इस अध्ययन का परिचय और वर्णन प्रोटोकॉल का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक और सटीक मॉडल के रूप में दो विशिष्ट मानव तंत्रिका organoids प्राप्त करने के लिए 1) मानव तंत्रिका organoids के भीतर मानव तंत्रिका organoids विशेष रूप से मनुष्यों में और 2) न्यूरॉन डोपामाइनर्जिक एक त्रि-आयामी अंगाभ उत्पन्न करने वाला विभेदन.
इन विट्रो तंत्रिका मॉडल में प्रासंगिक की कमी neuropathologies के लिए चिकित्सा प्रगति पर एक महत्वपूर्ण बाधा है. प्रासंगिक सेलुलर मॉडल की स्थापना दोनों बेहतर इन रोगों के रोग तंत्र को समझने और नए चिकित्सीय लक्ष्यों और रणनीतियों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रासंगिक होना करने के लिए, एक इन विट्रो मॉडल एक मानव रोग के रोग सुविधाओं को पुन: पेश करना चाहिए. हालांकि, neurodegenerative रोग के संदर्भ में, एक प्रासंगिक इन विट्रो मॉडल एक मूल्यवान चिकित्सीय अवसर के रूप में तंत्रिका कोशिका प्रतिस्थापन प्रदान करना चाहिए.
इस तरह के एक मॉडल न केवल चिकित्सीय अणुओं की स्क्रीनिंग की अनुमति होगी, लेकिन यह भी तंत्रिका प्रोटोकॉल भेदभाव का अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है [उदाहरण के लिए, पार्किंसंस रोग में प्रत्यारोपण के संदर्भ में (पीडी)]. इस अध्ययन के विट्रो प्रोटोकॉल में दो का वर्णन करता है 1) मानव तंत्रिका organoids के भीतर मानव ग्लियोब्लास्टोमा विकास (नहीं) और 2) न्यूरॉन डोपामाइनर्जिक (डीए) एक तीन आयामी पैदा भेदभाव (3 डी) organoid. इस उद्देश्य के लिए, एक अच्छी तरह से मानकीकृत प्रोटोकॉल स्थापित किया गया था कि मानव भ्रूण स्टेम सेल (ESC) भेदभाव से व्युत्पन्न आकार कैलिब्रेटेड neurospheres के उत्पादन की अनुमति देता है. पहले मॉडल आणविक और सेलुलर तंत्रिका organoid के भीतर ग्लियोब्लास्टोमा विकास के दौरान होने वाली घटनाओं को प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि दा organoid न केवल पार्किंसंस रोग में सेल थेरेपी के लिए डीए न्यूरॉन्स का एक उपयुक्त स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन यह भी कर सकते हैं दवा परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा.
विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) कम ग्रेड (ग्रेड मैं द्वितीय से द्वितीय) या उच्च ग्रेड (ग्रेड III और चतुर्थ) के रूप में एस्ट्रोसाइटोमा वर्गीकृत करता है। ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफॉर्म (जीबीएम) एक एस्ट्रोसाइटोमा ग्रेड IV है, जो प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर का सबसे घातक है, जो उपचारकेसभी वर्तमान रूपों 1 के लिए प्रतिरोधी है। न्यूरोसर्जरी, कीमोथेरेपी, और रेडियोथेरेपी सहित मानक देखभाल चिकित्सा के बावजूद, जीबीएम घातक रहता है और 15 महीने के समग्र जीवित रहने की दर नाटकीय रूप से पिछले 15 वर्षों में नहीं बदल ी2। जीबीएम रोगजनन को समझने में महत्वपूर्ण प्रगति करने के लिए, प्रासंगिक मॉडल का उपयोग महत्वपूर्ण है। अब तक, जीबीएम के अध्ययन सेल लाइनों पर भरोसा किया गया है, कृंतक organotypic स्लाइस, और चूहों या ट्रांसजेनिक चूहों में रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं के exotransplantation सहज ट्यूमर विकसित3,4. हालांकि इन मॉडलों मस्तिष्क मेटास्टेसिस और ट्यूमर आक्रामकता का अध्ययन करने के लिए उपयोगी किया गया है, वे प्रजातियों के बीच मतभेद ों द्वारा प्रतिबंधित कर रहे हैं, और जिसके परिणामस्वरूप निष्कर्ष गलत तरीके से मानव ऊतकों के लिए अनुवाद किया जा सकता है. इसके अलावा, मानव कोशिकाओं के साथ मौजूदा मॉडल भीमेजबान ऊतक की अनुपस्थिति से सीमित हैं / प्रायोगिक मॉडल बुनियादी विज्ञान से चिकित्सीय लक्ष्यों के लिए अनुवाद के लिए महत्वपूर्ण हैं. इसलिए, इन विट्रो मानव तंत्रिका organoids में उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन सह जीबीएम शुरू कोशिकाओं (जीआईसी) के साथ खेती एक प्रासंगिक प्रणाली है कि जीबीएम विकास के रूपात्मक और कार्यात्मक सुविधाओं की नकल प्रदान कर सकते हैं. इस प्रणाली जीबीएम विकास के vivo सुविधाओं में कुछ पुन: पेश करता है जैसे कि हमलावर कोशिकाओं और नेक्रोसिस क्षेत्रों के फैलाना प्रवास, और यह ट्यूमर जीव विज्ञान के लिए प्रासंगिक जीन अभिव्यक्ति पर प्रकाश डाला गया. जैसा कि पहले से पता चला है, कुछ महत्वपूर्ण microRNAs 3 डी तंत्रिका ऊतक5,6के भीतर जीआईसी विकास के दौरान प्रेरित कर रहे हैं .
पीडी एक प्रमुख neurodegenerative विकार है और कई न्यूरॉन उपप्रकारों के अध: पतन के साथ जुड़ा हुआ7. यहां तक कि अगर लक्षणों की एक प्रगतिशील शुरुआत (जैसे, ब्रैडकिनेशिया, असममित बाकी कंपन, कठोरता और मुद्रा अस्थिरता) रोग की विशेषता है, इसकी सटीक एटियोलॉजी स्पष्ट रूप से स्थापित नहीं है। दरअसल, कई अध्ययनों सबूत है कि प्रमुख जोखिम कारकों आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों का एक संयोजन से परिणाम कर सकते हैं पर प्रकाश डाला है. पार्किंसंस लक्षण substancia नाइग्रा (एसएन) में डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स के द्विपक्षीय अध: पतन के साथ जुड़े रहे हैं, dopaminergic (डीए) axons के लापता होने के लिए अग्रणी 8,9. इसलिए, striatal डोपामाइन के स्तर की कमी पीडी रोगियों में मोटर रोग की प्रगति के साथ सहसंबद्ध है. डोपामाइनर्जिक न्यूरॉन्स में टायरोसिन हाइड्रॉक्सीलेस (थ्रथ), कैटेकोलेमिनर्जिक न्यूरोट्रांसमीटर के संश्लेषण में एक प्रमुख एंजाइम होता है जो एमिनो एसिड एल-टायरोसिन को एल-3,4-डाइहाइड्रॉक्सीफेनिलेलेनी (एल-डोपा, डोपामाइन अग्रदूत) को डोपामाइन10में परिवर्तित करता है। TH गतिविधि के प्रारंभिक नुकसान TH प्रोटीन अभिव्यक्ति में गिरावट के बाद पीडी की एक पहचान है.
यह अध्ययन मानव तंत्रिका organoids का उपयोग कर दो प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, एक विशेष रूप से TH सकारात्मक कोशिकाओं के साथ समृद्ध एक midbrain की तरह phenotype की ओर उन्मुख के साथ.
इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक सेल culturing और क्षेत्रों और तंत्रिका organoid आकारिकी के करीब निगरानी के दौरान HESC pluripotency के रखरखाव भी शामिल है. एचएसईएससी बहुत संवेदनशील होते हैं, और हर हेरफेर जल्दी अनियंत्रित भेदभाव के साथ-साथ सेल मौत का कारण बन सकता है। प्रयोगात्मक प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए और असामान्य केरियोटाइप घटनाओं की घटना से बचने के लिए, उनके गुणसूत्र स्थिरता के सत्यापन के बाद सबसे कम मार्ग पर ईएससी के कई बैचों को क्रायोप्रोव करने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, यह प्रत्येक प्रयोग के लिए एक नई शीशी thaw और हर दिन कोशिकाओं के व्यवहार की जांच करने के लिए सिफारिश की है. यदि गोले असामान्य उच्च आकार के साथ कम अपवर्तक होते हैं, तो वे मिलने की संभावना को समेकित करना और मरना शुरू कर देंगे।
इस प्रणाली में एक सुधार या तो perfusion या एक संवहनी प्रणाली को लागू करने (endothelial कोशिकाओं को जोड़ने के द्वारा या एक 3 डी fluidic माइक्रोचिप के भीतर)12,13है . हालांकि, तंत्रिका organoid की मोटाई को नियंत्रित करने ($300 डिग्री मीटर) ऑक्सीजन और nutriments के कुशल निष्क्रिय भ्रम की अनुमति देता है और परिगलन से बचाता है. एक और सुधार प्रतिरक्षा कोशिकाओं (माइक्रोग्लिया) की शुरूआत है। मन में इन सीमाओं के साथ, तंत्रिका organoids प्लस एक जीआईसी प्रणाली कई कारणों के लिए एक प्रासंगिक उपकरण हो सकता है. सबसे पहले, इस प्रणाली दवा स्क्रीनिंग की निगरानी कैसे एक चिकित्सकीय यौगिक एक organoid या ट्यूमर सेल को प्रभावित कर सकता है की अनुमति देता है. दूसरा, सेल-टू-सेल बातचीत का अध्ययन किया जा सकता है, और व्यक्तिगत और सामूहिक हमलों के अंतर्निहित सूक्ष्म-पर्यावरणीय निर्धारकों की कल्पना की जा सकती है और 5,6,13का पता लगाया जा सकता है।
पार्किंसंस रोग के संदर्भ में, एक तंत्रिका organoid दा न्यूरॉन्स में समृद्ध रोग के विकास का अध्ययन करने के लिए एक प्रासंगिक और सटीक 3 डी मॉडल का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. पिछले अध्ययनों में, पार्किंसंस रोगी व्युत्पन्न प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं दा न्यूरॉन्स की ओर विभेदित प्रभावित न्यूरॉन उपप्रकारों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. ध्यान दें, कुछ रोग-संबंधी फीनोटाइप जैसे कि -साइनुक्लिइन का संचय तथा ऑक्सीडेटिव प्रतिबल के प्रति संवेदनशीलता14,15पाई गई है। इसके अलावा, तंत्रिका organoid चिकित्सकीय अणुओं स्क्रीन करने के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, विशिष्ट और प्रासंगिक readouts दा न्यूरॉन अस्तित्व और कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए, डोपामाइन उत्पादन और electrophysiological गतिविधि के रूप में. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल तंत्रिका organoids उत्पन्न करने के लिए दो मानकीकृत और सटीक स्टेम सेल आधारित दृष्टिकोण प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ला लीग Genevoise Contre ले कैंसर (Geneva, स्विट्जरलैंड), ISREC फाउंडेशन (लौसने, स्विट्जरलैंड), और अनुसंधान के लिए क्लेटन फाउंडेशन (Houston, TX, संयुक्त राज्य अमेरिका) वित्तीय सहायता के लिए धन्यवाद. इसके अलावा, लेखकों HES-HO और वित्तीय सहायता के लिए Wys केंद्र धन्यवाद. हम सहायक विचार विमर्श और समर्थन और सबूत पढ़ने के लिए डॉ Halah Kutaish के लिए Krause प्रयोगशाला धन्यवाद.
6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |