי.
Abstract
העדר רלוונטי מודלים עצביים מחוץ למוח הוא מכשול חשוב על התקדמות רפואית עבור נוירופתוגיות. הקמת מודלים סלולריים רלוונטיים היא חיונית כדי להבין טוב יותר את המנגנונים הפתולוגיים של מחלות אלה ולזהות מטרות טיפוליות חדשות ואסטרטגיות. כדי להיות רלוונטי, מודל בלתי מתורבת חייב לשכפל את התכונות הפתולוגיים של מחלה אנושית. עם זאת, בהקשר של מחלת ניווניות, מודל רלוונטי בתחום החוץ צריך לספק החלפת תא עצבית כהזדמנות טיפולית רבת ערך.
מודל כזה לא רק לאפשר הקרנה של מולקולות טיפוליות, אלא גם יכול לשמש כדי לייעל את הפרוטוקול העצבי בידול [למשל, בהקשר של השתלת מחלת פרקינסון (PD)]. מחקר זה מתאר שניים בפרוטוקולים מחוץ לתחום של 1) התפתחות האדם gliנובלסטומה בתוך האדם העצבי האנושי (לא) ו 2) תא העצב בידול (DA) מחולל תלת מימדי (3D) אורגאיד. למטרה זו, פרוטוקול מתוקננת היטב הוקמה המאפשר ייצור של מכויל גודל כדורי נוירודורים נגזר תא גזע האדם העובריים (hESC) בידול. המודל הראשון ניתן להשתמש כדי לחשוף אירועים מולקולריים וסלולריים המתרחשים במהלך פיתוח gliנובלסטומה בתוך אורגאיד עצבי, בעוד ה-DA אורגאיד לא רק מייצגת מקור מתאים של נוירונים da לטיפול בתאי במחלת פרקינסון, אבל גם יכול ל ישמש. לבדיקת סמים
Introduction
ארגון הבריאות העולמי (מי) מסווג astrocytomas כציון נמוך (כיתה I II) או בדרגה גבוהה (כיתה III ו IV). Gliנובלסטומה מרובה (GBM) הוא כיתה אסטרוציטומה הקטלנית ביותר של גידולים במוח העיקרי, כי הוא עמיד בכל הצורות הנוכחיות של טיפולים1. למרות הטיפול הסטנדרטי כולל נוירוכירורגיה, כימותרפיה, הקרנות, GBM נשאר קטלני ואת שיעור ההישרדות של 15 חודשים לא השתנה באופן דרמטי על העבר 15 שנים2. כדי לבצע התקדמות משמעותית בהבנת הפתוגנזה GBM, השימוש במודלים רלוונטיים הוא המפתח. עד כה, המחקר של GBM יש להסתמך על קווי התאים, מכרסמים אורגנותic פרוסות, ו xenotransplantation שתלת של תאים נגזר החולה לתוך עכברים או עכברים טרנסגניים לפתח גידולים ספונטניים3,4. למרות מודלים אלה היו שימושיים כדי ללמוד גרורות במוח ותוקפנות הגידול, הם מוגבלים על ידי הבדלים בין מינים, ומסקנות הנובעות עשוי להיות מתורגם באופן שגוי לרקמות האדם. יתר על כן, הדגמים הקיימים עם תאים אנושיים מוגבלים גם על ידי היעדר של המחשב המארח/אינטראקציות הסרטן3,4. מודלים ניסיוניים הם קריטיים לתרגום מהמדע הבסיסי למטרות טיפוליות. לכן, המתאר פרוטוקול לייצר מתורבת האנושי מבחנה אורגנואידים משותף עם תאים GBM-ייזום (GICs) יכול לספק מערכת רלוונטית המחקה תכונות מורפולוגיים ופונקציונלי של פיתוח GBM. מערכת זו מתרבה כמה תכונות vivo של פיתוח GBM כגון הגירה מפוזר של הפולשים תאים ושטחים נמק, וזה מדגיש ביטוי גנים רלוונטי לביולוגיה הגידול. כפי שנחשף בעבר, כמה מיקרו-nas קריטיים המושרה במהלך התפתחות כולינרגיות בתוך רקמת העצבים 3d5,6.
PD היא הפרעה ניווניות העיקריים הקשורים הניוון של מספר תת עצבי מרובים7. גם אם התפרצות מתקדמת של סימפטומים (למשל, באופן איטי, רעד מנוחה אסימטרי, קשיחות ויציבות יציבה) מאפיין את המחלה, האטיולוגיה המדויק שלה אינו מבוסס בבירור. אכן, מחקרים רבים הדגישו ראיות כי גורמי סיכון עיקריים יכולים לנבוע משילוב של גורמים גנטיים וסביבתיים. סימפטומים parkinsonian משויכים הניוון הדו של הנוירונים הדואמינרגיים בחומר הסיבי (SN), המוביל להיעלמות של דואמנרכולינרגיות (DA) מקרין לסטריאטום8,9. לכן, הפחתת הרמות של הסטרידופאמין הוא מתואם עם ההתקדמות של תפקוד מנועי בחולים PD. הנוירונים מכילים טירולי הידרוקסילאז (TH), אנזים מפתח בסינתזה של catecholaminergic נוירוטרנסמיטורים הממיר את חומצת האמינו L-טירוצין ל-L-3, 4-דיהידרוטסטוסטרון (L-דופה, מבשר דופמין) כדי דופמין10. אובדן מוקדם של הפעילות ואחריו ירידה בביטוי החלבון תאנון הוא סימן ההיכר של המשטרה.
מחקר זה מתאר שני פרוטוקולים באמצעות אורגנואידים עצביים אנושיים, עם אחד מונחה במיוחד לקראת המוח באמצע כמו פניטיפ מועשר עם תאים TH-חיוביים.
Protocol
פרוטוקול זה מלווה בהנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי באוניברסיטת ז'נבה.
1. תחזוקה ותרבות של מובחן בתאי גזע עובריים האדם (hESCs)
- בצע תחזוקה והרחבה של hSECs בתנאים ללא מאכיל על ידי מנות ציפוי מראש עם מטריצה מסוימת.
- הפשרת 300 μL של מטריצה החילוץ ב 4 ° צ' (ריכוז טווח אופייני 18-22 mg/mL, לשמור על קרח) ולערבב בעדינות עם 15 מ ל של מדיום קר DMEM כדי למנוע הגגנציה מוקדמת של מטריצה החילוץ. הוסף 7.5 מ ל של מT150 מתוך החילוץ לשני מבחנות שניהם.
- מכסימום הצלחות מצופות במטריצה ב37 מעלות צלזיוס לפחות 1 h (מקסימום לילה).
- הסר את המדיום ואת הזרע hESCs לצפיפות של 6.5 x 104 תא/cm2.
- שמור על H1 (קו התאים של hESC) ב hESC בינונית ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
- להעביר את התאים עם הליך אנזימטי: להוסיף 7.5 mL של פתרון אנזימטי T75 ס מ2 בקבוקון על פני תקופה של 1-2 דקות ב 37 ° c. לאחר תאים מנותקים לחלוטין, להוסיף 7.5 mL של Dמאמ-F12 ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g. כדי לאפשר הישרדות טובה יותר, לוחית מחדש התאים בצפיפות הרצויה על מנות מצופה מטריקס מגולוון, באותו בינוני המכיל את החומר המקושר Rho-חלבון קינאז (10 μM) עבור 24 שעות.
2. המיסק-מאורגנואידים ללימודי GBM
- 24 שעות לפני תחילת התרבות 3D, להחליף את המדיום hESC עם מדיום ללא סרום שיושלם עם 10 μM סלע מעכבי (שני הרכיבים נחוצים כדי לתמוך הישרדות התאים והיווצרות נוירוספירה ספונטנית בשלב הצבירה במיקרוגל צלחת). התאים אמורים להיות. ב60% בשטף למחרת (יום 0), ניתוק מושבות hESC כתאים בודדים: להסיר את המדיום, ולאחר מכן לשטוף עם PBS ללא Ca2 +/Mg2 +, להוסיף 5 מ ל של פתרון הפירוק אנזימטי, ו-דגירה ב 37 ° c עבור 1-2 דקות.
- לאסוף את התאים בינונית ללא סרום עם 10 μM של סלע מעכב ו צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות. להסיר את supernatant ולספור את התאים ב 10 מ ל של מדיום ללא סרום שיושלם עם 10 ΜM של סלע מעכב.
- במקביל, לשטוף את צלחת המיקרוגל עם 2 מ ל של מדיום ללא סרום לבאר ו צנטריפוגה את הצלחת ב 1200 x g עבור 5 דקות כדי להסיר את כל הבועות, אשר יכול למנוע היווצרות נוירוספירה.
- להכין 28.2 x 106 של תאים ב 12.5 מ ל של סרום-מדיום חינם שיושלם עם 10 ΜM סלע מעכב. לוותר 1000 תאים/למיקרוגל. צנטריפוגה את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות ומניחים את הצלחת בחממה ב 37 ° c לילה (מקסימום 36 h). לדוגמה: כדי להשיג 30 מעצבי גוף אנושיים, השתמש בבקבוקון T150 אחד ב-70%-80% ממפגש הזרימה (כ-30,000,000 תאים).
- למחרת (יום 1), לאסוף את הספירות (עם P1000) ולמקם אותם בצלחת 6 היטב. בכל טוב, להוסיף 2 מ ל של B27 בינונית ו DMEM-F12 GlutaMAX ו Neurobasal סיס בינונית (לערבב ב 1:1), שיושלם עם 1% תוספי תזונה ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA). כדי לקדם אינדוקציה עצבית מהירה, הוסף את המדיום עם קוקטייל כפול SMAD עיכוב, מורכב 10 μM TGFβ/מעכב פעילות/Nodal מעכבי ו-0.5 μM עצם מורפולגניים חלבון (BMP) מעכב. משלב זה קדימה, התחומים הם מתורבתים בסיבוב (60 rpm, שייקר מסלולית). הסיבוב הוא קריטי כדי למנוע את הכדורים לדבוק יחד או לצלחת.
- לשנות את המדיום כל 2-3 ימים: לכופף את הצלחת ולתת את הספירות ליפול 5 דקות, להסיר מחצית המדיום (2 מ ל), ולהוסיף 2 מ ל B27 בינוני טרי בתוספת גורמי צמיחה מעכבי. . אל צנטריפוגה את הספירות
- ביצוע האינדוקציה העצבית לפי קורס הזמן הבא:
- החל מימים 1-4, התרבות הספירות במדיום B27 בתוספת כפול SMAD. קוקטייל כפול SMAD עיכוב (10 μM TGFβ/פעילות מעכב Nodal ו-0.5 μM מעכב BMP) לקדם את האינדוקציה העצבית.
- החל מימים 4-11, לקדם התפשטות של רוזטות-נגזר מטות העצבים (לתוך התחומים), על ידי הוספת 10 ng/ml מקדם גידול באפידרמיס (egf) ו 10 ng/ml בסיסי מקדם הפיצוץ (bfgf) כדי בינונית B27 בתוספת עם קוקטייל dual-smad.
הערה: ביום 11, רוב התאים צריכים להיות חיוביים עבור Nestin. - מימים 11-13, תרבות הספירות בינונית B27 עם 0.5 מעכבי μM BMP.
- החל מימים 13-21, תרבות התחומים ב B27 בינוני בתוספת 10 ng/ml גליה נגזר neurotrophic פקטור (gdnf), 10 ng/ml המוח נגזר neurotrophic פקטור (bdnf) ו-1 μm של γ-הפרשה המדכא. GDNF ו-BDNF לקדם בידול עצבי וגליאל. מעכבי הγ-הסוד. מאפשרים התבגרות עצבית גדולה יותר
- ביום 21, צלחת התחומים (כ 1,000 כדורים) על קרום polyphilic הידרופילי (בקוטר 6 מ"מ, 0.4 μm) הופקד על לוחית התרבות הוספה שתוכננה עבור 6 היטב צלחת. הפסק סיבוב משלב זה. הנוכחות של rosettes, שנצפו עם מיקרוסקופ שדה בהיר, מצביעים על החניכה של בידול עצבי. רוזטות הנוירוטות עצביים ניתן לצפות 2-3 ימים לאחר הציפוי בספירות על קרום מצופפי.
- הוסף 1 מ ל של B27 בינוני בתוספת גורמי צמיחה מעכבי (כדלקמן) לכל טוב מתחת להוסיף קרום, כל 2-3 ימים (בדרך כלל ביום שני, רביעי ושישי), עבור שלושה שבועות הבאים של בידול.
- מימים 21-25, מטפחים אורגנואידים עצביים אנושיים באותה בינונית התבגרות עצבית (Cf. שלב 2.7.4).
- מימים 25-28, רק משלימים B27 בינונית עם 1 μM γ-הפרשה המעכב.
- החל מימים 28-39, הפסק להוסיף את המעכב הγ-הסודי והמשך בתרבות האנושית העצבית בB27 בינונית בלבד.
הערה: לאחר 3 שבועות, האורגנואידים העצביים מוכנים לשימוש עבור השרשה הכולינרגיות. לאורך ההבשלה העצבית, ירידה של הסמן העצבי בלתי בוגר Nestin ועלייה של סמנים עצביים בוגרת β3-טובולין ו GFAP נצפו.
3. בידוד וטיפוח של תאים גלינובלסטומה (GICs)
- לבודד GICs על ידי מפרגיית ביופסיה של האדם בדרגה גבוהה. להעביר את פיסת הגידול בגביע המכיל 0.25% טריפסין ב 0.1 mM EDTA (4:1) ו לאט מערבבים ב 37 ° צ' עבור 30-60 דקות (בהתאם לגודל הגידול).
- צלחת התאים המונתק ב 75 ס מ2 התרבות רקמה מבחנות מצופה בתאים 2500-5000 לכל ס מ בינוני כולינרגיות: dmem/F-12 בינוני (1:1) המכיל 1% N2, 1% B27, ו 1% 5 תוספי מזון (לטובת הישרדות כולינרגיות), שיושלם עם BFGF ו egf (שניהם ng/Ml, כדי לקדם שקידיות ו-1% של פניצילין/סטרפטומיצין.
- ברגע שהכולינרגיות היא מבוססת היטב וגוברת, להסיר את N2 ואת התוספים הראשונה של מדיום כולינרגיות.
- יום אחד לפני הוספת התאים על האורגאיד, הנתק את ה-GICs וספור אותם.
- לשטוף את צלחת המיקרוגל עם 2 מ ל של בינוני כולינרגיות ו צנטריפוגה את הצלחת במהירות המקסימלית כדי להסיר בועות (1000 x g). מניחים את GICs ב 1,000 תאים כדי לקבל אחד gliomasphere למיקרוגל. מודטה לילה ב 37 ° צ' (איור 1C). שלב זה הוא המפתח ומאפשר GICs מכויל היטב (דוגמה של נקרוטיק ומעל GICs בגודל מעל מוצג באיור 2A,C).
- כדי ליזום הפלישה GBM, להוסיף gliomasphere אחד על גבי הרקמה העצבית עם טיפ גדול נשא pipet (איור 1F). מניחים בזהירות את 6 הצלחת בחזרה בחממה.
4. המיסק-מארגני הדואידים ללימודי משטרה
- יום 0: להגביר hESCs בתרבות 2D עד 60% שליטה (יום 0), ולאחר מכן להחליף מדיה תא גזע המשמש לשמירה על תכונות העוצמה של hESCs עם מדיום ללא סרום. התחל אינדוקציה עצבית על ידי להשלים את התרבות בינונית עם 0.5 μM BMP מעכבי ו 10 μM TGFβ/מעכב הפעלה/Nodal (קוקטייל כפול SMAD עיכוב), ולאחר מכן להוסיף 10 μM סלע מעכבי עבור 24 שעות כדי להגדיל את שיעור ההישרדות של תאים במהלך המעבר.
- יום 1: להכין את הצלחת המיקרוגל עם 2.5 mL לכל טוב של מדיום ללא סרום שיושלם עם 0.5 מעכב μM BMP, 10 μM TGFβ/פעילות מעכב Nodal, ו 10 μM סלע מעכב. כדי לציין את התאים לכיוון הדפוס הגחוני של הצינור העצבי, להוסיף 100 ng/mL סוניק קיפוד (ששש), 100 ng/mL פיברוהפיצוץ גורם הצמיחה 8 (FGF8), ו 2 μM smoothened agonist. צנטריפוגה את הצלחת (רק עם בינונית ובלי תאים) ב 1200 x g עבור 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר מן המיקרוגל.
- לאחר יום 1 של האינדוקציה העצבית ב-2D, להסיר את המדיום ולשטוף במהירות עם PBS ללא Ca2 +/mgcl2 +. הנתק את המושבות בתאים בודדים ההשעיה על ידי הוספת 7.5 mL של הפתרון רקומביננטי אנזימטי T75 ס מ2 בקבוקון. מודטה עבור 2 דקות ב 37 ° c ולאחר מכן להשלים עם 7.5 mL של dמאמ-F12.
- לאסוף את ההשעיה התא ואת צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות. להסיר את supernatant ולספור את התאים באותו מדיום המשמש להכנת צלחת המיקרוגל.
- כוונן את אמצעי האחסון הבינוני כדי לקבל השעיית תא המאפשר ליצור כדורי נוירולומטר המכילים 1000 תאים למיקרוגל (לדוגמה, לוח המיקרוגל המשמש כאן מכיל 4,700 למיקרוגל בצורה טובה). So, להכין 4,700,000 תאים ב 2.5 mL של בינוני ולהוסיף אותו הקודם 2.5 mL של בינונית כבר ממוקם בלוח.
- כדי להפיץ כראוי את התאים בכל המיקרוגל, לנענע בעדינות את הצלחת, ולצנטריפוגה את צלחת המיקרוגל 300 x g עבור 5 דקות. הצלחת ב 37 ° c עבור 24 שעות כדי ליצור כדורים.
- יום 2: לשטוף בעדינות את המיקרוגל עם המדיום ולאסוף ואז להעביר את הספירות בצלחת שש-באר שטופלו ברקמה. החלף את המדיום עם בינונית Neurobasal סיס שיושלם עם 1% B27, 1x NEAA, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 1% של פניצילין/סטרפטומיצין. בנוסף, להוסיף מרכיבי הרגליזציה ששש, FGF8, smoothened agonist, ו-dual-SMAD עיכוב מולקולות קטנות.
- המקום כדורים בסיבוב ב 37 ° צ' (60 rpm, שייקר מסלולית) ולשנות חצי בינוני טרי בתוספת כל 2-3 ימים.
- יום 3: כדי לשפר את האינדוקציה העצבית להמיר ושלתי עצביים עם זהות מוחית בינונית, מוסף את המדיום עם 3 μM GSK-3β מעכב, אשר מפעיל את Wnt/β-catenin המסלול. לשמור על מעכבי GSK-3β במדיום עד יום 13. פיצול לשתי רקמה חדשה מטופלים 6 לוחות טוב כדי להפחית גם צפיפות הספירה למנוע צבירת כדור.
הערה: ביום 8, רוב התאים צריכים להיות חיוביים עבור Nestin. - יום 8: להתחיל את ההבשלה העצבית: להחליף את גורמי הרגליזציה שששש, FGF8, smoothened אגוניסט, ו-dual-SMAD הקוקטייל מעכבות עם 0.5 מ"מ מחנה diבוטיטור (כדי לזכות בהבשלה), 20 מעכב nM של de מחזור תא היציאה), 1 μM γ-הפרשה מעכב וגורמי גדילה, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL BDNF, 1 ng/mL שינוי גורם הצמיחה β3 (TGFβ3), ו-5 ng/mL FGF20 (הן טובת הישרדות הקדמון DA). לשנות את המדיום כל 2-3 ימים.
- יום 21: ליצור את האורגאיד העצבי: הזרע סביב 100 נוירוספירות מתחת לתנאי ממשק נוזלי האוויר על ממברדת (בקוטר 6 מ"מ). העבר את הקרום לתוך לוחית התרבות (0.4 מ"מ) והוסף 1.2 mL של בינונית התבגרות עצבית משמש בידול נוירוספירה כפי שמתואר בעבר.
- הפסק סיבוב משלב זה. שנה את המדיום כל 2-3 ימים עד להשגת נקודת זמן הבידול הנדרשת.
הערה: לגבי התבגרות עצבית, ירידה של סמן בלתי בוגר עצבי Nestin ועלייה של סמנים עצביים בוגרת β3-טובולין ו GFAP נצפו. הביטויים הגבוהים והNURR1 נצפו (איור 3C) ומאשרים את הבגרות האורגאידית העצבית11.
- הפסק סיבוב משלב זה. שנה את המדיום כל 2-3 ימים עד להשגת נקודת זמן הבידול הנדרשת.
5. כימות הביטוי הגנטי ה-TH ו-Nurr1 לאימות של בידול הדואמנררגיות
- RNA החילוץ: על היום המצוין של בידול, lyse 40 נוירוספירות עם 350 μL של מאגר RLT (שסופקו בערכת החילוץ RNA) שיושלם עם 3.5 μL של 2-mercaptoethanol. לחלץ את ה-RNA מתוך כדורי נוירונט באמצעות ערכת הוצאת RNA לאחר הוראות היצרן.
- לכמת הכולל ריכוזי RNA.
- בצע שעתוק הפוכה של 300 ng של החילוץ הכולל RNA באמצעות ערכת תמלול הפוכה לתגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qPCR) ובצע את הוראות היצרן.
- בצע ניתוח qPCR על מערכות זיהוי PCR בזמן אמת, בהתבסס על זיהוי cyanine צבען סימטרי. לנרמל את הנתונים עם גנים של משק הבית: גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (הגנד) וגורם התארכות 1 אלפא (EF1). רצפי התחל מתוארים בטבלה 1.
6. זיהוי כרומטותרפיה בלחץ גבוה
- השתמש כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (בדיקות) עם זיהוי אלקטרוכימי כדי לזהות נוכחות של דופמין. דופמין הופק על ידי לאחר אורגנואידים נוירואידים ב 100 mL של 0.1 N perchloric חומצה (HClO4) עבור 15 דקות ב 4 ° c עם vortexing נמרצת כל 5 דקות. לאחר צנטריפוגה, לאסוף ולאחסן את סופרנטאנט ב-20 ° c עבור מינון דופמין.
- השתמש בעמודת C-18 (5 μm, 4.6 מ"מ x 150 מ"מ) כדי להפריד את האנליטים על-ידי הisocratic-שלב היפוך במצב הזרמה בקצב הזרימה של 1 mL/דקה. זיהוי של דופמין צריך להתבצע באמצעות גלאי קולון עם תא התניה להגדיר בפוטנציאל של + 200 mV.
7. הקלטת נתונים גולמיים עם פלטפורמת מיקרואלקטו (MEA)
- השתמש במיקרוסקופ לנתיחה כדי להעביר נוירוספירות למרכז של התקן הנקבוביות הנקבובי.
- השתמש במגבר ובמערכת רכישת נתונים עבור הקלטות אלקטרופיזיולוגיות. למדוד את היחס אות לרעש (SNR) כמו סטיית התקן של המתח במהלך 5 דקות הקלטה, באמצעות האות כמתח ממוצע שיא לשיא של קוצים שנרשמו באותו 5 תקופות דקות.
Representative Results
השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה חייבים להיות מזוהים היטב ומטופלים כראוי. לכן, דיאגרמה של תנאי התרבות המציין את הזמן לשגות עבור כל שלב, כמו גם תרכובות המשמשות את פרוטוקול הבידול מומחש באיור 1a ואיור 3A עבור לא בתוספת GBM ו-DA אורגנואידים עצביים, בהתאמה. איור 1B, C, D, E, F מדגים את התאים, הספירות ו-NO ומציגים את המבנה האופייני לכל שלב. באיור 1G, H, אני ממחיש כתמים אימונולואורלאונסורעיעם כמה סמנים עצביים.
איור 1 : אורגאיד עצבי אנושי (לא) הליך בידול. (א) פרוטוקול מתוקננת לדור של לא נגזר מתאי גזע עובריים אנושיים (hesc). (ב) hESCs מתוחזקים על מטריצה החילוץ במדיום hesc. (ג) לוחות המיקרוגל שימשו להפקת כדורים נוירווניים מכויל. ב 2 שבועות, כדורים נוירוניים היו מצופים על הכנסת המכילה ממברנה מצודת (סרגל קנה מידה = 50 μm). (ד) מקרוסקופי תצוגה של NO לתוך הכנס בבאר אחת של 6 היטב צלחת. בימים הראשונים נצפו רוטות (חץ שחור) (E). (ו) מקרוסקופי תצוגה של כדור לא בתוספת כולינרגיות על החלק העליון. (G-I) Immunofluorescence ניתוח של הספירה לא בתוספת כולינרגיות (EGFR-חיובית; סרגל בקנה מידה = 50 μm) (G) ולא לבד, אשר הראה פעילות מחודשת החיסונית עבור סמן עצבי βIII-טובולין וקצת חיובי עבור nestin; עם זאת, סינפסין 1 הראה אות חלשה (H, I) (ברים קנה מידה = 100 יקרומטר ו 50 יקרומטר, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : איור של כדורי נקרוטיק ולא בוגר לא. נוירוספירות (A) ו-NO (ב) יכול לעבור נמק כאשר הם רבים מדי בבאר או מנופחים (C) (סרגל קנה מידה = 10 μm). (ד) אחד נגוע בכתב עגבניות לעזור לעקוב אחר הפלישה תא הגידול לא, סרגל בקנה מידה, 10 μm. דוגמה של לא בוגר לא עם צינורות עצביים (E) ולא צינורות עצביים (F) (סרגל קנה מידה = 50 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : פרוטוקול מתוקננת עבור דור של מתקן עצבי DA ואנליזה אלקטרולוגית ומורפולוגית. (A) פרוטוקול מתוקננת עבור הדור של הארגון העצבי DA. (ב) אימונולואונסנציה של ניתוח של התובע העצבי המחוזי; TH-immunoreactive תאים הפעילים ביטוי Nurr1, סמן ספציפי באמצע המוח (סרגל קנה מידה = 50 μm). נתונים מיוצגים כממוצע ± SEM (n = 3). (ג) גרפים מייצגים קינטיקה של ביטוי הגנים ה-TH ו-Nurr1 המוערך על ידי רביעיית-PCR. (ד) מיצג מייצג: שיא דופמין (חץ) זוהה על ידי מאבחן מארגון הנוירואיד העצבי של DA. (ה) דוגמה לנתונים גולמיים שנרשמו עם פלטפורמת MEA. כל יתד מוצג בקו אנכי (חותמות זמן), ואילו המעקב הנותר הוא רעש. (ו) תמונה המייצגת נוירוספירה שהופקדה על ה-MEA. (ז) מיקום של קוצים טיפוסיים (עקומות כחולות ואדומות) שזוהו מהנתונים הגולמיים. העקומה השחורה הנועזת מציינת את ממוצע העקומות האדומות המתאימות. (ח) מגרש רסטר מציג את חותמות הזמן המשויכות לכל דקר שזוהתה. הצבעים השונים מדגישים את האלקטרודות השונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ג'ין | פאולס | פוך |
| Nurr1 | מיכל ברקת | היכל האור |
| תאנון | GCACCTTCGCGCAGTTCT | CCCGAACTCCACCGTGAA |
| EEF1 | מיכל שלמה | מיכל ברקת |
| למעלה | ליאת באגאג | מיכל ברקת |
שולחן 1: התחל בשימוש בפרוטוקול זה.
Discussion
אחד ההיבטים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה כולל את האחזקה של hESC pluripotency במהלך התא culturing וניטור קרוב של התחומים ומורפולוגיה ארגונית עצבית. hESCs רגישים מאוד, וכל מניפולציה יכולה להוביל לבידול מוקדם בלתי מבוקרת, כמו גם למוות בתאים. על מנת להגביר את הנתונים הניסיוניים ולמנוע את ההתרחשות של אירועים קריוטיפ נורמלי, זה מומלץ cryopreserve מספר אצוות של hESCs במעבר הנמוך ביותר לאחר אימות של יציבות כרומוזום שלהם. כמו-כן, מומלץ להפשיר בקבוקון חדש לכל ניסוי ולבדוק את התנהגות התאים מדי יום. אם הספירות הן פחות השבירה עם גודל גבוה חריג, הם עלולים להתחיל לצבור ולמות.
שיפור אחד על גבי מערכת זו הוא הפרזיה או יישום של מערכת ואצלב (על ידי הוספת תאים אנדותל או בתוך שבב תלת-ממדי של פלואידיג)12,13. עם זאת, שליטה על עובי של אורגאיד עצביים (≤ 300 μm) מאפשר זלוף פסיבי יעיל של חמצן ונואויות ומונע נמק. שיפור נוסף הוא המבוא של תאים חיסוניים (microglia). עם מגבלות אלה בראש, אורגנואידים עצביים בתוספת מערכת כולינרגיות עשוי להיות כלי רלוונטי מכמה סיבות. ראשית, מערכת זו מאפשרת סינון סמים כדי לפקח כיצד תרכובת טיפולית עלולה להשפיע על תא אורגנואיד או גידול. שנית, ניתן ללמוד אינטראקציות מתאים לתאים, ומיקרו-סביבתיים מבוססי-הבסיס האישי והקיבוצי יכול להיות דמיינו ולחקור5,6,13.
בהקשר של מחלת פרקינסון, אורגאיד עצבי מועשר בנוירונים DA יכול לייצג מודל 3D רלוונטי ומדויק כדי לחקור את התפתחות המחלה. במחקרים קודמים, החולה של פרקינסון-נגזר המושרה בתאי גזע הבדיל לעבר נוירונים DA שימשו כדי ללמוד את תת-משתמשים עצביים מושפעים. של הערה, כמה פנוטיפים הקשורים למחלות כגון הצטברות של α-synuclein ורגישות למתח חמצוני נצפו14,15. כמו-כן, ניתן להשתמש באורגנואיד העצבי ככלי למסך מולקולות טיפוליות. עם זאת, ניתן להגדיר את הקריאות הספציפיות והרלוונטיות כדי להעריך את ההישרדות והפונקציונליות של התובע המחוזי, כגון ייצור דופמין ופעילות אלקטרופיזיולוגית. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שתי גישות מבוססות תא גזע סטנדרטיות ומדויקות כדי ליצור אורגנואידים עצביים.
Disclosures
המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים תודה לה Ligue Genevoise לסרטן (ז'נבה, שוויץ), ISREC קרן (לוזאן, שוויץ), ואת קרן קלייטון למחקר (יוסטון, TX, ארה ב) לתמיכה כספית. יתר על כן, המחברים מודים הס-הו ו מרכז Wyss לתמיכה כספית. אנו מודים למעבדתו של מעבדת הדיונים והליווי של ד ר ח'אה קוטאיש לצורך הגהה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
| ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
| Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
| Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
| Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
| Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
| Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
| Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
| B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
| CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
| Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
| Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
| Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
| Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
| EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
| Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
| fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
| G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
| Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
| Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
| LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
| L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
| Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
| Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
| Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
| MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
| N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
| Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
| Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
| Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
| Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
| Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
| Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
| PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
| Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
| Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
| RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
| SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
| Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
| StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
| Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
| T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
| TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
| Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
| Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
| TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
| Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
| W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
| X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Daphu, I., et al. In vivo animal models for studying brain metastasis: value and limitations. Clinical and Experimental Metastasis. 30 (5), 695-710 (2013).
- Huszthy, P. C., et al. In vivo models of primary brain tumors: pitfalls and perspectives. Neuro Oncology. 14 (8), 979-993 (2012).
- Nayernia, Z., et al. The relationship between brain tumor cell invasion of engineered neural tissues and in vivo features of glioblastoma. Biomaterials. 34 (33), 8279-8290 (2013).
- Cosset, E., et al. Human tissue engineering allows the identification of active miRNA regulators of glioblastoma aggressiveness. Biomaterials. 107, 74-87 (2016).
- Pringsheim, T., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T. D. The prevalence of Parkinson's's disease: a systematic review and meta-analysis. Movement Disorders. 29 (13), 1583-1590 (2014).
- Rajput, A. H., et al. Globus pallidus dopamine and Parkinson's motor subtypes: clinical and brain biochemical correlation. Neurology. 70 (16 Pt 2), 1403-1410 (2008).
- Jellinger, K. A. Pathology of Parkinson's's disease. Changes other than the nigrostriatal pathway. Molecular and Chemical Neuropathology. 14 (3), 153-197 (1991).
- Bernheimer, H., Birkmayer, W., Hornykiewicz, O., Jellinger, K., Seitelberger, F. Brain dopamine and the syndromes of Parkinson’s and Huntington. Clinical, morphological and neurochemical correlations. Journal of Neurological Science. 20 (4), 415-455 (1973).
- Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells and Development. 23 (13), 1535-1547 (2014).
- Chen, C. S. 3D Biomimetic Cultures: The Next Platform for Cell Biology. Trends in Cell Biology. 26 (11), 798-800 (2016).
- Friedl, P., Sahai, E., Weiss, S., Yamada, K. M.
- Byers, B., et al. SNCA triplication Parkinson's's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress. PLoS ONE. 6 (11), e26159 (2011).
- Flierl, A., et al. Higher vulnerability and stress sensitivity of neuronal precursor cells carrying an alpha-synuclein gene triplication. PLoS ONE. 9 (11), e112413 (2014).
