Summary
전압에 민감한 염료를 사용하여 뇌 조각을 재현하고 안정적으로 광학 기록 하는 방법을 소개합니다. 이 기사에서는 기존의 해마 슬라이스 준비를 사용하여 전압에 민감한 염료 염색 및 광 신호 기록에 대해 설명합니다.
Abstract
뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 에민감한 염료(VSD) 이미징은 신경 회로의 기능적 연결을 평가하는 유용한 도구입니다. 광 신호의 분수 변화로 인해, 이 방법을 정량적 분석법으로 사용하기가 어려웠다. 이 문서에서는 이 기술을 안정적이고 신뢰할 수 있는 특수 광학 및 슬라이스 처리 시스템에 대해 설명합니다. 본 기사에서는 VSD 염색 해마 슬라이스의 슬라이스 처리, 염색 및 기록을 자세히 보여줍니다. 이 시스템은 좋은 염색과 함께 오랜 시간 동안 생리 적 조건을 유지하고, 기록 하는 동안 슬라이스의 기계적 움직임을 방지합니다. 또한 소량의 염료로 조각을 염색 할 수 있습니다. 광학 장치는 낮은 배율에서 높은 수치 조리개를 구현하여 100픽셀 x 100픽셀 공간 해상도로 최대 프레임 속도 10kHz에서 VSD 신호를 기록할 수 있습니다. 높은 프레임 속도와 공간 해상도로 인해 이 기술은 신경 회로의 변화를 평가하기에 충분한 신호 대 잡음 비를 제공하는 사후 기록 필터를 적용합니다.
Introduction
대량 염색 된 뇌 슬라이스 제제의 광자 단일 광자 전압 감응염 (VSD) 이미징은 신경 회로 1, 2,3,4의 역학을 평가하는 유용한 정량적 도구가되었습니다. . 멤브레인 여기5,6,7,VSD 이미징으로 인한 광학 적 특성의 변화를 분석 한 후 1970 년대 초에 코헨 및 기타6,8에 의해 처음 기재되었습니다. 9. . 염료가 막 전위 변화(즉, 뉴런의 1차 신호)를 직접 프로브하기 때문에 실시간으로 뇌 기능을 모니터링하는 적절한 방법이다.
초기 VSD는 뇌 계통을 이해하는 바람직한 특성을 가지고, 이러한 빠른 시간 상수 와 같은 뉴런 막 전위 사건의 급속한 역학을 따르고, 멤브레인 전위 9의 변화와선형성 10개 , 11세 , 12세 , 13세 , 14세 , 15. 다른 이미징 실험과 유사하게,이 기술은 원하는 결과를 달성하기 위해 카메라, 광학, 소프트웨어 및 슬라이스 생리학과 같은 광범위한 특정 튜닝을 필요로합니다. 이러한 기술적 함정 으로 인해 초기 노력 중 예상되는 이점은이 기술을 전문으로하지 않은 대부분의 실험실에서 반드시 구체화되지는 않았습니다.
기술적 난이도의 원초적 원인은 슬라이스 제제의 대량 염색에 적용될 때 멤브레인 전위 변화에 대한 VSD의 낮은 민감도였다. 광 신호의 크기(즉, 형광의 분수 변화)는 일반적으로 생리적 조건하에서 대조군(F0) 신호의 10-4-10-3이다. 뉴런의 막 전위 변화의 시간 척도는 약 밀리초에서 수백 밀리초까지입니다. 뉴런의 멤브레인 전위 변화를 측정하기 위해 레코딩에 사용되는 카메라는 고속(10kHz ~ 100Hz)의 이미지를 획득할 수 있어야 합니다. VSD의 낮은 감도와 신경 신호를 따르는 데 필요한 속도는 높은 신호 대 잡음 비 (S / N)2,16으로고속으로 카메라에서 많은 양의 빛을 수집해야합니다.
레코딩 시스템의 광학 장치는 충분한 빛의 수집을 보장하고 S/N을 개선하는 데 중요한 요소입니다. 광학에 의해 달성된 배율은 종종 국소 기능신경회로를 가시화하기 위해 1X ~ 10X와 같이 지나치게 낮습니다. 예를 들어, 해마 회로의 역학을 시각화하기 위해 약 5의 배율이 적합할 것입니다. 이러한 낮은 배율은 낮은 형광 효율을 가지고; 따라서 고급 광학은 이러한 기록에 도움이 될 것입니다.
또한 슬라이스 생리학도 필수적입니다. 이미징 분석에는 슬라이스가 손상되지 않도록 해야 하므로17. 또한, 더 긴 시간 동안 슬라이스 생존을 유지하기 위해 취한 조치는 중요하다18.
이 문서에서는 슬라이스, VSD 염색 및 측정을 준비하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 문서에서는 또한 VSD, 이미징 장치 및 광학에 대한 개선 사항 및 이 방법을 간단하고 강력하며 정량적 분석으로 사용할 수 있게 한 실험 시스템에 대한 기타 추가 개선 사항에 대해 설명합니다. 뇌 기능의 수정19,20,21,22,23,24,25. 이 기술은 또한 해마 슬라이스1의CA1 영역에서 장기 적인 약식에 널리 사용될 수 있다. 더욱이, 이 기술은 단일 신경 세포(26)에서막 전위(26)의 광학 기록에도 유용하다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 실험은 도쿠시마 분리 대학의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 슬라이스 준비를 위한 다음 프로토콜은 거의 표준 절차 27이지만, 수정은 VSD로 염색 및 기록의 프로토콜이었다.
1. 실험일 전준비
- 재고 A (표1),재고 B (표2),및 재고 C (표3)솔루션을 준비하고 냉장고에 보관하십시오.
- 인공 뇌척수액 1L(ACSF)(표4, 3단계 참조)를 준비하고 냉장고에 보관하십시오.
- 수정된 ACSF 1L(표 5)을 준비하고 냉장고에 보관하십시오.
- 2 mL 바이알에 태아 소 혈청 (FBS)의 500 μL aliquots를 분배하고 냉동실에 보관하십시오.
- 한천 분말의 4%를 전자레인지에 120mL에 녹여 90mm 일회용 페트리 접시에 붓습니다. 한천 플레이트는 추가 사용 전에 냉장 보관해야 합니다.
- 실험 전날 냉동실에 다음 품목을 놓습니다: 수술용 트레이, 슬라이서 용기 및 알루미늄 냉각 블록(120x 120 x 20 mm 3).
- 슬라이스 처리 시스템17,28(단계 6.12 참조)에 멤브레인 필터가 있는 플렉시 유리 링이 충분한지 확인하십시오.
- 한천 파우더의 2%를 50 mL의 3M KCl에 전자레인지에 녹입니다. 접지 전극을 위한 마이크로파이펫을 사용하여 200 μL 팁에서 따뜻한 아가-KCl 용해물의 약 85 μL을 취하십시오. 팁을 따뜻한 한천 3M KCl 젤에 분리합니다. 이 단계를 반복하여 약 20-40개의 팁을 2% 한천으로 채웁니다.
2. VSD (di-4-ANEPPS) 주식 솔루션의 준비
- 초순수로 1mL의 10% 폴리에톡설화 피마자유 용액을 준비합니다.
- 디-4-ANEPPS(5 mg 바이알), 와류 및 초음파 처리재 10분 동안 1 mL의 에탄올을 바이알에 넣습니다. 용액은 di-4-ANEPPS 결정의 가능한 작은 잔류물로 깊은 붉은 색으로 변합니다.
참고: 이 단계에서 사용되는 에탄올은 새로 열어야 합니다. - O 링이 있는 2mL 마이크로튜브로 솔루션을 전송합니다. 용액을 스핀다운하고 10% 폴리에톡설화 피조물 오일 용액 500 μL을 추가합니다.
참고: 염료는 매우 친유성입니다. DMSO 및 폴록사머는 di-4-ANEPPS를 용해시키는 데에도 사용될 수 있지만 멤브레인 전위 변화에 따른 광 신호의 관점에서, 우리는 에탄올-폴리에톡설화 피장 오일의 사용이 소음 비에 더 나은 신호를 제공한다는 것을 발견했습니다. 이는 세포막으로의 용매의 전달 속도와 관련될 수 있다. - 염료가 완전히 용해 될 때까지 소용돌이 및 초음파 처리하십시오.
- 빛에 노출되지 않도록 하고 냉장고에 보관하십시오. 냉동실에 보관하지 마십시오. 주식은 몇 달 동안 지속될 수 있습니다.
참고: 실험 당일, 3-9단계를 따른다.
3. ACSF의 일일 준비 (1 L) (표 4)
- NaCl, NaHCO3및 플라스크에 포도당을 계량하십시오.
- 플라스크에 950 mL의 증류수를 넣고 95% O 2/5% CO2 가스로 버블링을 시작합니다.
- 2.5 mL의 스톡 A 용액을 플라스크에 넣고 실온에서 약 10분 동안 배양합니다.
- 플라스크에 2.5 mL의 스톡 C 용액을 추가합니다.
- 증류수를 추가하여 1L에 용액을 만듭니다.
4. 염색 VSD 용액의 일일 준비
- 5분 동안 초음파 초음파 처리기에서 FBS 및 VSD 스톡 솔루션(2단계)의 500 μL 바이알을 초음파 처리합니다.
- FBS 의 유리병에 갓 준비된 ACSF 500 μL을 추가합니다.
- 바이알에 VSD 스톡 용액의 20(마우스의 경우) 또는 40(쥐의 경우) μL을 첨가한다.
- 용액이 옅은 주황색이 될 때까지 유리병을 초음파 및 소용돌이.
5. 수술 준비
- 냉장 ACSF 100mL를 300mL 스테인리스 스틸 용기, 300mL 비커 및 플라스틱 용기에 별도로 넣고 냉동실에 보관하십시오. 다른 비커에 150 mL의차가운 변형 ACSF (표 2)를 부어 냉동실에 넣습니다. 솔루션이 냉각 될 때까지 기다립니다. 사전에 측정하고 결정해야 합니다.
- 면도날(카본 강, 산업용 등급 0.13mm 두께, 양쪽 블레이드)을 슬라이서의 절반으로 부수도록 접습니다.
참고: 나머지 절반은 적절한 블레이드 홀더로 해부에 사용할 수 있습니다. - ACSF 에서 블록을 준비 4% 한천 플레이트 조정지그 (그림 1).
- 습한 인큐베이션 챔버(계면 형 챔버; 변형된 1.2L 밀봉 된 상자와 실리콘 패킹)를 준비하여 뇌 조각을 생리적으로 살아 있게 유지한다 (도2); ACSF를 95% O 2/5% CO2 가스로 작은 용기에 넣고 탄산염을 넣고 ACSF가 있는 90mm x 20mm 페트리 접시를 맨 위에 채웁니다.
참고: 작은 페트리 접시 (60mm x 20mm)는 접시에 여과 지를 지원하기 위해 90mm 접시의 중앙에 배치해야합니다. - 가열 장치에 상자를 넣고 28 °C까지 따뜻하게 20 분 동안 기다립니다.
- 분쇄된 얼음을 슬라이서 용기에 넣습니다. 얼음 위에 스테인리스 스틸 통(작은) 악기를 놓습니다: 메스, 블레이드 홀더, 링 핀셋, 한천 블록, 슬라이서 스테이지. 냉동 ACSF 및 수정 된 ACSF를 얼음과 거품에 95 % O2/ 5 % CO2 가스 (일명 카보겐)로 유지하십시오.
- 가위(크고 작은), 핀셋, 주걱, 숟가락, 대각선 펜치 등 다음 악기를 통(큰 것)에 놓습니다.
6. 수술 (생쥐)
- 연기 후드에 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취. 발가락 핀치시 동물의 페달 반사를 확인하여 마취 수준을 평가합니다.
- 마우스를 참수하고 스테인레스 스틸 수술 트레이에 얼음 차가운 ACSF에 머리를 담급니다.
- 1분 이내에 뇌를 추출하고 차가운 ACSF가 들어있는 비커에 5분 동안 넣습니다.
- 비커에서 뇌를 꺼내 메스를 사용하여 뇌 블록을 다듬습니다 (그림3A).
- 뇌 블록을 4% 한천 블록에 놓습니다(단계 5.3, 그림 3B). 두 반구는 한천 블록에 장착할 수 있습니다. 필터 용지로 블록에서 여분의 ACSF를 닦습니다.
- 슬라이서 테이블에 얇은 접착제 (슈퍼 접착제)를 적용합니다. 한천 블록을 놓고 여과지를 사용하여 여분의 접착제를 닦아냅니다.
- 뇌-한천 블록 상단에서 피펫을 사용하여 소량의 얼음 차가운 ACSF (~5 mL)를 부드럽게 바릅니다. 이것은 과잉 슈퍼 접착제를 고체화하고 접착제가 뇌를 덮고 슬라이스를 방해하는 것을 방지하는 데 도움이됩니다.
- 슬라이서 테이블을 슬라이서 트레이(그림3C)에고정하고 수정된 ACSF를 붓습니다.
- 슬라이서를 블레이드 주파수를 최대로 느린 속도로 설정합니다.
- 슬라이스 두께를 350-400 μm로 설정하고 슬라이스를 시작합니다(그림3C). 슬라이스 트레이의 모서리에 슬라이스를 순서대로 배치하여 슬라이스의 깊이를 쉽게 구별할 수 있도록 합니다. 일반적으로 한 반구에서 3~5개의 슬라이스를 얻을 수 있습니다.
- 30 G 바늘을 사용하여 뇌줄기부분을 잘라냅니다(그림 3D).
참고: CA3-CA1 경계 사이 절단과 같은 두뇌 슬라이스에 미세 수술은 필요한 경우에 쌍안경 현미경의 밑에 이 단계에서 행해져야 합니다. - 작은 기울어진 페인트 브러시를 사용하여 플렉시 글라스 링17 (외경 15mm, 내경 11mm, 두께 1mm, 그림 3E)으로보관된 멤브레인 필터 (0.45 μm 기공, PTFE 멤브레인, 13mm 직경)의 중앙에 슬라이스를 놓습니다. 링을 습한 회수 챔버에 놓고(그림 2) 커버를 고정하여 내부 압력을 높게 유지합니다.
참고: 슬라이스는 30 분 이내에 멤브레인에 달라 붙어 기록 챔버의 후속 단계에서 링으로 처리 할 수 있습니다. 슬라이스를 제자리에 유지하기 위해 가중치 나 다른 조치를 사용할 필요가 없습니다. - 링의 슬라이스 방향과 위치를 조정하여 잘 중앙에 배치되고 일관된 방향이 있는지 확인합니다(9.3 단계 참조).
- 시편을 28°C에서 30분 동안 방치한 다음, 슬라이스 회수를 위해 실온에서 10 내지 30분 이상 방치한다.
참고: 슬라이스는 이제 적어도 15 시간 동안 좋은 생리 적 상태를 유지할 수 있습니다.
7. 슬라이스의 염색 및 헹구기 (생)
- 마이크로파이펫을 사용하여 링의 각 슬라이스에 염색 용액(4단계)의 100-110 μL을 부드럽게 바릅니다. 4단계에서 제조된 하나의 염색용액으로 8~9개의 슬라이스를 염색할 수 있다. 얼룩을 위해 슬라이스를 20분 동안 그대로 둡니다.
- 용기에 ACSF 50-100 mL을 준비하고 염색 용액을 헹구기 위해 슬라이스 된 표본이있는 링을 넣습니다.
- 헹위된 슬라이스를 다른 배양실에 보관합니다. 실험 전에 복구를 위해 1 시간 이상 기다립니다.
참고: 인큐베이션 챔버는 가스로부터 분리되고 단단한 밀봉 된 상태에서 기록장소로 이동될 수 있다. 슬라이스는 가스 공급없이 적어도 20 분 동안 살아 있을 수 있습니다. 이 기능은 기록을 위해 슬라이스를 다른 장소로 이동해야 하는 경우에 유용합니다.
8. 실험 기구의 일일 준비
- 앰프, 컴퓨터 및 카메라 시스템을 켜고 소프트웨어가 실행 중인지 확인합니다.
- ACSF를 50 mL 튜브에 놓고 카보겐으로 거품을 냅니다.
- 연동 펌프를 사용하여 ACSF를 순환시킴. 유량을 약 1mL/min으로 조정합니다.
- 실험실 내부의 액체 레벨이 항상 일정하게 유지되도록 흡입 파이펫의 높이를 조정합니다.
참고: 용액의 레벨은 안정적인 기록을 얻기 위해 중요하므로, 조정은 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 수행해야한다. - 3M KCl 한천으로 채워진 노란색 칩으로 구성된 접지 전극 설치 (2%) (1.8단계)을 3M KCl 용액의 소량으로 Ag-AgCl 와이어를 가진 홀더에 넣습니다.
- 소량의 ACSF(부피의 약 2/3)를 테이퍼된 얇은 튜브 옐로우 팁을 사용하여 유리 전극(1mm 외경, 0.78mm 내경 0.78mm 내경)에 채우고 전극 홀더에 넣습니다.
- 조작기에 설치된 로드에 홀더를 부착합니다. 전극 저항이 약 1MΩ인 앰프를 사용하십시오.
참고: 긴 생크 와이드 개구부(4-8 μm 개구부) 패치 형 전극은 현장 기록 및 자극 전극으로서 양호해야 한다.
9. 레코딩 세션 시작
- 집게와 촉촉한 챔버에서 슬라이스 준비를.
- 슬라이스를 현미경 아래 실험 챔버에 빠르게놓습니다(그림 4).
- 링의 가장자리를 실리콘 O 링에 단단히 밀어 넣습니다. 실험실의 막이나 바닥을 부러뜨리지 않도록 주의하십시오.
참고: 슬라이스의 방향은 시야에서 전극을 자극하고 기록하는 방향에 대하여 고려되어야 한다. 건강한 슬라이스는 멤브레인 필터에 달라붙어서 가중치 및 나일론 메세와 같은 슬라이스를 수정하기 위해 다른 장치를 사용할 필요가 없습니다. - 자극 전극의 팁과 필드 전위 기록 전극을 투과된 빛으로 현미경 아래의 슬라이스에 놓습니다.
- 전기 생리학적 기록 시스템을 사용하여 응답을 확인합니다. 주어진 구성으로 일반적인 (얼룩이 없는) 전기 생리학적 기록을 확인합니다.
참고: 기록 전극은 생략할 수 있지만 슬라이스의 생리학을 확인하는 데 유용하다. - 5x 침지 대물렌즈와 1x PLAN APO 튜브 렌즈로 10kHz에서 샘플링할 때 시편에서 13-15mW/cm2에 해당하는 카메라의 최대 용량의 약 70-80%로 여기 광 강도를 조정합니다. 여기 광 파지는 530 nm이고 방출 필터는 > 590 nm이어야 합니다.
참고: 셔터를 사용하여 여기 빛의 양을 최소화합니다. 지속적인 빛 노출은 슬라이스 생리학을 악화시킬 수 있다. 빛의 가능한 유해한 효과는 빛의 강도와 지속 시간에 따라 달라집니다. 빛의 효과를 판단하기 위해 전기 생리학적 기록을 사용합니다. 13-15 mW / cm 2의강도의 경우, 약 1 s 노출 허용 오차의 상한이어야한다. - 형광광원을 이용하여 수집 시스템으로 초점을 조정하는 것은 초점이 파장에 따라 다를 수 있기 때문에 수집을 시작한다.
- 이미지 수집 소프트웨어의 데이터를 검사합니다.
참고: 우리는 상세한 분석을 위해 수치 분석 소프트웨어의 원래 마이크로 프로그래밍 패키지를 사용했다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
도 5는 마우스 해마 슬라이스의 CA1 영역에서 샤퍼 담보의 전기 자극 시 대표적인 광 신호를 나타낸다. 그림 5A의 연속된 이미지는 공간 및 시간 필터가 적용되기 전에 광학 신호를 표시하는 반면, 그림 5B는 5 x 5 x 5 입방 필터(가우시안 커널 컨볼루션, 5 x 5 공간- 및 5)를 적용한 후 동일한 데이터를 표시합니다. 시간 차원) 두 번. 높은 프레임 속도(0.1 ms/frame)와 높은 공간 해상도(100픽셀 x 100픽셀)로 인해 필터의 적용은 신호를 변경하지 않고 노이즈를 필터링하여 단일 시험에서 픽셀로 기록된 시간 코스에서도 관찰할 수 있습니다( 그림 5C,필터 없음; 도 5D,필터; 그림 5E,중첩).
도 6은 마우스(도6A)와랫트 사이의 해마 슬라이스의 영역 CA1에서의 전형적인 반응을 비교한다(도6B). 도면에서 알 수 있듯이, 억제 입력으로 인한 과분극 반응은 CA1/CA3 경계 근처의 샤퍼 담보에 동일한 자극을 가하면 랫트 해마 슬라이스에서 명백하다. 작은 과분극 반응은 마우스 해마 슬라이스에서 24 ms 후 CA1의 말단 측에서 관찰되지만, 더 대규모 과분극 반응은 랫트 해마 슬라이스에서 탈분극 반응을 추월했다. VSD 화상 진찰은 마우스와 쥐 해마 조각 사이 다름을 명확하게 보여줄 수 있습니다.
그림 1 : 슬라이스와 블록을 만들기 위해 지그를 위해 뇌 조직을 탑재하는 데 사용되는 한천 블록의 그림. (A) 뇌 블록과 4 % 한천 블록 (B)의 개략적 인 그림. (C, D) 한천 블록을 만들기 위해 플렉시 유리 플레이트 (각각 5mm 두께)로 만든 조정 가능한 지그의 사진. 한천 블록을 준비할 때, 상부 및 하부 플레이트는 D.에도시된 바와 같이 적층되어야 한다(E) 긴 얇은 슬롯(1)과 (2)에 블레이드를 삽입함으로써, 삼각형 부분이 절단되고, 슬롯(3)이 블록의 전체 깊이를 트리밍하는데 사용된다. (4) 상부 플레이트를 제거하면 불필요한 부품을 잘라낼 수 있습니다. 슬롯 1과 2를 사용하여 블록이 (A) 및 (B)에 표시된 대로 되도록 5mm 깊이 컷만 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 슬라이스 생리학을 유지하는 데 사용되는 인터페이스 타입 인큐베이팅 챔버의 그림. (A) 시스템 개요입니다. (B) 인테리어 세부 사항. (C) 복구 챔버의 그림. 견본은 ACSF 채워진 90mm 및 60 mm 페트리 접시에 배치 된 필터 종이에 배치해야합니다. 후자의 요리는 여과지를 지지하는 것입니다. 접시와 ACSF 버블링 용기는 플렉시 유리 접시와 함께 제자리에 보관됩니다. 필터 용지는 밀폐 된 상자또는 용기의 벽에 닿지 않아야합니다. 공기는 챔버에 축축한 가스를 통합 버블링 병을 통해 공급된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 마우스 뇌에서 해마 슬라이스 준비. (a) 분리된 마우스 뇌는 파선(a)에서 먼저 자른 다음 (b)해야 합니다. 마지막으로, 컷은 선(c)을 따라 이루어져야 한다. 절단은 바닥에 수직이어야 합니다. (B) 뇌 블록을 한천 블록에 장착해야 합니다. (C) 한천 블록을 슬라이서 위에 놓아야 한다. (D) 결과 슬라이스. 과잉 조직은 파선에서 절단해야합니다. (E) 슬라이스는 플렉시 유리 홀더 (외부 직경 15mm, 내경 11mm, PTFE 멤브레인 필터 13mm)로 멤브레인 필터의 중앙에 배치해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 슬라이스 준비에서 광 신호를 위한 레코딩 시스템. (A) 현재 원고의 조각을 이미지화하는 데 사용되는 현미경 사진입니다. 광학은 대물 렌즈(5x NA0.60), 이색 필터용 미러 박스(580nm), 프로젝션(튜브) 렌즈(PLAN APO x1.0)로 구성됩니다. c-마운트를 통해 프로젝션 렌즈 상단에 고속 카메라가 부착됩니다. 관찰을위한 또 다른 일반적인 USB 카메라가 있습니다. 광섬유를 사용하여 여기 광이 도입됩니다. (B) 미러 박스와 호환되는 렌즈의 사진. (C) 레코딩 시스템의 회로도. 이미징 시스템과 전기 생리학적 기록 시스템은 PC에 의해 제어됩니다. 광다이오드 피드백 제어 시스템을 이용한 LED 조명 시스템을 광원으로 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 마우스 해마 슬라이스의 영역 CA1에서 대표적인 광 신호는 단일 시험에서. (A) 연속된 이미지는 공간 및 시간 필터(매 0.2 ms)를 적용하기 전에 샤퍼 부수적 경로를 따라 0.1 ms/프레임의 프레임 속도로 획득한 뉴런 신호의 전파를 보여줍니다. 흥분은 530 nm이고 방출은 >590 nm이었다. (B) 5 x 5 x 5 두 번의 3차원 가우시안 커널을 적용한 후 동일한 데이터. (C, D) 대표적인 픽셀의 광 신호 의 트레이스 [각 2 픽셀 (36 μm) CA1의 중간에 라인을 따라 A의 사각형에 도시되어, * 계층 피라미드에 픽셀을 나타낸다] A와B에 도시 된 데이터에서 ( E) 중첩 된 신호에서 C 및 D. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 마우스와 쥐 해마 조각 사이의 광 신호의 비교. 마우스(A) 및 랫트(B) 해마 슬라이스의 CA3/CA1 경계 근처의샤퍼 부수적통로의 전기 자극시 대표적인 연속 이미지. 비디오 1은 마우스 해마 슬라이스를 보여주고 비디오 2는 랫트 해마 슬라이스를 나타낸다. 지층 피라미드(st. pyr.) 및 지층 라디에이터움(st. rad.)에서 CA1의 중간에 있는 광 신호의 시간 과정은 도면의 오른쪽에 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 최종 mM | 무게 | |
| NaH2PO4 • 2H2O | 1.25 mM | 3.90 g |
| MgSO4•7H2O | 2 mM | 9.86 g |
| KCl | 2.5 mM | 3.73 g |
| H2O를 추가하여 50 mL |
표 1: 스톡 A.
| 최종 mM | 무게 | |
| MgSO4•7H2O | 2 mM | 12.32 g |
| H2O를 추가하여 50 mL |
표 2: 주식 B.
| 최종 mM | 무게 | |
| CaCl2•2H2O | 2 mM | 5.88 g |
| H2O를 추가하여 50 mL |
표 3: 주식 C.
| 최종 (mM) | 무게 | |
| Nacl | 124 mM | 7.25 g |
| 나코3 | 26 mM | 2.18 g |
| 포도 당 | 10 mM | 1.8 g |
| 스톡 A | 2.5 mL | |
| H2O의 약 950 mL를 추가하고 혼합 가스 (95 % O2/ 5 % CO 2)(10 분) | ||
| 스톡 C (CaCl2) | 2 mM | 2.5 mL |
| H2O를 추가하여 1,000 mL | ||
표 4: ACSF의 일일 준비.
| 최종 (mM) | 무게 | |
| 나코3 | 26 mM | 2.18 g |
| 자당 | 205.35 mM | 70.29 g |
| 포도 당 | 10 mM | 1.8 g |
| 스톡 A | 2.5 mL | |
| 스톡 B | 2.0 mL | |
| H2O의 약 900 mL를 추가하고 혼합 가스 (95 % O2/ 5 % CO 2)(10 분) | ||
| 스톡 C | 0.4 mM | 0.5 mL |
| H2O를 추가하여 1,000 mL | ||
표 5: 수정된 ACSF(절삭 용액).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
슬라이스 생리학은 올바른 신호를 수집하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜에서 링 멤브레인 필터 시스템을 사용하면 절차 2,16및17에서 슬라이스가 건강하고 왜곡되지 않은 상태로 유지됩니다. 다른 시스템은 기록 하는 동안 슬라이스 생리학을 유지 하는 데 사용할 수 있습니다., 하지만 이미징 건강 한 슬라이스의 모든 부분을 필요로 하는 슬라이스는 언제 든 지 변형 되지 않아야. 링 멤브레인 필터 시스템은 필요한 염색 용액의 부피를 최소화하는 데 도움이하므로 염색에도 좋습니다. 시간 분획에 대해 낮어야 하므로 여기 빛의 강도를 제어하는 것도 중요합니다. 연속 조명은 시편을 손상시킬 수 있습니다. 따라서 셔터를 적절히 사용해야 합니다.
VSD의 독성은 종종 29논의되었지만, 염료 농도, 여기 광 강도 및 빛에 대한 노출 기간의 비선형 증식의 결과이다. 이 프로토콜에 표시된 염색 절차는 필드 전위 기록의 입력 출력 관계 및 장기 potentiation (LTP), 쌍 -펄스와 같은 슬라이스의 생리적 매개 변수에 측정 가능한 변화를 일으키지 않았습니다. 촉진 (PPF). 슬라이스 생리학의 열화는 특히 연속조명(16)에서상당한 치수이지만, 현장 전위를 모니터링함으로써 관리될 수 있다. 이러한 예방 조치를 사용하여, 우리는 최고의 컨디셔닝 시험관 내 실험에 필적하는 12 시간24이상 에 대한 VSD를 사용하여 연속 광학 기록으로 LTP를 기록 할 수 있습니다.
녹화 하는 동안 에어 테이블 유용할 수 있습니다., 하지만 다른 장치에서 절연 광학의 낮은 배율 때문에 허용 해야 합니다. 그러나, 기계적 소요는 나쁜 화상 진찰의 뒤에 중요한 원인의 한개입니다. 이미지에서 상당한 양의 거짓 신호가 물체의 가장자리에 반대 표지판으로 구성되는 경우 밝기의 차이는 기계적 장애로 인해 가장 많이 발생합니다. 시편과 유체의 움직임은 운동 소음의 가장 빈번한 원인이므로 피하거나 최소화해야합니다.
VSD 신호(광도의 분수 변화)는 작습니다(초기 형광의10-3 ~ 10-4). 이러한 작은 변화를 감지하기 위해 형광은 광자 촬영 노이즈의 효과를 극복하기 위해 시간의 분수에서 검출기에서 105 ~ 10광자를 초과해야합니다. 더욱이, 뉴런 활동을 따르기 위해, 프레임 속도는 kHz 범위 주위와 같은 전기 생리학적 기록을 수행하는 데 필요한 시간 상수에 가깝게, 빠르게 되어야 한다. 이 2개의 조건의 조합은 형광 화상 진찰의 그밖 종류 보다는 훨씬 더 광대한 형광의 양을 요구합니다. 이것은 전체 광학에 있는 높은 수치 개구를 요구하고, 일반적인 현미경은 최상 선택이 아닙니다. 그림4와 같이 더 큰 동공과 조리개가 필요합니다.
리코딩 시스템은 더 큰 광자 깊이, 빠른 프레임 속도 및 낮은 노이즈와 일치해야 합니다. 선택은 주로 신경 시스템의 속도에 따라 달라집니다. 해마 신호 변환과 같은 빠른 신호는 특수한 초고속 저잡음 시스템이 필요합니다. 그러나, 피질에 있는 활동의 느린 퍼짐과 같은 느린 신호는 일반적인 그러나 과학적인 급료 카메라를 사용하여 검출될 수 있습니다.
광원의 선택도 중요합니다. 빛의 선택은 강도, 안정성 및 조명 영역에 따라 달라집니다. 저배율 광시야 이미징의 경우 아크및 레이저와 같은 점 광원을 확장해야 하므로 이러한 소스를 사용하기가 어렵습니다. 수은 및 제논 램프와 같은 아크는 밝은 광원이지만 일반적으로 안정적이지 않습니다. 그러나, 제논 빛의 최근 개발은 문제를 극복 할 수 있습니다. 할로겐 램프는 안정적이며 넓은 시야 이미징과 쉽게 일치할 수 있는 필라멘트의 더 큰 영역을 가지고 있지만, 특히 530 nm의 강도가 제한됩니다. 최근 전력 LED의 개발로 인해 잠재적인 광원으로 사용할 수 있었지만 온도 의존성 으로 인해 피드백 안정제가 있어야 합니다. 레이저를 사용할 수 있지만 높은 일관성으로 인해 반점 잡음이 발생하며, 이는 일반적으로 광시야 이미징에서 허용되지 않습니다.
이 문서에 제시된 VSD 이미징 프로토콜은 나머지 조건에 대한 값을 측정합니다. 멤브레인 전위절대 측정은 현재 기술을 사용하여 수행할 수 없습니다. 비율 측정 및 형광 수명 측정은 절대 멤브레인 전위를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
낮은 배율에서 VSD로 대량 염색된 뇌 슬라이스의 이미징은 뇌의 미세 회로 상호 작용에서 서브 임계막 전위 변화를 입증할 수 있습니다. 실시간 해상도에서 마이크로 회로 사이의 연결에 관한 이러한 기능 범위는 뇌 연구의 많은 분야에서 유용 할 것이다, 특히 이러한 흥분성 및 억제 기능에 의해 발생하는 병리학 적 측면을 분석하기 위해 다른 뇌 영역 사이의 연결. 이 응용 프로그램은 신경 정신 질환의 특정 유형과 관련된 신경 회로의 변화를 조사하는 것이 중요 할 것이다30,31,32.
유전적으로 인코딩된 전압 표시기33,34의 개발은 신경의 세포 유형 별 분석의 매력적인 응용을 위한 길을 열어줄 광학 막 전위 기록의 미래 방향입니다. 회로 수준 이벤트.
특히 광시야 기능 연결을 시각화하기 위해 광학 을 개선할 여지가 많이 있습니다. 당사의 새로운 공초점 광학35는 VSD 신호의 고속 및 고속 S/N 비율 레코딩을 가능하게 합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
TT는 JSPS 카켄히 그랜트 (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K00038, JP15K00413) 및 후생노동성(MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] 및 H30 [1806216])의 보조금. 우리는 영어 편집에 대한 편집 (www.editage.jp)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R.
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W.
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
