Denne studien introduserer og beskriver protokoller for å utlede to spesifikke menneskelige neural organoids som en relevant og nøyaktig modell for å studere 1) menneskelige glioblastom utvikling innen menneskelige nevrale organoids eksklusivt hos mennesker og 2) Nevron dopaminerg differensiering generere en tredimensjonal organoid.
Mangelen på relevante in vitro nevrale modeller er en viktig hindring på medisinsk fremgang for neuropathologies. Etablering av relevante cellulære modeller er avgjørende både for å bedre forstå patologiske mekanismer av disse sykdommene og identifisere nye terapeutiske mål og strategier. For å være relevant, må en in vitro-modell reprodusere patologiske trekk ved en menneskelig sykdom. Men i sammenheng med nevrodegenerative sykdom, en relevant in vitro-modellen bør gi nevrale celle erstatning som en verdifull terapeutisk mulighet.
En slik modell ville ikke bare tillate screening av terapeutiske molekyler, men også kan brukes til å optimalisere nevrale protokollen differensiering [for eksempel i sammenheng med transplantasjon i Parkinsons sykdom (PD)]. Denne studien beskriver to in vitro protokoller av 1) menneskelige glioblastom utvikling innenfor en menneskelig neural organoids (NO) og 2) Nevron dopaminerg (DA) differensiering generere en tredimensjonal (3D) organoid. For dette formålet, en godt standardisert protokoll ble etablert som tillater produksjon av størrelse-kalibrert neurospheres avledet fra humant embryonale Stamcelle (hESC) differensiering. Den første modellen kan brukes til å avdekke molekylære og cellulære hendelser som forekommer under i glioblastom utvikling innenfor neural organoid, mens DA organoid ikke bare representerer en passende kilde til DA neurons for celle terapi i Parkinsons sykdom, men også kan brukes til narkotika testing.
Verdenshelseorganisasjon (WHO) klassifiserer astrocytomas som lav grad (grad I til II) eller høy klasse (grad III og IV). Glioblastom multiforme (GBM) er en astrocytom grade IV, den mest dødelige av primære hjernesvulster, som er motstandsdyktig mot alle aktuelle former for behandlinger1. Til tross for standard-of-Care terapi inkludert nevrokirurgi, kjemoterapi, og strålebehandling, GBM fortsatt dødelig og 15-måneders total overlevelse har ikke dramatisk endret de siste 15 årene2. For å gjøre betydelige fremskritt i forståelsen GBM patogenesen, er bruken av relevante modeller nøkkelen. Så langt har studiet av GBM stolt på cellelinjer, gnagere organotypic skiver, og xenotransplantation av pasient-avledede celler til mus eller transgene mus utvikle spontane svulster3,4. Selv om disse modellene har vært nyttig å studere hjernen metastasering og tumor aggressivitet, de er begrenset av forskjeller mellom arter, og resulterende konklusjoner kan være feilaktig oversatt til menneskelig vev. Videre er eksisterende modeller med menneskelige celler også begrenset av fraværet av verten vev/tumor interaksjoner3,4. Eksperimentelle modeller er avgjørende for oversettelsen fra grunnleggende vitenskap til terapeutiske mål. Derfor beskriver en protokoll for å produsere in vitro menneskelige nevrale organoids co-kultivert med GBM-initiere celler (GICs) kan gi et relevant system som etterligner morfologiske og funksjonelle funksjoner i GBM utvikling. Dette systemet gjengir noen in vivo-funksjoner i GBM-developmentsuch som diffus migrering av invaderende celler og nekrose, og det fremhever genuttrykket som er relevant for tumor biologi. Som tidligere avslørt, er noen kritiske microRNAs indusert under GIC utvikling innen 3D nervøs vev5,6.
PD er en stor nevrodegenerative lidelse og forbundet med degenerasjon av flere neuronal under typer7. Selv om en progressiv utbruddet av symptomer (f. eks, rekkefølge, asymmetrisk hvile tremor, stivhet og holdning ustabilitet) karakteriserer sykdommen, dens eksakte etiologi er ikke klart etablert. Faktisk har mange studier fremhevet bevis for at store risikofaktorer kan skyldes en kombinasjon av genetiske og miljømessige faktorer. Parkinsonspasienter symptomer er forbundet med bilateral degenerasjon av dopaminerg neurons i substancia Nigra (SN), som fører til forsvinningen av dopaminerg (da) axons projisere til striatum8,9. Derfor, reduksjon av stria tale dopamin nivåer er korrelert med progresjon av motorisk dysfunksjon hos PD pasienter. Dopaminerg neurons inneholder tyrosin hydroksylase (TH), en nøkkel enzym i syntesen av catecholaminergic nevrotransmittere som konverterer aminosyren L-Tyrosin til L-3, 4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA, en dopamin forløper) til dopamin10. Tidlig tap av TH aktivitet etterfulgt av en nedgang i TH protein uttrykk er et kjennetegn på PD.
Denne studien beskriver to protokoller ved hjelp av menneskelige nevrale organoids, med en spesielt orientert mot en mellomhjernen-lignende fenotype beriket med TH-positive celler.
En av de mest kritiske aspektene ved denne protokollen inkluderer vedlikehold av hESC pluripotency under celle dyrking og tett oppfølging av kulene og neural organoid morfologi. hESCs er svært følsomme, og hver manipulasjon kan føre til tidlig ukontrollert differensiering samt celle død. For å øke eksperimentell reproduserbarhet og unngå forekomsten av unormale Karyotype hendelser, anbefales det å lagre nedfryste flere partier av hESCs på den laveste passasjen etter validering av deres kromosom stabilitet. Videre anbefales det å tine et nytt hetteglass for hvert eksperiment og kontrollere atferden til cellene hver dag. Hvis kulene er mindre brytnings med unormal høyere størrelse, vil de trolig begynne å samle og dø.
En forbedring på dette systemet er enten vascularized eller implementere en system (ved å legge endothelial celler eller i en 3D fluidic microchip)12,13. Men å kontrollere tykkelsen av nevrale organoid (≤ 300 μm) gir effektiv passiv tilførsel av oksygen og omdannelse og forhindrer nekrose. En annen forbedring er innføringen av immunceller (mikroglia). Med disse begrensningene i tankene, kan nevrale organoids pluss et GIC system være et relevant verktøy av flere grunner. Først, dette systemet gjør at stoffet screening for å overvåke hvordan en terapeutisk sammensatte kan påvirke en organoid eller tumor celle. For det andre kan celle-til-celle interaksjoner bli studert, og mikro-miljømessige faktorer underliggende individuelle og kollektive invasjoner kan bli visualisere og utforsket5,6,13.
I sammenheng med Parkinsons sykdom, en neural organoid beriket i DA neurons kan representere en relevant og nøyaktig 3D-modell for å studere sykdomsutvikling. I tidligere studier, Parkinsons pasient-avledet indusert Pluripotent stamceller differensiert mot DA neurons har blitt brukt til å studere de berørte neuronal under typer. Noen sykdoms relaterte fenotyper som Oppsamling av α-synuclein og følsomhet for oksidativt stress har blitt observert14,15. Videre kan neural organoid brukes som et verktøy for å skjermen terapeutiske molekyler. Men, spesifikke og relevante readouts bør settes opp for å evaluere DA Nevron overlevelse og funksjonalitet, for eksempel dopamin produksjon og elektrofysiologisk aktivitet. Alt i alt denne protokollen gir to standardiserte og nøyaktige stilk cellen-baserte tilnærminger til å generere nevrale organoids.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker la Ligue Genevoise contre Le Cancer (Genève, Sveits), ISREC Foundation (Lausanne, Sveits), og Clayton Foundation for Research (Houston, TX, USA) for økonomisk støtte. Videre forfatterne takker HMS-HO og Wyss Center for økonomisk støtte. Vi takker Krause ‘ s Lab for nyttige diskusjoner og støtte og Dr. Halah Kutaish for korrekturlesing.
6-well plate (6-well plate) | Falcon / Corning | 07-201-588 | |
ABI Prism 7900 HT detection system (Real-Time PCR detection systems) | Applied Biosystems | Discontinued | |
Aggrewell 400 (Microwell culture plates ) | StemCell Technologies | 34421 | |
Amplifier (W2100-HS32) (Amplifier) | Multi Channel Systems | ||
Anti-EGFR (phospho Y1101) antibody | Abcam | ab76195 | 1/100 dilution |
Anti-GFAP Antibody | Dako | Z334 | 1/1000 dilution |
Anti-Nestin, Human Antibody | Millipore | ABD69 | 1/400 dilution |
Anti-Synapsin I Antibody | Chemicon | AB1543P | 1/500 dilution |
B27 supplements (B27) | Life Technologies / Invitrogen | 1238 | For both protocol, stock solution 100x, final solution 1x |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Cell Guidance | GFH1-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
CHIR-99021 (GSK-3β inhibitor ) | Axon Medchem | ct99021 | For Dopaminergic protocol, stock solution 7.5 mM in DMSO, final solution 3 µM |
Compound E a γ–secretase inhibitor (γ–secretase inhibitor) | Calbiochem | CAS 209986-17-4 | For both protocol (gamma-secretase inhibitor XXI), stock solution 5 mM in DMSO, final solution 1 µM |
Coulochem III (Coulometric detector parameters) | Thermo scientific | ||
Dibutyryl cyclic-AMP (Dibutyryl cAMP) | Sigma | D0627 | For Dopaminergic protocol, stock solution 0.5 M in DMSO, final solution 0.5 mM |
Dimethyl Sulfoxide Pure (DMSO) | Sigma-Aldrich | C6164 | Compounds solvent, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12491-015 | For cell culture, ready to use |
Dulbecco's Modified Eagle Medium Mixture F-12 (DMEM-F12) | Gibco | 11320033 | For cell culture, ready to use |
EDTA 0.1 mM (EDTA) | Life Technologies | AM9912 | For cell culture, ready to use |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Gibco | PHG0313 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
Fibroblast Growth Factor 20 (FGF20) | Peprotech | 100-41 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 5 ng/mL |
fibroblast growth factor 8 (FGF8) | Peprotech | GFH176-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
Fibroblast growth factor-basic (bFGF) | Gibco | PHG0024 | For GIC culture, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 10 ng/mL |
G5 supplements (G5) | Invitrogen | 17503012 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) | Cell Guidance | GFH2-2 | For both protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 20 ng/mL |
Hydrophilic polytetrafluoroethylene membrane (PTFE membrane) | BioCell-Interface | Discontinued | |
LDN-193189 (BMP inhibitor) | Axon Medchem /Stemgen | 04-0072-02 /1509 | Dual/Smad, stock solution 5 mM in DMSO, final solution 0.5 µM |
L-glutamine (L-glutamine) | Gibco | 25030081 | L-Glutamine (200 mM), stock solution 200 mM, final solution 2 mM |
Matrigel (extracellular matrix) | BD Biosciences | 354277 | hESC-qualified Matrix, stock solution 18-22 mg/mL, final solution 180-220 µg/mL |
Millicell-CM Culture plate insert (0.4 µm) (Culture plate insert) | Millipore | PICM03050 | |
Monoclonal Anti-β-Tubulin III antibody | Sigma | T8660 | 1/1000 dilution |
MS Orbital Shaker, MS-NOR-30 (Orbital shaker) | Major Science | MS-NRC-30 | |
N2 supplements (N2) | Invitrogen | 17502-048 | For GIC culture, stock solution 100x, final solution 1x |
Nanodrop (Nanodrop) | Thermo Fisher Scientific | Discontinued | |
Neurobasal (Neurobasal) | Life Technologies / Gibco | 21103049 | Maintenance and maturation embryonic neuronal cell populations , ready to use |
Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140 | Non-essential Amino Acids 100X, stock solution 100x, final solution 1x |
Nurr1 Antibody (M-196) | Santa Cruz | Sc-5568 | 1/100 dilution |
Nutristem (hESC medium ) | Biological Industries | 05-100-1A | Stem cell media, ready to use |
Penicilin / Streptomycin (Penicilin / Streptomycin ) | Life Technologies / Gibco | 15140122 | For cell culture, stock solution 5 mg/mL, final solution 50 µg/mL |
Perchloric acid 0.1N (HCLO4) | Merck | 100519 | For HPLC, ready to use |
Phosphate Buffered Saline without Ca2+/Mg2+ (PBS without Ca2+/Mg2+ ) | Life Technologies | 14190250 | For cell culture, ready to use |
PrimeScript RT-PCR Kit (Reverse transcription kit) | Takara | RR014A | |
Purmorphamin (smoothened agonist) | Calbiochem | SML0868 | For Dopaminergic protocol, stock solution 10 mM in DMSO, final solution 2 µM |
Rho-associated Kinase Y-27632 (ROCK) | Abcam Biochemicals | ab120129-1 | Rock Inhibitor, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
RNeasy mini kit (RNA extraction kit ) | Qiagen | 74104 | |
SB-431542 (TGFβ/Activin/Nodal inhibitor ) | Ascent | Asc- 163 | Dual-Smad, stock solution 50 mM in DMSO, final solution 10 µM |
Sonic Hedgehog (SHH) | Cell Guidance | GFH168-5 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure H2O, final solution 100 ng/mL |
StemPro Accutase (hESC enzymatic solution) | Gibco | A11105-01 | hESC enzymatic solution, ready to use |
Symmetry C-18,5 mm (4.6 150mm2) (Reversed-phase column) | Waters Corporation | ||
T150 flask (T150 flask) | Falcon | 08-772-1F | |
TH Antibody (F-11) | Santa Cruz | Sc-25269 | 1/200 dilution |
Transforming Growth Factors beta 3 (TGFβ3) | Cell Guidance | GFH109-2 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µg/mL in pure ethanol , final solution 1 ng/mL |
Trichostatine A (inhibitor of histone deacetylase ) | Sigma | T8552 | For Dopaminergic protocol, stock solution 100 µM in DMSO, final solution 20 nM |
TrypLE (recombinant enzymatic solution) | Invitrogen | 12604021 | recombinant enzymatic solution, ready to use |
Trypsin 0.25% (enzymatic solution) | Life Technologies | 15050065 | enzymatic solution, ready to use |
W2100, Multi Channel Systems (Data acquisition system ) | WAT045905 | ||
X-vivo (serum free medium) | Lonza | BE04-743Q | serum free medium, ready to use |