Summary
אנו מציגים שיטת הקלטה אופטית ויציבה לפרוסות מוח באמצעות צבע רגיש למתח. המאמר מתאר מכתים צבע רגיש מתח והקלטה של אותות אופטיים באמצעות הכנה היפוקמאל הפרוסות המקובלת.
Abstract
שטח רחב בודד פוטון בודדת צבע רגיש (VSD) הדמיה של ההכנות פרוסת המוח הוא כלי שימושי כדי להעריך את הקישוריות תפקודית במעגלים עצביים. עקב שינוי השבר באות האור, היה קשה להשתמש בשיטה זו כתוך שיטה כמותית. מאמר זה מתאר מערכות מיוחדות לטיפול באופטיקה ופרוסות, המתארות טכניקה זו ליציבה ולאמינות. המאמר הנוכחי ממחיש את הטיפול פרוסה, כתמים, והקלטה של פרוסות VSD מוכתם היפוקמאל בפירוט. המערכת שומרת על התנאים הפיזיולוגיים זמן רב, עם כתמים טובים, ומונעת תנועות מכניות של הפרוסה במהלך ההקלטות. כמו-כן, היא מאפשרת צביעת פרוסות בכמות קטנה של הצבע. האופטיקה להשיג צמצם מספרי גבוה בהגדלה נמוכה, אשר מאפשר הקלטה של האות VSD בקצב מסגרת מקסימלית של 10 kHz, עם 100 פיקסל x 100 פיקסל מרחבי רזולוציה. בשל קצב הפריימים הגבוה והרזולוציה המרחבית, טכניקה זו מאפשרת יישום של המסננים שלאחר ההקלטה, המספקים יחס מספיק של אות לרעש כדי להעריך את השינויים במעגלים העצביים.
Introduction
הדמיה של המוח הרחב במיוחד פוטון בודד צבע רגיש (vsd) דימות של מוכתם בצובר מוחית ההכנות לנתח הפך כלי כמותי שימושי כדי להעריך את הדינמיקה של מעגלים עצביים1,2,3,4 . לאחר ניתוח של שינויים במאפיינים אופטיים בשל עירור ממברנה5,6,7, הדמיה vsd תוארה לראשונה בשנות ה-70 המוקדמות על ידי כהן ואחרים6,8, 9.; זוהי שיטה מתאימה לפקח על פונקציות המוח בזמן אמת כמו הצבע ישירות בדיקה שינויים פוטנציאליים הממברנה (כלומר, האות העיקרי של הנוירונים).
VSDs המוקדמים ביותר היו המאפיינים הרצוי כדי להבין את מערכת המוח, כגון מהיר בזמן קבוע לעקוב אחר קינטיקה מהירה של אירועים פוטנציאליים קרום עצבי, ו יניאריות עם השינוי בקרום פוטנציאל9, מיכל עשור , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , מיכל בן 13 , מיכל בן 14 , 15. דומה לניסויים אחרים בדימות, טכניקה זו דורשת מגוון רחב של מינהור מסוים, כגון המצלמות, האופטיקה, התוכנה והפיזיולוגיה של הפרוסה, כדי להשיג את התוצאות הרצויות. בשל מלכודות טכניות אלה, היתרונות הצפויים במהלך המאמצים הראשוניים לא בהכרח התמחו עבור רוב המעבדות שלא המתמחות בטכניקה זו.
הגורם הראשוני של הקושי הטכני היה רגישות נמוכה של VSD לקראת שינוי פוטנציאלי הממברנה כאשר מיושם כתמים בצובר של ההכנות פרוסה. גודל האות האופטי (כלומר, השינוי החלקי בקרינה הפלואורסצנטית) הוא בדרך כלל 10-4-10-3 של השלט (F0) אות בתנאים פיזיולוגיים. סולם הזמן של שינוי פוטנציאלי של קרום בעצב הוא כ אלפיות שניה עד כמה מאות אלפיות שניה. כדי למדוד את השינויים בפוטנציאל הממברנה של העצב, המצלמה בשימוש עבור ההקלטה צריך להיות מסוגל להשיג תמונות עם מהירות גבוהה (10 kHz כדי 100 Hz). רגישות נמוכה של vsd ואת המהירות הדרושה כדי לעקוב אחר האות העצבית דורש כמות גדולה של אור לאסוף במצלמה במהירות גבוהה, עם יחס אות לרעש גבוה (S/N)2,16.
האופטיקה של מערכת ההקלטה הם גם אלמנט קריטי כדי להבטיח איסוף של אור מספיק כדי לשפר את S/N. ההגדלה שהושגה על-ידי האופטיקה היא לעתים קרובות נמוכה באופן מוגזם, כגון 1X כדי 10X, כדי להמחיש מעגל עצבי מקומי פונקציונלי. לדוגמה, כדי להמחיש את הדינמיקה של מעגל ההיפוקמאל, הגדלה של כ -5 תהיה מתאימה. להגדלה כזו נמוכה יש יעילות נמוכה של זריחה; לכן, אופטיקה מתקדמת תהיה מועילה להקלטה כזו.
בנוסף, גם הפיזיולוגיה של הפרוסה חיונית. מאחר שניתוח ההדמיה מחייב שהפרוסות יהיו שלמות, יש צורך בטיפול בפרוסה הזהירה17. יתר על כן, מדדים שננקטו כדי לשמור על הכדאיות הפרוסה זמן רב יותר הם חשובים18.
המאמר הנוכחי מתאר את הפרוטוקול להכנת פרוסות, צביעת VSD ומדידות. המאמר מתאר גם את השיפורים של VSDs, מכשיר הדמיה ואופטיקה, ועוד ליטושים נוספים למערכת הניסיונית שאפשרה שיטה זו לשמש כמערכת פשוטה, רבת עוצמה וכמותית לצורך המחשה של שינוי המוח בפונקציות19,20,21,22,23,24,25. הטכניקה יכולה גם לשמש רבות לפוטנציאל לטווח ארוך באזור CA1 של היפוקמאל פרוסות1. יתר על כן, טכניקה זו שימושית גם הקלטה אופטית של פוטנציאל הממברנה תא עצבי אחד26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש באוניברסיטת טוקאשימה בוני. הפרוטוקול הבא להכנת פרוסה הוא כמעט הליך סטנדרטי27 , אבל השינויים היו הפרוטוקולים של כתמים והקלטה עם vsd.
1. הכנה לפני יום הניסוי
- הכינו את המניה A (טבלה 1), מניות B (טבלה 2) ומניות C (שולחן3) פתרונות וחנות במקרר.
- להכין 1 L של נוזל מלאכותי שדרתי (ACSF) (שולחן 4, ראה שלב 3) ולשמור אותו במקרר.
- להכין 1 L של השתנה ACSF (שולחן 5) ולשמור אותו במקרר.
- מדבקות 500 μL של סרום של שור עוברי (FBS) ב -2 מבחנות mL וחנות במקפיא.
- מתמוסס 4% של אבקת אגר ב ACSF (ca. 120 mL) במיקרוגל ויוצקים אותו בצלחת פטרי 90 מ"מ חד פעמי. הצלחת אגר צריך להיות בקירור לפני שימוש נוסף.
- מניחים את הפריטים הבאים במקפיא ביום לפני הניסוי: מגש כירורגי, מכולה מבצעה ובלוק קירור אלומיניום (120 x 120 x 20 מ"מ3).
- ודא כי יש מספיק טבעות פלקסיגלס עם מסנני קרום עבור מערכת טיפול בפרוסה17,28 (ראה שלב 6.12).
- התמוססות 2% של אבקת אגר ב 50 mL של 3 M KCl במיקרוגל. לקחת סביב 85 μL של החמים אגר-KCl מדלל ב 200 μL טיפים באמצעות מיקרופיפטה עבור האלקטרודה ההארקה. לנתק את הקצה לתוך החמים עדיין אגר 3 M KCl ג'ל. חזור על השלב כדי למלא על 20-40 טיפים עם 2% אגר.
2. הכנת VSD (di-4-ANEPPS) פתרון מניות
- הכינו 1 מ ל של 10% polyethoxylated קיק שמן תמיסה עם מים אולטרה טהורים.
- הוסף 1 mL של אתנול לבקבוקון של די-4-ANEPPS (5 מ"ג בקבוקון), מערבולת ו sonicate עבור 10 דקות. הפתרון יהפוך לצבע אדום עמוק עם שאריות קטנים אפשריים של גבישי di-4-ANEPPS.
הערה: האתנול המשמש בשלב זה צריך להיפתח טרי. - העבר את הפתרון למיקרו-שפופרת של 2 מ ל עם טבעת או. ספין את הפתרון ולהוסיף 500 μL של 10% polyethoxylated קיק שמן פתרון.
הערה: . הצבע הוא בלייפופילית מאוד DMSO ו poloxamer יכול לשמש גם כדי לפזר di-4-ANEPPS אבל במונחים של האות האופטי על שינוי פוטנציאל הממברנה, מצאנו כי השימוש של אתנול-polyethoxylated קיק שמן נותן סימן טוב יותר ליחס הרעש. זה יכול להיות קשור לשיעור העברה של הממס כדי קרום התא. - וורטקס וsonicate עד שהצבען. הומס לחלוטין
- הימנע מחשיפה לאור ושמור אותו במקרר. . אל תאחסן במקפיא המניה יכולה להימשך. כמה חודשים
הערה: ביום הניסוי, בצע את השלבים 3-9.
3. הכנת היום של ACSF (1 L) (שולחן 4)
- שוקלים את הקול, נחקו3וגלוקוז בבקבוקון.
- הוסף 950 mL של מים מזוקקים לבקבוקון ולהתחיל מבעבע עם 95% O2/5% CO2 גז.
- הוסף 2.5 mL של מלאי פתרון הבקבוקון ואת הדגירה עבור כ 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף 2.5 mL של פתרון המניה C לבקבוקון.
- הוסיפו מים מזוקקים כדי להפוך את הפתרון ל-1 ל.
4. הכנת העיתון היומי של ה-VSD
- Sonicate a 500 μL בקבוקון של FBS ו-VSD פתרון מניות (שלב 2) ב ultra-sonicator עבור 5 דקות.
- הוסף 500 μL של ACSF טרי הכין לתוך בקבוקון של FBS.
- להוסיף 20 (במקרה של עכברים) או 40 (במקרה של חולדות) μL של פתרון מניות VSD לבקבוקון.
- Ultra-sonicate ומערבולת הבקבוקון עד הפתרון הופך כתום חיוור.
5. הכנה לכירורגיה
- לקחת 100 mL של ACSF מקורר בנפרד בתוך מיכל נירוסטה 300 mL, מיכל של 300 mL, מכולה פלסטיק, ולמקם אותם במקפיא. יוצקים 150 מ ל של מקורר שונה ACSF (שולחן 2) בגביע אחר ומניחים אותו במקפיא. המתן עד שהפתרונות מצוננים; יש למדוד את הזמן ולקבוע מראש.
- מקפלים לשבור להב תער (פחמן פלדה, כיתה תעשייתית 0.13 מ"מ עבה, להב משני הצדדים) לחצי עבור הפורס.
הערה: החצי השני יכול לשמש לחיתוך עם מחזיק להב מתאים. - להכין בלוק מן ACSF 4% הצלחת אגר עם ג ' כוונון (איור 1).
- הכינו תא דגירה לח (חדר ממשק סוג; a שונה 1.2 L אטום התיבה הצמודה עם אריזת סיליקון) לשמירת פרוסות המוח בחיים מבחינה פיזיולוגית (איור 2); להוסיף ACSF במיכל קטן פחמתי עם 95% O2/5% CO2 גז, ולמלא 90 מ"מ x 20 מ"מ צלחת פטרי עם acsf ב למעלה.
הערה: צלחת פטרי קטנה יותר (60 מ"מ x 20 מ"מ) צריך להיות ממוקם במרכז הצלחת 90 mm כדי לתמוך נייר סינון על המנה. - שים את התיבה על מכשיר חימום ולחכות 20 דקות כדי לחמם אותו עד 28 ° c.
- הוסיפו קרח כתוש לתוך המיכל של הפורס. מניחים את הכלים הבאים בתוך המע מ נירוסטה (קטן) על הקרח: אזמל, מחזיק להב, מלקחיים צלצול, בלוק אגר, ובשלב של פורס. לשמור קפוא ACSF ו-ACSF שונה על קרח בועה עם 95% O2/5% CO2 גז (aka. קרבוגן).
- הניחו את הכלים הבאים בתוך מע (גדול): מספריים (גדולים, קטנים), מלקחיים, מרית, כף ופלייר אלכסוני.
6. כירורגיה (עכברים)
- להשתמש בעכבר באמצעות. " העריכו את רמת ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הדוושה של החיה על צביטה בבוהן.
- ערוף את ראשו של העכבר ולטבול את הראש בקרח קר ACSF במגש כירורגי נירוסטה.
- לחלץ את המוח בתוך 1 דקות ולמקם אותו בגביע המכיל ACSF מקורר עבור 5 דקות.
- להוציא את המוח מתוך הגביע, באמצעות אזמל, לקצץ את המוח בלוק (איור 3A).
- מניחים את המוח בלוק על 4% אגר בלוק (שלב 5.3, איור 3B). שתי האונות ניתן לרכוב על בלוק אגר. לנגב את העודף ACSF מן הבלוק עם נייר סינון.
- החלת דבק דק (דבק סופר) לשולחן הפורס. מניחים את בלוק אגר על זה ולנגב את עודף דבק באמצעות נייר סינון.
- בעדינות להחיל כמות קטנה של הקרח קר ACSF (~ 5 mL) באמצעות פיפטה מראש בלוק המוח-אגר. זה יעזור לחזק את הדבק העודף ולמנוע את הדבק מכיסוי המוח ולהטריד את החיתוך.
- תקן את הטבלה מבצעה למגש מבצעה (איור 3C) ויוצקים את acsf שונה.
- הגדר את הפורס במהירות איטית, עם תדירות הלהב במקסימום.
- הגדר את עובי הפרוסה ל-350-400 יקרומטר והתחל לפרוס (איור 3c). הצב את הפרוסות בפינת מגש הפרוסה ברצף, כך שניתן יהיה להבדיל בקלות בעומק הפרוסות. בדרך כלל ניתן להשיג שלוש עד חמש פרוסות מחצי כיתה אחת.
- לחתוך את החלק גזע המוח באמצעות מחט 30 G (איור 3D).
הערה: בשלב זה, במידת הצורך, יש לבצע מיקרו-כירורגיה על פרוסת המוח כגון חתך בין גבול CA3-CA1. - באמצעות מברשת קטנה משופעת הצבע, מניחים את הפרוסה על מרכז מסנן הממברנה (0.45 יקרומטר נקבוביות, מצופי קרום, 13 מ"מ קוטר) שנערך עם טבעת פלקסיגלס17 (15 מ"מ קוטר חיצוני, 11 מ"מ קוטר פנימי, 1 מ"מ עובי, איור 3e). מניחים את הטבעת בתא ההתאוששות הלח (איור 2) ולאבטח את המכסה כדי לשמור על הלחץ הפנימי גבוה.
הערה: הפרוסות יהיה לדבוק קרום בתוך 30 דקות ניתן לטפל עם הטבעות בשלבים הבאים בחדר ההקלטה. אין צורך להשתמש במשקולות או באמצעים אחרים כדי לשמור על הפרוסה במקומה. - כוונן את הכיוון והמיקום של הפרוסה בטבעת כדי לוודא שהוא ממורכז היטב ויש לו כיוון עקבי (ראה שלב 9.3).
- השאירו את הדגימה ב -28 ° c עבור 30 דקות, ואז בטמפרטורת החדר לפחות 10 עד 30 דקות להתאוששות של פרוסות.
הערה: הפרוסות יכולות כעת לשמור על מצב פיזיולוגי טוב לפחות עבור 15 h.
7. צביעת ושטיפה של הפרוסות (עכברים)
- בעדינות להחיל 100-110 μL של הפתרון הכתים (שלב 4) על כל פרוסה על הטבעת באמצעות מיקרופיפטה. שמונה עד תשע פרוסות יכול להיות מוכתם עם פתרון אחד מכתים הכין בשלב 4. השאירו את הפרוסות במשך 20 דקות לצביעת.
- הכינו 50-100 mL של ACSF במיכל ולשים את הטבעת עם הדגימה הפרוסה בו כדי לשטוף את הפתרון כתמים.
- אחסן את הפרוסה השטף לחדר דגירה אחר. המתן יותר מ-1 שעות להחלמה לפני הניסוי.
הערה: חדר הדגירה ניתן להתנתק מהגז ועבר למקום ההקלטה במצב אטום הדוק. הפרוסה יכולה להישאר בחיים לפחות 20 דקות ללא אספקת גז. הדבר שימושי למקרה שתצטרך להעביר את הפרוסה למקום אחר להקלטה.
8. הכנת המנגנון הנסיוני היומי
- הפעל את המגבר, המחשב ומערכת המצלמה ובדוק שהתוכנה פועלת.
- מקום ACSF בצינור 50 mL ובועה עם קרבוסג'ן.
- השתמש במשאבה הפריסטטית כדי להפיץ את ה-ACSF. כוונן את קצב הזרימה ל-1 mL/min.
- התאימו את גובה מתקן היניקה כך שמפלס הנוזלים בתוך תא הניסוי יהיה תמיד קבוע.
הערה: רמת הפתרון חשובה להשגת הקלטה יציבה, ולכן יש לבצע את ההתאמה באמצעות מיקרומניפולציה. - התקן אלקטרודה הקרקע מורכבת של שבב צהוב מלא 3 M KCl אגר (2%) (שלב 1.8) לתוך מחזיק עם חוט Ag-AgCl עם כמות קטנה של 3 מטרים KCl פתרון.
- מילוי כמות קטנה של ACSF (כשני שליש של אמצעי האחסון) לתוך האלקטרודה זכוכית (1 מ"מ קוטר החיצוני, 0.78 מ"מ קוטר פנימי משכה עם פולר מיקרופיפטה) באמצעות קצה צהוב מחודדות מחודדת ומניחים אותו במחזיק האלקטרודה.
- לצרף את המחזיק את מוט מותקן מניפולטור. ודא שימוש במגבר שהתנגדות האלקטרודה היא כ-1 MΩ.
הערה: הפתיחה ארוך-shank (4-8 יקרומטר פתיחה) סוג התיקון אלקטרודה צריך להיות טוב להקלטת שדה כמו אלקטרודה מגרה.
9. פתיחת מושב הקלטה
- לקחת הכנה פרוסה מן התא לח עם מלקחיים.
- מניחים במהירות את הפרוסה על תא ניסיוני מתחת למיקרוסקופ (איור 4).
- דחף את קצה הטבעת בחוזקה. לתוך הטבעת הסיליקון להיזהר לא לשבור את הקרום או את החלק התחתון של תא הניסוי.
הערה: יש לקחת בחשבון את כיוון הפרוסה ביחס לכיוון של אלקטרודות הגירוי וההקלטה בשדה הראייה. הפרוסה הבריאה צריכה לדבוק במסנן הממברנה כך שאין צורך להשתמש במכשירים אחרים כדי לתקן את הפרוסות כגון משקולות ורשתות ניילון. - מניחים את קצה האלקטרודה המעוררת והרישום הפוטנציאלי בשדה, האלקטרודה על הפרוסה מתחת למיקרוסקופ באור משודר.
- השתמש במערכת ההקלטה האלקטרופיסיולוגית כדי לבדוק את התגובה. אשר את ההקלטה הרגילה (לא מוכתמת) אלקטרופיזיולוגיה עם תצורה נתונה.
הערה: האלקטרודות ההקלטה ניתן להשמיט אך שימושי כדי לבדוק את הפיזיולוגיה של הפרוסה. - להתאים את עוצמת האור עירור כ 70-80% הקיבולת המקסימלית במצלמה המקבילה 13-15 mW/cm2 על הדגימה בעת הדגימה ב 10 kHz עם 5x היעד טבילה המטרה ו 1X תוכנית שפופרת העדשה של APO. האור גל עירור הוא 530 ננומטר, ואת מסנן פליטה חייב להיות > 590 nm.
הערה: השתמש תריס כדי למזער את כמות אור עירור. חשיפה לאור רציף עלולה להחמיר את הפיזיולוגיה של הפרוסה. ההשפעה המזיקה האפשרית של האור תלויה בעוצמה ובמשך האור. השתמש בהקלטה אלקטרופיזיולוגית. כדי לשפוט את אפקט האור במקרה של חוזק של 13-15 mW/cm2, על חשיפה של 1 צריך להיות הגבול העליון של הסובלנות. - להתאים את המוקד עם מערכת הרכישה באמצעות מקור אור פלורסנט כי המוקד עשוי להיות שונה בהתאם אורך הגל ולהתחיל את הרכישה.
- בדוק את הנתונים בתוכנה לרכישת תמונות.
הערה: השתמשנו בחבילת מיקרותכנות מקורית של תוכנות ניתוח מספרי לניתוח מפורט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 5 מראה את האות האופטי המייצג על גירוי חשמלי של העירבון השייפר באזור CA1 של פרוסת היפוקמאל בעכבר. התמונות רצופות באיור 5A להראות את האות האופטי לפני כל מסנני המרחב הזמני הוחלו, בעוד איור 5a מראה את הנתונים אותו לאחר החלת 5 x 5 x 5 המסנן מעוקב (ליבה גאוסיאנית קונבולוציה, 5 x 5 מרחבי-ו 5 כדי מימד זמני) פעמיים. בשל קצב מסגרת גבוהה (0.1 ms/מסגרת) ורזולוציה גבוהה מרחבית (100 פיקסלים x 100 פיקסלים), היישום של המסנן לא לשנות את האות אבל מסוננים את הרעש, אשר יכול גם להיות נצפתה בקורס הזמן נרשם פיקסלים במשפט אחד ( איור 5C, ללא מסנן; איור 5D, עם מסנן; ואיור 5E, על גבי).
איור 6 משווה את התגובה האופיינית באזור CA1 של פרוסת היפוקמאל בין העכבר (איור 6a) ועכברוש (איור 6a). כפי שהוא ניכר בדמות, תגובת היפפולון בשל כניסות מעכבות הוא ברור בפרוסת היפוקמאל חולדה על החלת גירוי זהה על העירבון שייפר ליד CA1/CA3 הגבול. התגובה הקטנה היפרקטרת הוא נצפתה בצד המרוחק של CA1 לאחר 24 ms ב היפוקמאל העכבר פרוסה, אבל יותר מסיבי האצת התגובה מוגזם לקח את תגובת המיקטון בפרוסה היפוקמאל חולדה. הדמיה VSD יכול בבירור להדגים את ההבדל בין העכבר לבין פרוסות היפוקמאל החולדה.
איור 1 : איור של בלוק אגר המשמש הר רקמת המוח לפרוסות וג כדי להפוך את הבלוק. (א) המחשה סכמטית של בלוק המוח ו 4% אגר בלוק (ב). (ג, ד) צילום של פאזל מתכוונן שנעשו על ידי צלחת פלקסיגלס (5-mm עבה כל אחד) כדי להפוך את בלוק אגר. בעת הכנת בלוק אגר, את העליון ואת הלוחות התחתונות צריך להיות מוערמים כפי שמוצג D. (E) על ידי הוספת להב לתוך חריצי דק ארוך (1) ו (2), החלק המשולש הוא גזור, את החריץ (3) משמש כדי לקצץ את כל העומק של הבלוק. (4) הסרת הלוח העליון מאפשרת חיתוך מתוך החלקים הלא נחוצים. באמצעות חריץ 1 ו-2, להפוך רק 5 מילימטר חתכים עמוקים כך שנוצר את הבלוק הוא כפי שמוצג (א) ו (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : איור של הממשק סוג ממשק המשמש לשמירה על הפיזיולוגיה של הפרוסה. (א) מבט כולל על המערכת. (ב) פרטי הפנים. (ג) איור של תא ההתאוששות. הדגימה צריך להיות ממוקם על נייר סינון ממוקם על מילא ACSF 90 mm ו 60 מילימטר צלחת פטרי. המנה האחרונה היא לתמוך בנייר הסינון. הכלים והמיכל מבעבע ACSF נשמרים במקום עם צלחת פלקסיגלס. נייר הסינון לא צריך לגעת בקיר של תיבת האוויר הצמודה או במכולה. האוויר מסופק באמצעות בקבוק מבעבע המשלב גזים מבעבעים בחדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : פרוסות היפוקמאל ההכנות ממוח העכבר. (א) יש לגזור את מוח העכבר המבודד הראשון בקו המקווקו (a), ואז (ב). לבסוף, יש לעשות את החיתוך לאורך הקו (ג). החתך צריך להיות בניצב לתחתית. (ב) בלוק המוח צריך להיות מותקן על בלוק אגר. (ג) בלוק אגר צריך להיות ממוקם על הפורס. (ד) תוצאת הפרוסה. יש לחתוך את הרקמה העודפת בקו המקווקו. (ה) יש להציב את הפרוסה במרכז מסנן הממברנה עם בעל פלקסיגלס (קוטר חיצוני 15 מ"מ, קוטר פנימי 11 מ"מ, מסנן הממברנה של 13 מ"מ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : מערכת הקלטה לאותות אופטיים מהכנות פרוסה. (א) תצלום של המיקרוסקופ המשמש לדימוי הפרוסות בכתב היד הנוכחי. האופטיקה מורכבת עדשה אובייקטיבית (5x NA 0.60), תיבת מראה עבור דיקרואיק פילטר (580 nm), ו הקרנה (tube) עדשה (תוכנית APO x 1.0). מצלמה במהירות גבוהה מחוברת בחלק העליון של עדשת ההקרנה דרך הר-c. יש עוד מצלמה רגילה USB להשגחה. אור העירור הוא הציג באמצעות סיבים אופטיים. (ב) צילום של העדשות התואמות את תיבת המראה. (ג) תרשים סכמטי של מערכת ההקלטה. מערכת ההדמיה ומערכת ההקלטה האלקטרופיסיולוגית נשלטת על ידי מחשב. מערכת תאורה LED עם מערכת בקרת משוב photo-דיודה שימש כמקור אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5 : אות אופטי נציג באזור CA1 של היפוקמאל העכבר פרוסה במשפט אחד. (א) התמונות העוקבות מציגות את התפשטות האות העצבי שנרכש בקצב הפריימים של 0.1 ms/מסגרת לאורך המסלול הנלווה של שייפר לפני החלת כל מסנני מרחבי וזמני (כל 0.2 ms). הריגוש היה 530 ננומטר ופליטה היה > 590 ננומטר. (ב) אותם נתונים לאחר יישום של גרעין גאוסיאני תלת-מימדי של 5 x 5 x 5. (ג, ד) העקבות של אותות אופטיים בפיקסלים המייצג [כל שני פיקסלים (36 μm) לאורך קו באמצע CA1 מוצג בכיכר a, * מציין את הפיקסל בשכבה הפירמידה מתוך הנתונים המוצגים a ו-B. (E) האות על גבי מתוך ה אותות אופטיים ב-C ו-D נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6 : השוואת האות האופטי בין העכבר לבין פרוסות היפוקמאל החולדה. הנציג ברציפות תמונות על גירוי חשמלי של המסלול הנלווה שייפר ליד הגבול CA3/CA1 של העכבר (a) ו עכברוש (ב) היפוקמאל. וידאו 1 מראה את פרוסת היפוקמאל העכבר ווידאו 2 מראה את התמונה היפוקמאל החולדה. הזמן-מסלול של האות האופטית במרכז הCA1 ברובד הפירמידה (st. pyr.) ושכבה רדיואטום (st. rad.) מוצג מימין לאיור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מילימטר אחרון | שקל | |
| מחלקה2פו | 1.25 ממ ' | 3.90 גרם |
| מדחס4• 7h2O | 2 ממ ' | 9.86 גרם |
| אשלגן כלורי | 2.5 ממ ' | 3.73 גרם |
| הוסף H2O כדי להפוך 50 mL |
שולחן 1: מלאי A.
| מילימטר אחרון | שקל | |
| מדחס4• 7h2O | 2 ממ ' | 12.32 גרם |
| הוסף H2O כדי להפוך 50 mL |
שולחן 2: מניות B.
| מילימטר אחרון | שקל | |
| מיכל2• 2h2O | 2 ממ ' | 5.88 גרם |
| הוסף H2O כדי להפוך 50 mL |
שולחן 3: מניות C.
| סופי (mM) | שקל | |
| מיכל שלמה | 124 ממ ' | 7.25 גרם |
| נחקו3 | 26 מ"מ | 2.18 גרם |
| גלוקוז | 10 ממ ' | 1.8 גרם |
| מלאי | 2.5 מ ל | |
| הוסף כ 950 מ ל של H2o ו בועה עם גז מעורב (95% O2/5% CO2) (10 דקות) | ||
| מניות C (CaCl2) | 2 ממ ' | 2.5 מ ל |
| הוסף H2O כדי להפוך 1,000 mL | ||
שולחן 4: הכנת היומון של ACSF.
| סופי (mM) | שקל | |
| נחקו3 | 26 מ"מ | 2.18 גרם |
| סוכרוז | 205.35 ממ ' | 70.29 גרם |
| גלוקוז | 10 ממ ' | 1.8 גרם |
| מלאי | 2.5 מ ל | |
| מניות ב | 2.0 מ ל | |
| הוסף כ 900 מ ל של H2o ו בועה עם גז מעורב (95% O2/5% CO2) (10 דקות) | ||
| מניות C | 0.4 ממ ' | 0.5 מ ל |
| הוסף H2O כדי להפוך 1,000 mL | ||
טבלה 5: שונה ACSF (פתרון חיתוך).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפיזיולוגיה של הפרוסה חיונית. לאיסוף האות הנכון השימוש במערכת מסנני טבעת-ממברנה בפרוטוקול זה מבטיח שהפרוסה תישאר בריאה ובלתי מעוותת במהלך הפרוצדורה2,16,17. מערכות אחרות ניתן להשתמש כדי לשמור על פיזיולוגיה הפרוסה במהלך ההקלטה, אבל הפרוסה לא צריך להיות מעוות בכל עת כמו הדמיה זקוקה לכל חלק של הפרוסה כדי להיות בריא. מערכת מסנן טבעת ממברנה הוא גם טוב יותר עבור כתמים, כמו זה עוזר לנו למזער את עוצמת הקול של הפתרון הכתים הנדרש. חשוב גם לשלוט בעוצמת האור העירור, מאחר שהיא צריכה להיות נמוכה ביחס לשבר הזמן. התאורה הרציפה יכולה לגרום נזק לדגימה; לכן, השימוש המתאים בתריס הוא הכרחי.
רעילות של VSD נדונו לעתים קרובות29, אבל זה תוצאה של כפל לא ליניארי של ריכוז הצבע, עירור עוצמת האור, ומשך החשיפה לאור. הליך ההכתמים המוצג בפרוטוקול זה לא גרם לשינויים מדידים בפרמטרים הפיזיולוגיים של הפרוסה, כגון קשרי הגומלין של פלט הקלט של השדה-הקלטות פוטנציאליות ואלה על הפוטנציאל לטווח ארוך (LTP), לזווג פולס הנחיה (PPF). הידרדרות הפיזיולוגיה של הפרוסה היא גדולה במיוחד תחת תאורה רציפה16, אבל זה יכול להיות מנוהל על ידי ניטור הפוטנציאל השדה. על ידי שימוש באמצעי זהירות אלה, אנו יכולים להקליט LTP עם הקלטה אופטית רציפה באמצעות VSD עבור יותר מ 12 h24, אשר המקבילה הממוזג הטוב ביותר ניסויים מבחנה.
במהלך ההקלטה, שולחן האוויר עשוי להיות שימושי, אבל בידוד ממכשירים אחרים יש לאפשר בגלל ההגדלה הנמוכה של האופטיקה. עם זאת, הפרעות מכניות הן אחת הסיבות המשמעותיות מאחורי דימות עני. אם הכמות הניכרת של אות שווא בתמונה מורכבת מסימנים נגדיים בקצה העצם, ולכן ההפרש בין הבהירות, הוא הגורם הסביר ביותר לכך שההפרעות המכאניות. התנועות של הדגימה והנוזלים הן הסיבות השכיחות ביותר לרעש התנועה, ולכן יש להימנע או למזער.
אות ה-VSD (שינוי חלקי בעוצמת האור) קטן (10-3 עד 10-4 של הזריחה הראשונית). כדי לזהות שינוי כזה קטן, הקרינה הפלואורסצנטית צריכה לחרוג מ-10 עד 106 פוטונים בגלאי הזמן כדי להתגבר על ההשפעה של רעש מסוג פוטון-shot. יתר על כן, כדי לעקוב אחר הפעילות העצבית, קצב הפריימים צריך להיות מהיר, קרוב לקבועי הזמן הדרושים לביצוע הקלטה אלקטרולוגית כגון זו סביב טווח kHz. שילוב של שני תנאים אלה דורש את כמות הניאון כי הוא הרבה יותר נרחב מאשר סוגים אחרים של דימות פלורסנט. זה דורש צמצם מספרי גבוה באופטיקה כולה, והמיקרוסקופ הרגיל הוא לא האופציה הטובה ביותר. יש צורך בתלמיד ובפתח גדול יותר כמוצג באיור 4.
מערכת ההמרה צריכה להתאים עם עומק הפוטון הגדול, קצב המסגרות המהיר ורעש נמוך. הבחירה תלויה בעיקר. במהירות המערכת העצבית האות מהיר יותר כגון התמרה האות מקליטה צריך מיוחדות ultrafast, מערכת רעש נמוך. עם זאת, את האות האיטי כגון התפשטות איטית של הפעילות בתוך מערבולות עשוי להתגלות באמצעות מצלמות הכיתה הרגילה אך מדעית.
הבחירה של מקור האור היא גם קריטית. בחירת האור תלויה בעוצמתו, ביציבותו ובתחום ההארה. במקרה של הגדלה נמוכה של הדמיה בשדה הרחב, הצבע מקור אור כגון קשתות ולייזרים צריך להתרחב, מה שמקשה על השימוש במקורות אלה. קשתות, כגון פנסי מרקורי ומנורות קסנון, הן מקור אור בהיר אך בדרך כלל אינן יציבות. עם זאת, ההתפתחות האחרונה של אור קסנון עשויה להתגבר על הבעיה. מנורת הלוגן יציבה יש אזור גדול יותר של פילמנט שיכול בקלות להתאים עם הדמיה שטח רחב, אבל הוא מוגבל בכוח במיוחד ב 530 ננומטר. הפיתוח האחרון של כוח LED אפשרה לנו להשתמש בו כמקור אור פוטנציאלי, אבל זה חייב להיות מייצב המשוב בגלל התלות בטמפרטורה. לייזרים ניתן להשתמש, אבל באיכות גבוהה התוצאות ברעש מנומר, אשר בדרך כלל לא מקובל עבור דימות שטח רחב.
פרוטוקול הדימות VSD המוצג במאמר זה מודד ערך ביחס לתנאי המנוחה. לא ניתן לבצע מדידה מוחלטת של פוטנציאל הממברנה באמצעות הטכניקה הנוכחית. הדמיה טימטרי ומדידות החיים הפלואורסצנטית ניתן להשתמש כדי להעריך את הפוטנציאל הממברנה המוחלטת.
הדמיה של פרוסות המוח מוכתם בצובר עם VSD בהגדלה נמוכה יכול להדגים את השינויים הפוטנציאליים ממברנה הסף באינטראקציות מיקרו המעגלים של המוח. היקף פונקציונלי כזה לגבי הקשר בין מיקרו המעגלים ברזולוציה בזמן אמת יהיה שימושי בתחומים רבים של מחקר המוח, במיוחד כדי לנתח את ההיבטים הפתולוגיים שנגרמו ככל הנראה על ידי ההתרגשות הזאת והעכבות פונקציונלי קשרים בין אזורי מוח שונים. יישום זה יהיה קריטי כדי לחקור את השינויים במעגלים עצביים הקשורים סוגים מסוימים של מחלות נוירופסיכיאטריות30,31,32.
הפיתוח של מחוון מתח מקודד גנטית33,34 הוא הכיוון העתידי עבור הקלטות הפוטנציאל האופטי הממברנה אשר לסלול את הדרך עבור יישומים אטרקטיביים של סוג תא ניתוח ספציפי של העצבי אירועים ברמת המעגל.
יש הרבה מקום לשיפור באופטיקה, במיוחד להמחיש את הקשרים הפונקציונליים של השדה הרחב. הרומן שלנו מוקד אופטיקה35 יאפשר הקלטה במהירות גבוהה ו-S/N יחס ההקלטה של האות vsd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
TT קיבל את JSPS KAKENHI גרנט (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038, ו JP15K00413) מ MEXT ומענקים מהמשרד לבריאות, עבודה ורווחה (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] ו H30 [18062156]). אנחנו רוצים להודות לנומרולאין (www.editage.jp) לעריכת שפה באנגלית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R.
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W.
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
