Summary
Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri için tekrarlanabilir ve istikrarlı bir optik kayıt yöntemi sunuyoruz. Bu yazıda konvansiyonel hipokampal dilim preparatları kullanılarak voltaj duyarlı boya boyama ve optik sinyallerin kaydedilmesi açıklanmaktadır.
Abstract
Beyin dilim preparatlarının geniş alan tek foton voltajı duyarlı boya (VSD) görüntülenmesi, nöral devrelerde fonksiyonel bağlantı değerlendirmek için yararlı bir araçtır. Işık sinyalinde fraksiyonel değişiklik nedeniyle, bu yöntemi bir nicel tahlil olarak kullanmak zor olmuştur. Bu makalede, özel optik ve dilim işleme sistemleri, bu tekniği istikrarlı ve güvenilir hale açıklar. Bu makalede, dilim işleme, boyama ve VSD lekeli hipokampal dilimleri ayrıntılı olarak kaydedilmesini gösterir. Sistem uzun süre fizyolojik koşulları korur, iyi boyama ile, ve kayıtlar sırasında dilim mekanik hareketlerini önler. Dahası, küçük bir miktar boya ile dilimlerin boyama sağlar. Optik, 100 piksel x 100-piksel uzamsal çözünürlüğe sahip, 10 kHz maksimum kare hızında VSD sinyalinin kaydedilmesine olanak sağlayan düşük büyütmede yüksek sayısal diyaframı elde edilir. Yüksek kare hızı ve uzamsal çözünürlüğe bağlı olarak, bu teknik, nöral devrelerdeki değişiklikleri değerlendirmek için yeterli sinyal-gürültü oranı sağlayan kayıt sonrası filtrelerin uygulanması sağlar.
Introduction
Geniş alan tek foton voltaj duyarlı boya (VSD) toplu lekeli beyin dilim preparatları görüntüleme nöral devrelerin dinamiklerini değerlendirmek için yararlı bir nicel aracı haline gelmiştir1,2,3,4 . Membran uyarma5,6,7, VSD görüntüleme nedeniyle optik özelliklerdeki değişikliklerin analizinden sonra ilk olarak 1970 ' lerin başında Cohen ve diğerleri tarafından tanımlanmıştır6,8, 9.; boya doğrudan membran potansiyel değişiklikler (yani, nöronların birincil sinyali) problar gibi gerçek zamanlı olarak beyin fonksiyonlarını izlemek için uygun bir yöntemdir.
İlk VSDs beyin sistemi anlamak için arzu edilen özelliklere sahip, gibi hızlı bir zaman sabit nöronal membran potansiyel olayların hızlı kinetiği takip etmek, ve membran potansiyelinin değişikliği ile doğrusallık9, 10 ' dan fazla , 11 ' i , 12 tane , 13 ' ü , 14 , 15. diğer görüntüleme deneylerine benzer şekilde, bu teknik, istenilen sonuçları başarmak için kameralar, optik, yazılım ve dilim fizyolojisi gibi geniş bir yelpazede özel ayarlamalar gerektirir. Bu teknik tuzaklar nedeniyle, ilk çabaları sırasında beklenen faydaları mutlaka bu teknikte uzmanlaşmadı laboratuvarların çoğu için gerçekleştirmez.
Teknik zorluk ilkel nedeni, dilim preparatlarının toplu boyama uygulandığında membran potansiyel değişim doğru VSD düşük duyarlılığı oldu. Optik sinyal büyüklüğü (yani, floresan fraksiyonel değişim) genellikle 10-4-10-3 kontrol (F0) fizyolojik koşullar altında sinyal. Bir nöron membran potansiyel değişim zaman ölçeği yaklaşık milisaniyeye kadar birkaç milisaniye. Neuron membran potansiyelinin değişikliklerini ölçmek için, kayıt için kullanılan kamera yüksek hızda (10 kHz-100 Hz) görüntüleri elde edebilmek gerekir. VSD 'nin düşük duyarlılığı ve sinir sinyalini takip etmek için gereken hız, yüksek bir sinyal-gürültü oranı (S/N)2,16ile yüksek hızda fotoğraf makinesinde toplanan büyük miktarda ışık gerektirir.
Kayıt sisteminin optik yeterli ışık toplama ve S/N geliştirmek için de kritik bir unsurdur. Optik tarafından elde edilen büyütme genellikle aşırı düşük, 1X gibi 10X, yerel fonksiyonel nöral devre görselleştirmek için. Örneğin, hipokampal devresinin dinamiklerini görselleştirmek için yaklaşık 5 ' in büyütme uygun olacaktır. Bu kadar düşük büyütme düşük floresan verimliliğine sahiptir; Bu nedenle, gelişmiş optik bu tür kayıt için yararlı olacaktır.
Buna ek olarak, dilim fizyolojisi de esastır. Görüntüleme analizi dilimlerin bozulmamış olmasını gerektirdiğinden, dikkatli dilim işleme17gereklidir. Ayrıca, daha uzun bir süre için dilim canlılığı korumak için alınan önlemler önemlidir18.
Bu makalede dilimler, VSD boyama ve ölçümler hazırlanması için protokol açıklanmaktadır. Makale Ayrıca VSDs, görüntüleme aygıtı ve optik geliştirmeleri ve diğer ek geliştirmeler için bu yöntemi etkin bir basit, güçlü ve nicel tahlil olarak kullanılmak üzere etkinleştirmiş deneysel sisteme özetliyor beyin fonksiyonlarının değiştirilmesi19,20,21,22,23,24,25. Tekniği de yaygın hipokampal dilimleri CA1 alanında uzun vadeli potansiyasyon için kullanılabilir1. Dahası, bu teknik aynı zamanda tek bir sinir hücresi26membran potansiyelleri optik kayıt yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Tokushima Bunri Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış protokollere göre yapılmıştır. Dilim hazırlama için aşağıdaki protokol neredeyse standart bir prosedür27 , ancak değişiklikler VSD ile boyama ve kayıt protokolleri olmuştur.
1. deneme gününden önce hazırlık
- A (Tablo 1), hisse senedi B (Tablo 2) ve hisse senedi C (Tablo 3) çözümleri ve bir buzdolabında saklamak stok hazırlayın.
- Hazırlamak 1 L Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) (Tablo 4, adım 3 bakın) ve buzdolabında tutmak.
- 1 L modifiye ACSF (Tablo 5) hazırlayın ve buzdolabında tutun.
- 2 ml 'lik şişelerin içinde fetal sığır serumu (FBS) ve bir dondurucu içinde depolar 500 μL plakaya dispense.
- Bir mikrodalga içinde ACSF (CA. 120 mL) içinde agar tozu% 4 çözülür ve bir 90 mm tek kullanımlık Petri çanak dökün. Agar plaka daha fazla kullanmadan önce soğutulmuş olmalıdır.
- Deneyden bir gün önce bir dondurucu içine aşağıdaki öğeleri yerleştirin: bir cerrahi tepsi, bir dilimleyici konteyner ve alüminyum soğutma bloğu (120 x 120 x 20 mm3).
- Dilim işleme sistemi için membran filtreleri ile yeterli Pleksiglas yüzük olduğundan emin olun17,28 (bkz. Adım 6,12).
- Bir mikrodalga içinde 3 M KCl 50 mL 'de agar tozu% 2 çözülür. Topraklama elektrot için bir mikropipet kullanarak 200 μL ipuçları içinde sıcak agar-KCl disçözücüsü 85 μL civarında alın. Ucu hala sıcak agar 3 M KCl jel ayırın. % 2 agar ile 20-40 ipuçları hakkında doldurmak için adım tekrarlayın.
2. VSD (di-4-ANEPPS) stok çözümünün hazırlanması
- Hazırlamak 1 mL 10% polietokilated Hint yağı çözeltisi ile ultra-saf su.
- 1 mL bir şişe di-4-ANEPPS (5 mg şişe), Vortex ve 10 dakika sonikat için etanol ekleyin. Çözüm, di-4-ANEPPS kristallerinin olası küçük kalıntıları ile derin kırmızı bir renge dönüşür.
Not: Bu adımda kullanılan etanol taze açılmalıdır. - Çözümü, O-Ring ile 2 mL 'Lik bir mikrotüpe aktarın. Eriyik aşağı spin ve eklemek 500 μL% 10 poliokilated Hint yağı çözeltisi.
Not: Boya çok lipophilic olduğunu. Dmso ve Poloksamer aynı zamanda dı-4-anepps çözülür ancak membran potansiyelinin değişmesi üzerine optik sinyal açısından da kullanılabilir, biz etanol-poliokilated Hint yağı kullanımı gürültü oranı daha iyi bir sinyal verir bulundu. Bu hücre membranı için solvent transfer oranı ile ilgili olabilir. - Girdap ve boya tamamen çözünmüş kadar sonikat.
- Işığa maruz kalma kaçının ve bir buzdolabında tutun. Dondurucuda saklama. Stok birkaç ay sürebilir.
Not: Deneme gününde 3-9 adımlarını izleyin.
3. ACSF günlük hazırlanması (1 L) (Tablo 4)
- NaCl, NaHCO3ve glikoz bir Flask ağırlığında.
- 950 mL damıtılmış su ile Flask ekleyin ve 95% O2/5% Co2 Gas ile kabarcıklanma başlar.
- 2,5 mL stok Ekle Flask bir çözüm ve oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca inkük.
- 2,5 mL stok C çözeltisi Flask ekleyin.
- 1 L çözüm yapmak için distile su ekleyin.
4. boyama VSD Ssolution günlük hazırlanması
- 500 μL FBS ve VSD stok solüsyonu (adım 2) bir ultra-sonicator içinde 5 dakika boyunca sonikat.
- FBS şişe içine taze hazırlanmış ACSF 500 μL ekleyin.
- 20 (fareler durumunda) veya 40 (fareler durumunda) μL VSD stok çözeltisi şişeye ekleyin.
- Ultra-sonikat ve çözüm kadar şişenin girdap soluk turuncu olur.
5. cerrahi hazırlığı
- 300 mL paslanmaz çelik konteyner, bir 300 mL Beaker ve plastik bir kap içinde ayrı olarak soğutulmuş ACSF 100 mL alın ve bir dondurucuya yerleştirin. Dökün 150 ml soğutulmuş değiştirilmiş acsf (Tablo 2) başka bir kabı ve dondurucuya yerleştirin. Çözümler soğutulmuş kadar bekleyin; alınan süre ölçülmeli ve önceden belirlenmelidir.
- Fold bir jilet kırmak için (karbon çelik, endüstriyel sınıf 0,13 mm kalınlığında, her iki tarafta bıçak) dilimleyici için yarım.
Not: Diğer yarısı uygun bir bıçak tutucu ile diseksiyon için kullanılabilir. - Bir ayar jig ile ACSF 4% agar plaka bir blok hazırlayın (Şekil 1).
- Beyin dilimlerini fizyolojik olarak canlı tutmak için nemli bir kuluçl odası (arayüz tipi oda; modifiye 1,2 ı silikon Ambalajla sıkı mühürlü kutu) hazırlayın (Şekil 2); 95% O2/5% Co2 Gas ile küçük bir konteyner ve karbonat acsf ekleyin ve üst için acsf ile bir 90 mm x 20 mm Petri çanak doldurun.
Not: Daha küçük bir petri tabağı (60 mm x 20 mm), çanak üzerinde bir filtre kağıdı desteklemek için 90 mm çanak ortasına yerleştirilmelidir. - Kutuyu bir Isıtma cihazına koyun ve 28 °C ' ye kadar ısıtmak için 20 dakika bekleyin.
- Dilimleyici konteyner içine ezilmiş buz ekleyin. Aşağıdaki aletleri buzda paslanmaz çelik bir KDV (küçük) olarak yerleştirin: neşter, bıçak tutucu, halka cımbız, agar bloğu ve Dilimleyici bir aşama. 95% O2/5% Co2 Gas (aka. karojen) ile buz ve balon üzerinde dondurulmuş ACSF ve modifiye acsf tutun.
- Aşağıdaki aletleri bir KDV (büyük): makas (büyük, küçük), cımbız, bir spatula, bir kaşık ve diyagonal pense yerleştirin.
6. cerrahi (fareler)
- Bir duman kaputu Isoflurane kullanarak fareyi anestezize. Ayak tutam üzerine hayvanın pedal refleks kontrol ederek anestezi seviyesini değerlendirmek.
- Faresi batırın ve kafası buz gibi soğuk ACSF 'e paslanmaz çelik cerrahi tepsiye daldırın.
- 1 dakika içinde beyin ayıklamak ve 5 dakika boyunca soğutulmuş acsf içeren bir kabı yerleştirin.
- Beyninizi kabı 'dan çıkarın ve bir neşter kullanarak beyin bloğunu kırpın (Şekil 3A).
- Beyin bloğunu% 4 agar bloğu üzerine yerleştirin (adım 5,3, Şekil 3B). Her iki yarımküre de bir agar bloğuna monte edilebilir. Aşırı ACSF 'i bloktan filtre kağıdıyla silin.
- Dilimleyici tablosuna ince yapıştırıcı (Süper Tutkal) uygulayın. Agar bloğu üzerine yerleştirin ve bir filtre kağıdı kullanarak aşırı yapıştırıcı silin.
- Yavaşça beyin-agar bloğunun üst kısmındaki bir pipet kullanarak buz-soğuk ACSF (~ 5 mL) küçük bir miktar uygulayın. Bu aşırı süper tutkal sağlamlaştırmak ve beyin kapsayan ve dilimleme rahatsız tutkal önlemek yardımcı olacaktır.
- Dilimleyici tepsisine (Şekil 3c) Dilimleme tablosunu düzeltin ve değiştirilmiş acsf dökün.
- Dilimleyicisini en fazla bıçak frekansı ile yavaş bir hızda ayarlayın.
- Dilim kalınlığını 350-400 μm olarak ayarlayın ve dilimleme başlatın (Şekil 3c). Dilimleri, dilimlerin derinliğinin kolayca ayırt edilebilmek için bir sırayla dilim tepsisinin köşesine yerleştirin. Genellikle üç ila beş dilim bir yarımküden elde edilebilir.
- 30 G iğne kullanarak beyin kökü kısmını kesip (şekil 3D).
Not: Eğer gerekirse, bir dürbün mikroskop altında bu aşamada CA3-CA1 sınırı arasında bir kesim gibi beyin dilimi üzerinde mikrocerrahi yapılmalıdır. - Küçük uçlu bir boya fırçası kullanarak, dilim pleksiglass halkası17 (15 mm dış çapı, 11 mm iç çapı, 1 mm kalınlığı, Şekil 3e) ile tutulan membran filtresinin (0,45 ΜM gözenekleri, PTFE-membran, 13 mm çapında) ortasına yerleştirin. Halkası nemli kurtarma odasına yerleştirin (Şekil 2) ve iç basıncı yüksek tutmak için kapağı sabitleyin.
Not: Dilimlerde membran 30 dakika içinde yapışacak ve kayıt odasında sonraki adımlarda yüzüklerle ele alınabilir. Dilim yerinde tutmak için ağırlık veya diğer önlemleri kullanmak için gerek yoktur. - İyi merkezli ve tutarlı bir yönde olduğundan emin olmak için yüzük dilimi yönünü ve konumunu ayarlayın (bkz. Adım 9,3).
- Numuneyi 30 dakika boyunca 28 °C ' de, sonra da dilimlerin kurtarılması için oda sıcaklığında en az 10 ila 30 dakika bırakın.
Not: Dilim şimdi en az 15 h için iyi bir fizyolojik durum koruyabilirsiniz.
7. dilimlerin boyama ve durulama (fareler)
- Boya çözeltisi 100-110 μL 'i (adım 4), bir mikropipet kullanarak halka üzerindeki her dilim üzerine hafifçe uygulayın. 8 ila dokuz dilim, 4. adımda hazırlanan bir boyama çözümüyle lekelenebilir. Dilimleri boyama için 20 dakika bırakın.
- Bir konteynır 50-100 mL ACSF hazırlayın ve boyama çözümünü durulamak için halkası dilimlenmiş numuneye yerleştirin.
- Durulama dilimi başka bir kuluçka odasına saklayın. Deneyden önce kurtarma için 1 h 'den fazla bekleyin.
Not: Kuluçta odası gazdan ayrılabilir ve sıkı mühürlü bir durumda kayıt yerine taşınmış olabilir. Dilim gaz kaynağı olmadan en az 20 dakika canlı kalabilir. Bu durum, dilimi kayıt için başka bir yere taşımanız gerektiğinde yararlıdır.
8. deneysel cihazların günlük hazırlanması
- Amplifikatör, bilgisayar ve kamera sistemini açın ve yazılımın çalıştığını kontrol edin.
- Bir 50 mL tüp ve kabarcık kargengen ile yer ACSF.
- ACSF dolaşmak için bir peristaltik pompa kullanın. Akış hızını yaklaşık 1 mL/dak olarak ayarlayın.
- Emme Pipetinin yüksekliğini, deney odasının içindeki sıvı seviyesinin her zaman sabit olması için ayarlayın.
Not: Çözümün düzeyi istikrarlı bir kayıt elde etmek için önemlidir, bu nedenle, ayarlama bir Mikromanipülatör kullanılarak yapılmalıdır. - 3 M KCl agar (% 2) ile dolu sarı yongalı zemin elektrot yükleyin (adım 1,8), az miktarda 3 M KCl çözeltisi olan bir Ag-AgCl kabloyla bir tutucuya yerleştirin.
- Küçük bir miktarda acsf (hacminin yaklaşık iki üçte birini) cam elektrot (1 mm dış çapı, 0,78 mm iç çapı bir mikropipet çektirme ile çekilen) içine konik ince tüplü sarı ucu kullanarak doldurun ve elektrot tutucusuna yerleştirin.
- Tutucuyu manipülatöre takılı olan ÇUBUKa takın. Elektrot direnci yaklaşık 1 MΩ olduğu bir amplifikatör kullanarak emin olun.
Not: Uzun şaft geniş açılış (4-8 μm açılış) yama tipi elektrot alan kaydı için iyi olmalıdır ve uyarıcı bir elektrot olarak.
9. kayıt oturumu başlatılıyor
- Nemli odasından forseps ile bir dilim hazırlama alın.
- Dilimi hızlı bir şekilde mikroskop altındaki deneysel bir odaya yerleştirin (Şekil 4).
- Halka kenarına sıkıca silikon O-Ring içine itin. Membran veya deney odasının alt kırmak için dikkatli olun.
Not: Dilimin yönü, görüş alanında uyarıcı ve kayıt elektrotlarının yönüne göre dikkate alınmalıdır. Sağlıklı dilim, ağırlık ve naylon kafes gibi dilimleri düzeltmek için diğer cihazları kullanmaya gerek kalmamak için membran filtresine yapışmalıdır. - Uyarıcı elektrot ve alan potansiyel kayıt elektrot ucunu aktarılan ışık ile mikroskop altında dilim üzerine yerleştirin.
- Yanıtı kontrol etmek için elektrofizyolojik kayıt sistemini kullanın. Verilen konfigürasyona sahip her zamanki (lekesiz) elektrofizyolojik kaydı onaylayın.
Not: Kayıt elektrot atlanabilir ama dilim fizyolojisi kontrol etmek yararlıdır. - 5 adet su daldırma objektif objektif ve 1x PLAN APO tüp lensi ile 10 kHz 'de örnekleme yaparken numunede 13-15 mW/cm2 ' ye karşılık gelen kameranın maksimum kapasitesinin% 70-80 ' üne uyarma ışık yoğunluğunu ayarlayın. Uyarma ışık dalga boyu 530 nm ve emisyon filtresi 590 nm > olmalıdır.
Not: Uyarma ışığı miktarını en aza indirmek için bir deklanşör kullanın. Sürekli ışık pozlama dilim fizyolojisi bozulabilir. Işığın olası zararlı etkisi ışığın yoğunluğuna ve süresine bağlıdır. Işığın etkisini değerlendirmek için elektrofizyolojik kayıt kullanın. 13-15 mW/cm2mukavemeti durumunda, yaklaşık 1 s pozlama toleransı üst sınırı olmalıdır. - Odak dalga boyunda bağlı olarak farklı olabilir ve edinme başlatmak çünkü floresan ışık kaynağını kullanarak edinme sistemi ile odağı ayarlayın.
- Görüntü edinme yazılımında verileri inceleyin.
Not: Ayrıntılı analiz için sayısal analiz yazılımının orijinal mikroprogramlama paketini kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 5 , bir fare hipokampal DILIMININ CA1 bölgesinde Schaffer teminatın elektrik stimülasyon üzerine temsili optik sinyali gösterir. Şekil 5A 'daki ardışık görüntüler, uzamsal ve temporal filtreler uygulanmadan önce optik sinyali gösterirken, Şekil 5B 5 x 5 x 5 Kübik filtre (Gauss çekirdeği konvolüsyonu, 5 x 5 uzamsal-ve 5 ' e kadar) uygulandıktan sonra aynı verileri gösterir Geçici boyut) iki kez. Yüksek kare hızı (0,1 MS/Frame) ve yüksek uzamsal çözünürlük (100 piksel x 100 piksel) nedeniyle, filtre uygulaması sinyali değiştirmez, ancak gürültüyü filtreleyip, aynı zamanda tek bir deneme cinsinden piksel cinsinden kaydedilen zaman kursunda da görülebilir ( Şekil 5C, filtre yok; Şekil 5D, filtreyle; ve Şekil 5E, üst üste).
Şekil 6 , fare (Şekil 6a) ve sıçan (Şekil 6B) ARASıNDAKI hipokampal dilimin CA1 alanındaki tipik yanıtı karşılaştırır. Şekilde belirgin olduğu gibi, inhibitör girişleri nedeniyle hiperpolarize yanıt CA1/CA3 sınırında Schaffer teminat aynı uyarıcı uygulayarak üzerine sıçan hipokampal dilim belirgindir. Küçük hiperpolarizasyon yanıtı CA1 distal tarafında gözlenen sonra 24 ms fare hipokampal dilim, ama daha büyük hiperpolarizasyon yanıtı sıçan hipokampal dilim depolarizan yanıtı aldı. VSD görüntüleme açıkça fare ve sıçan hipokampal dilimleri arasındaki farkı gösterebilir.
Şekil 1 : Dilimleme için beyin dokusu monte etmek için kullanılan agar blok bir çizim ve blok yapmak için bir jig. (A) beyin bloğu ve% 4 agar bloğu (B) bir şematik Illustration. (C, D) Bir Plexiglass plaka tarafından yapılan ayarlanabilir bir jig fotoğraf (5-mm kalın her) agar blok yapmak. Agar bloğunu hazırlarken, üst ve alt plakalar D 'de gösterildiği gibi yığılmış olmalıdır (E) uzun ince yuvalara bir bıçak takarak (1) ve (2), üçgen kısmı kesilir, yuva (3) bloğun tüm derinliğini kırpmak için kullanılır. (4) üst plaka kaldırılması gerekli olmayan parçaların Dilimleme sağlar. 1 ve 2 No 'lu yuvayı kullanarak, bloğun (A) ve (B) içinde gösterildiği gibi sadece 5 mm derinlikte kesim yapın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Dilim fizyolojisini korumak için kullanılan arayüz tipi kulyatan odanın bir çizimi. (A) sisteme genel bakış. (B) iç mekan detayları. (C) kurtarma odasının Illustration. Numune, ACSF dolu 90 mm ve 60 mm Petri tabağı üzerine yerleştirilmiş bir filtre kağıdına yerleştirilmelidir. İkinci yemek filtre kağıdı desteklemektir. Yemekler ve ACSF köpürme kabı, pleksiglas plakalı bir yerde tutulur. Filtre kağıdı hava geçirmez kutu veya konteyner duvara dokunmamalıdır. Hava, odada nemlendirilmiş gazlar içeren bir köpürme şişesi aracılığıyla sağlanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Bir fare beyninden Hippocampal dilim preparatları. (A) izole fare beyni önce kesikli çizgi (a), sonra (b) kesilmelidir. Son olarak, kesme hattı (c) boyunca yapılmalıdır. Kesilmiş alttan dik olmalıdır. (B) beyin bloğu bir agar bloğuna monte edilmelidir. (C) agar bloğu dilimleyiciye yerleştirilmelidir. (D) elde edilen dilim. Aşırı doku kesikli hattan kesilmelidir. (E) dilim pleksiglass tutucu ile membran filtresinin ortasına yerleştirilmelidir (dış çap 15 mm, iç çapı 11 mm, PTFE membran filtresi 13 mm). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Dilim preparatlarının optik sinyalleri Için kayıt sistemi. (A) mevcut yazıda dilimleri görüntü için kullanılan mikroskop bir fotoğraf. Optik objektif bir lens (5x NA 0.60), dikhrotik filtre (580 Nm) için bir ayna kutusu ve bir projeksiyon (tüp) lens (PLAN APO x 1.0) oluşur. Yüksek hızlı kamera, projeksiyon merceğinin üst kısmına c-mount ile takılır. Orada gözlem için başka bir normal USB kamera. Uyarma ışığı fiber optik kullanılarak tanıtıldı. (B) ayna kutusu ile uyumlu lenslerin fotoğrafı. (C) kayıt sisteminin Şematik diyagramı. Görüntüleme sistemi ve elektrofizyolojik kayıt sistemi bir PC ile kontrol edilir. Işık kaynağı olarak fotoğraf diyot geri besleme kontrol sistemi ile LED aydınlatma sistemi kullanılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Tek bir deneme içinde bir fare hipokampal dılımı CA1 alanında temsilcisi optik sinyal. (A) ardışık görüntüler herhangi bir uzamsal ve temporal filtreler (her 0,2 ms) uygulamadan önce Schaffer teminat yolu boyunca 0,1 MS/çerçeve kare hızında elde edilen nöronal sinyal yayılması gösterir. Uyarma 530 nm ve emisyon > 590 nm idi. (B) üç boyutlu Gauss çekirdeğinin bir uygulamadan sonra aynı veriler 5 x 5 x 5 iki kez. (C, D) Temsili piksellerde optik sinyallerin izleri [her iki piksel (36 μm) CA1 ortasında bir çizgi boyunca bir kare gösterilir, * katman pyramidale içinde piksel gösterir] A ve B 'de gösterilen verilerden (E) üst üste gelen sinyal C ve D 'de optik sinyaller lütfen bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın .
Şekil 6 : Fare ve sıçan hipokampal dilimleri arasındaki optik sinyalin karşılaştırılması. Bir fare (a) ve sıçan (B) HIPOKAMPAL dilim CA3/CA1 sınırına yakın Schaffer teminat yolu elektrik stimülasyon üzerine temsili ardışık görüntüler. Video 1 fare hipokampal dilim ve video 2 fare hipokampal dilim gösterir gösterir. , CA1 'in ortasındaki optik sinyalin zaman-seyri (St. Pyr.) ve stratum radiatum (St. Rad.), figürün sağında gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
| Son mM | Ağırlık | |
| NaH2Po4 • 2H2O | 1,25 mM | 3,90 g |
| MgSO4• 7h2O | 2 mM 'Lik | 9,86 g |
| Kartal | 2,5 mM | 3,73 g |
| 50 mL yapmak için H2O Ekle |
Tablo 1: stok A.
| Son mM | Ağırlık | |
| MgSO4• 7h2O | 2 mM 'Lik | 12,32 g |
| 50 mL yapmak için H2O Ekle |
Tablo 2: stok B.
| Son mM | Ağırlık | |
| CaCl2• 2H2O | 2 mM 'Lik | 5,88 g |
| 50 mL yapmak için H2O Ekle |
Tablo 3: stok C.
| Final (mM) | Ağırlık | |
| Nacl | 124 mM | 7,25 g |
| NaHCO3 | 26 mM 'Lik | 2,18 g |
| Glikoz | 10 mM 'Lik | 1,8 g |
| Hisse senedi A | 2,5 mL | |
| Yaklaşık 950 mL H2O ve kabarcık karma gaz ile ekleyin (95% O2/5% Co2) (10 dak) | ||
| Stok C (CaCl2) | 2 mM 'Lik | 2,5 mL |
| 1.000 mL yapmak için H2O Ekle | ||
Tablo 4: ACSF günlük hazırlanması.
| Final (mM) | Ağırlık | |
| NaHCO3 | 26 mM 'Lik | 2,18 g |
| Sakaroz | 205,35 mM | 70,29 g |
| Glikoz | 10 mM 'Lik | 1,8 g |
| Hisse senedi A | 2,5 mL | |
| Stok B | 2,0 mL | |
| Yaklaşık 900 mL H2O ve kabarcık karma gaz ile ekleyin (95% O2/5% Co2) (10 dak) | ||
| Stok C | 0,4 mM | 0,5 mL |
| 1.000 mL yapmak için H2O Ekle | ||
Tablo 5: modifiye ACSF (kesme çözeltisi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dilim fizyolojisi doğru sinyali toplamak için hayati önem taşımaktadır. Bu protokolde halka membran filtre sisteminin kullanımı, dilimin sağlıklı kalmasını ve prosedür2,16,17boyunca bozulmasını sağlar. Diğer sistemler kayıt sırasında dilim fizyolojisini korumak için kullanılabilir, ancak görüntüleme, dilimin her parçası sağlıklı olması için gerektiğinde herhangi bir zamanda deforme olmamalıdır. Ring-membran filtre sistemi de boyama için daha iyidir, bu bize gerekli boyama çözeltisi hacmini en aza indirirken yardımcı olur. Aynı zamanda, zaman fraksiyonu ile ilgili olarak düşük olması gerektiği için, uyarma ışığının yoğunluğunu kontrol etmek de önemlidir. Sürekli aydınlatma numuneye zarar verebilir; Bu nedenle, deklanşöre uygun kullanımı gereklidir.
VSD toksisitesi genellikle görüşüldü29, ama boya konsantrasyonu doğrusal olmayan çarpma sonucu, uyarma ışık yoğunluğu, ve ışığa maruz kalma süresi. Bu protokolde gösterilen boyama prosedürü, alanın potansiyel kayıtların giriş-çıkış ilişkileri ve uzun vadeli potansiyelasyon (LTP), eşleştirilmiş-darbe gibi dilimin fizyolojik parametrelerinde ölçülebilir değişikliklere neden olmadı kolaylaştırma (PPF). Dilim fizyolojisinin bozulması, özellikle sürekli aydınlatma16altında büyük boyutlanabilir, ancak alan potansiyelini izleyerek yönetilebilir. Bu önlemleri kullanarak, LTP 'yi 12 saat24' ten fazla VSD kullanarak sürekli optik kayıt ile kaydedebilir ve bu da en iyi şartlı in vitro deneylerle karşılaştırılabilir.
Kayıt sırasında, hava masası yararlı olabilir, ancak optik düşük büyütme nedeniyle diğer cihazlardan yalıtım izin verilmelidir. Ancak, mekanik bozukluklar kötü görüntüleme arkasındaki önemli nedenlerinden biridir. Görüntünün yanlış sinyal önemli miktarda nesnenin kenarında zıt işaretler oluşur, böylece parlaklık farkı, en büyük olasılıkla mekanik bozukluklardan kaynaklanır. Numune ve sıvının hareketleri, hareket gürültüsünün en sık nedenlerinden biridir ve dolayısıyla kaçınılmalıdır veya minimalize edilmelidir.
VSD sinyali (ışık yoğunluğunda fraksiyonel değişim) küçük (ilk floresan 10-3 -10-4 ). Böyle küçük bir değişikliği algılamak için, floresan, foton-shot gürültüsünün etkisini aşmak için zaman kesitinde dedektörde 105 -106 fotonları aşmalıdır. Ayrıca, nöronal aktivite takip etmek için, kare hızı, kHz aralığında gibi elektrofizyolojik kayıt gerçekleştirmek için gereken zaman sabitleri yakın hızlı olmalıdır. Bu iki şartın bir kombinasyonu, Diğer Floresan görüntüleme türlerinden çok daha geniş olan floresan miktarını gerektirir. Bu tüm optik yüksek sayısal diyafram gerektirir, ve her zamanki mikroskop en iyi seçenek değildir. Şekil 4' te gösterildiği gibi daha büyük öğrenci ve diyafram gereklidir.
Recoding sistemi büyük foton iyi derinlik, hızlı kare hızı ve düşük gürültü ile eşleşmelidir. Seçim çoğunlukla nöral sistemin hızına bağlıdır. Hipokampal sinyal dönüştürücü gibi daha hızlı sinyal özel Ultra yüksek, düşük gürültü sistemi gerekir. Ancak, korseleler içinde aktivite yavaş yayılması gibi yavaş sinyal her zamanki ama bilimsel dereceli kameralar kullanılarak tespit edilebilir.
Işık kaynağının seçimi de önemlidir. Işığın seçimi yoğunluğu, stabilitesi ve aydınlatma alanına bağlıdır. Düşük büyütme geniş alan görüntüleme durumunda, yaylar ve lazerler gibi nokta ışık kaynağı genişletmek gerekir, bu kaynakları kullanmak zorlaştırır. Cıva ve Xenon lambaları gibi yaylar, parlak ışık kaynağıdır, ancak genellikle istikrarlı değildir. Ancak, Xenon ışığın son gelişimi sorunun üstesinden gelebilir. Halojen lamba istikrarlı ve kolayca geniş alan görüntüleme ile maç olabilir filament daha büyük bir alanı vardır, ancak özellikle 530 nm mukavemeti sınırlıdır. Güç LED son gelişimi potansiyel ışık kaynağı olarak kullanmak için bize sağladı, ama Sıcaklık bağımlılığı nedeniyle geri besleme stabilizatörü olması gerekir. Lazerler kullanılabilir ama yüksek tutarlılık, genellikle geniş alan görüntüleme için kabul edilemez olan bir lekeli gürültüde sonuçlanır.
Bu makalede sunulan VSD görüntüleme protokolü, dinlenme koşuluyla göreli olarak bir değeri ölçer. Membran potansiyelinin mutlak ölçümü geçerli teknik kullanılarak yapılamaz. Mutlak membran potansiyelleri değerlendirmek için onay ve floresans ömür ölçümleri kullanılabilir.
Düşük büyümede VSD ile toplu olarak lekelenmiş beyin dilimlerinin görüntülenmesi, beynin mikro devre etkileşimlerinde alt eşik membran potansiyel değişikliklerini gösterebilir. Gerçek zamanlı çözünürlükte mikro devre arasındaki bağlantı ile ilgili bu tür işlevsel kapsam, özellikle böyle uyarıcı ve inhibitör fonksiyonel kaynaklanan patolojik yönlerini analiz etmek, beyin araştırma birçok alanda yararlı olacaktır farklı beyin alanları arasındaki bağlantıları. Bu uygulama nöropsikiyatrik hastalıkların belirli türleri ile ilgili nöral devrelerde değişiklikleri araştırmak için kritik olacaktır30,31,32.
Genetik olarak kodlanmış voltaj göstergesinin geliştirilmesi33,34 , hücre tipine özel sinirsel analizinin cazip uygulamaları için yol açacak optik membran potansiyel kayıtları için gelecekteki yöndür devre düzeyinde olaylar.
Özellikle geniş alan fonksiyonel bağlantılarının görselleştirilmesi için optik gelişmeler için çok fazla yer vardır. Bizim roman Konfokal optik35 VSD sinyal yüksek hızlı ve High-S/N oranı kayıt sağlayacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
TT, MEXT 'den JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 ve JP15K00413) ve sağlık, çalışma ve refah Bakanlığından (MHLW-Kagaku-ıppan-H27 [15570760] ve H30 [18062156]) alınan hibe aldı. Biz Ingilizce dil düzenleme için Editage (www.editage.jp) teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R. Opacity changes in stimulated nerve. The Journal of Physiology. 108 (3), 278-281 (1949).
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4 (1), srep05309 (2015).
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
