Summary
Introduciamo un metodo di registrazione ottica riproducibile e stabile per le fette cerebrali usando coloranti sensibili alla tensione. L'articolo descrive la colorazione sensibile alla tensione e la registrazione di segnali ottici utilizzando preparazioni convenzionali di fette ippocampali.
Abstract
L'imaging a singolo contenuto fotonico sensibile alla tensione (VSD) a singolo campo dei preparati delle fette cerebrali è uno strumento utile per valutare la connettività funzionale nei circuiti neurali. A causa del cambiamento frazionario nel segnale luminoso, è stato difficile utilizzare questo metodo come analisi quantitativa. Questo articolo descrive speciali sistemi di ottica e gestione delle fette, che rendono questa tecnica stabile e affidabile. Il presente articolo illustra in dettaglio la gestione, la colorazione e la registrazione delle fette di ippocampale macchiate di VSD. Il sistema mantiene le condizioni fisiologiche per lungo tempo, con una buona colorazione, e previene i movimenti meccanici della fetta durante le registrazioni. Inoltre, consente la colorazione delle fette con una piccola quantità di colorante. L'ottica raggiunge un'apertura numerica elevata a basso ingrandimento, che consente la registrazione del segnale VSD alla frequenza fotogrammi massima di 10 kHz, con una risoluzione spaziale di 100 x 100 pixel. A causa dell'elevata frequenza fotogrammi e della risoluzione spaziale, questa tecnica consente l'applicazione dei filtri di post-registrazione che forniscono un rapporto segnale-rumore sufficiente per valutare i cambiamenti nei circuiti neurali.
Introduction
L'imaging a singolo campo fotonico sensibile alla tensione (VSD) di preparazioni di fette cerebrali macchiate di massa è diventato un utile strumento quantitativo per valutare la dinamica dei circuiti neurali1,2,3,4 . Dopo l'analisi dei cambiamenti nelle proprietà ottiche dovute all'eccitazione della membrana5,6,7, l'imaging VSD è stato descritto per la prima volta nei primi anni '70 da Cohen e altri6,8, 9. è un metodo adatto per monitorare le funzioni cerebrali in tempo reale in quanto il colorante sonda direttamente i potenziali cambiamenti della membrana (cioè, il segnale primario dei neuroni).
I primi VSD possedevano le caratteristiche desiderabili per comprendere il sistema cerebrale, come una costante temporale veloce per seguire la rapida cinetica degli eventi potenziali della membrana neuronale e la linearità con il cambiamento nel potenziale della membrana9, 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12 mila , 13 del sistema , 14 Del sistema , 15. Simile ad altri esperimenti di imaging, questa tecnica richiede una vasta gamma di accordature specifiche, come le telecamere, l'ottica, il software e la fisiologia delle fette, per ottenere i risultati desiderati. A causa di queste insidie tecniche, i benefici attesi durante gli sforzi iniziali non si sono necessariamente concretizzati per la maggior parte dei laboratori che non si sono specializzati in questa tecnica.
La causa primordiale della difficoltà tecnica era la bassa sensibilità del VSD verso il potenziale cambiamento della membrana quando applicato alla colorazione alla rinfusa dei preparati della fetta. La grandezza del segnale ottico (cioè il cambiamento frazionario della fluorescenza) è di solito 10-4-10-3 del segnale di controllo (F0) in condizioni fisiologiche. La scala temporale del potenziale cambiamento della membrana in un neurone è di circa millisecondi a poche centinaia di millisecondi. Per misurare i cambiamenti nel potenziale di membrana del neurone, la fotocamera utilizzata per la registrazione dovrebbe essere in grado di acquisire immagini ad alta velocità (da 10 kHz a 100 Hz). La bassa sensibilità di VSD e la velocità necessaria per seguire il segnale neurale richiede una grande quantità di luce da raccogliere alla fotocamera ad alta velocità, con un alto rapporto segnale-rumore (S/N)2,16.
L'ottica del sistema di registrazione è anche un elemento critico per garantire la raccolta di luce sufficiente e migliorare S/N. L'ingrandimento ottenuto dall'ottica è spesso eccessivamente basso, come 1X a 10X, per visualizzare un circuito neurale funzionale locale. Ad esempio, per visualizzare la dinamica del circuito ippocampale, sarebbe adatto un ingrandimento di circa 5. Tale basso ingrandimento ha bassa efficienza di fluorescenza; pertanto, l'ottica avanzata sarebbe vantaggiosa per tale registrazione.
Inoltre, la fisiologia della fetta è anche essenziale. Poiché l'analisi di imaging richiede che le fette siano intatte, è necessaria un'attenta manipolazione delle fette17. Inoltre, le misure adottate per mantenere la vitalità della fetta per un tempo più lungo sono importanti18.
Il presente descrive il protocollo per la preparazione di sezioni, colorazione VSD e misure. L'articolo descrive anche i miglioramenti apportati ai VSD, al dispositivo di imaging e all'ottica e altri miglioramenti aggiuntivi al sistema sperimentale che hanno permesso di utilizzare questo metodo come un saggio semplice, potente e quantitativo per visualizzare il modifica delle funzioni cerebrali19,20,21,22,23,24,25. La tecnica può anche essere ampiamente utilizzata per il potenziamento a lungo termine nell'area CA1 di fette ippocampali1. Inoltre, questa tecnica è utile anche nella registrazione ottica dei potenziali della membrana in una singola cellula nervosa26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Tokushima Bunri. Il seguente protocollo per la preparazione delle fette è quasi una procedura standard27 , ma le modifiche sono state i protocolli di colorazione e registrazione con VSD.
1. Preparazione prima del giorno dell'esperimento
- Preparare le soluzioni stock A (Tabella 1), stock B (Tabella 2) e magazzino C ( Tabella3) e conservare in frigorifero.
- Preparare 1 L di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) (Tabella 4, vedere il passaggio 3) e tenerlo in frigorifero.
- Preparare 1 L di ACSF modificato (Tabella 5) e tenerlo in frigorifero.
- Erogare 500 -Ll di siero bovino fetale (FBS) in 2 fiale mL e conservare in un congelatore.
- Sciogliere il 4% della polvere di agar in ACSF (ca. 120 mL) in un forno a microonde e versarlo in un piatto Petri usa e getta da 90 mm. La piastra di agar deve essere refrigerata prima di un ulteriore utilizzo.
- Posizionare i seguenti elementi in un congelatore il giorno prima dell'esperimento: un vassoio chirurgico, un contenitore a fette e un blocco di raffreddamento in alluminio (120 x 120 x 20 mm3).
- Assicurarsi che ci siano sufficienti anelli di plexiglass con filtri a membrana per il sistema di movimentazione delle fette17,28 (vedere il passaggio 6.12).
- Sciogliere il 2% della polvere di agar in 50 mL di 3 M KCl in un forno a microonde. Prendere circa 85 l del dissoltore caldo agar-KCl in 200 punte l utilizzando una micropipetta per l'elettrodo di messa a terra. Staccare la punta nel gel agar 3 M KCl ancora caldo. Ripetere il passaggio per riempire circa 20-40 punte con 2% agar.
2. Preparazione della soluzione di riserva VSD (di-4-ANEPPS)
- Preparare 1 mL di 10% di olio di ricino polyethoxylated con acqua ultra-pura.
- Aggiungere 1 mL di etanolo a una fiala di di-4-ANEPPS (5 mg di fiala), vortice e sonicare per 10 min. La soluzione si trasformerà in un colore rosso intenso con possibili piccoli residui dei cristalli di-4-ANEPPS.
NOT: L'etanolo utilizzato in questo passaggio deve essere appena aperto. - Trasferire la soluzione su un microtubo da 2 mL con un anello O. Abbassare la soluzione e aggiungere una soluzione ad olio di ricino poliesssidi del 10% da 10% da ralli.
NOT: Il colore è altamente lipofilo. DMSO e poloxamer possono anche essere utilizzati per sciogliere di-4-ANEPPS, ma in termini di segnale ottico al cambiamento nel potenziale della membrana, abbiamo scoperto che l'uso di olio di ricino etanolo-polyethoxylated dà un migliore rapporto segnale-rumore. Questo potrebbe essere correlato alla velocità di trasferimento del solvente alla membrana cellulare. - Vortice e sonicare fino a quando il tinrito si è completamente sciolto.
- Evitare l'esposizione alla luce e conservarla in frigorifero. Non conservare in un congelatore. Lo stock può durare per alcuni mesi.
NOT: Il giorno dell'esperimento, seguire i passaggi 3-9.
3. Preparazione giornaliera di ACSF (1 L) (tabella 4)
- Pesare NaCl, NaHCO3e glucosio in una fiaschetta.
- Aggiungere 950 mL di acqua distillata al pallone e iniziare a spumeggiare con 95% O2/ 5% gas CO2.
- Aggiungere 2,5 mL di brodo Una soluzione al pallone e incubare per circa 10 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2,5 mL di soluzione stock C al pallone.
- Aggiungere acqua distillata per rendere la soluzione a 1 L.
4. Preparazione giornaliera della ssoluzione VSD colorazione
- Sonicare una fiala 500 -L di FBS e vsD soluzione stock (passaggio 2) in un ultra-sonicatore per 5 min.
- Aggiungere 500 -L di ACSF appena preparato nella fiala di FBS.
- Aggiungere 20 (in caso di topi) o 40 (in caso di ratti) - L di soluzione stock VSD alla fiala.
- Ultra-sonicare e vortice la fiala fino a quando la soluzione diventa arancio pallido.
5. Preparazione per la Chirurgia
- Prendere 100 mL di ACSF refrigerato separatamente in un contenitore in acciaio inossidabile da 300 ml, un becher da 300 mL e un contenitore di plastica e metterli in un congelatore. Versare 150 mL di ACSF modificato refrigerato (Tabella 2) in un altro becher e metterlo nel congelatore. Attendere che le soluzioni siano refrigerate; il tempo impiegato deve essere misurato e determinato in anticipo.
- Piegare per rompere una lama di rasoio (acciaio al carbonio, grado industriale 0,13 mm di spessore, lama su entrambi i lati) a metà per l'affettatrice.
NOT: L'altra metà può essere utilizzata per la dissezione con un supporto della lama corretto. - Preparare un blocco dalla piastra agar ACSF 4% con un jig di regolazione (Figura 1).
- Preparare una camera di incubazione umida (una camera di tipo interfaccia; una scatola sigillata tesa 1,2 L modificata con un imballaggio in silicone) per mantenere le fette cerebrali fisiologicamente vive (Figura 2); aggiungere L'ACSF in un piccolo contenitore e il carbonato con 95% O2/5% di CO2 gas e riempire una parabola Petri da 90 mm x 20 mm con ACSF nella parte superiore.
NOT: Un piatto Petri più piccolo (60 mm x 20 mm) deve essere posto al centro del piatto da 90 mm per sostenere una carta da filtro sul piatto. - Mettere la scatola su un dispositivo di riscaldamento e attendere 20 min per riscaldarlo fino a 28 gradi centigradi.
- Aggiungere il ghiaccio tritato nel contenitore dell'affettatrice. Posizionare i seguenti strumenti in una vasca in acciaio inossidabile (piccola) sul ghiaccio: bisturi, portala, pinzette ad anello, blocco di agar e uno stadio di affettatrice. Mantenere congelato ACSF e modificato ACSF su ghiaccio e bolla con 95% O2/ 5% GAS CO2 (aka. carbogen).
- Mettere i seguenti strumenti in una vasca (grande): forbici (grandi, piccole), pinzette, una spatola, un cucchiaio e pinze diagonali.
6. Chirurgia (Topi)
- Anestesizzare il mouse utilizzando isoflurane in un cappuccio fuma. Valutare il livello dell'anestesia controllando il riflesso del pedale dell'animale sulla punta pizzicamento.
- Decapitare il topo e immergere la testa in ACSF ghiacciato in un vassoio chirurgico in acciaio inossidabile.
- Estrarre il cervello entro 1 min e metterlo in un becher contenente ACSF refrigerato per 5 min.
- Togliere il cervello dal becher e, usando un bisturi, tagliare il blocco cerebrale (Figura 3A).
- Posizionare il blocco cerebrale su un blocco di agar del 4% (passaggio 5.3, Figura 3B). Entrambi gli emisferi possono essere montati su un blocco di agar. Pulire l'ACSF in eccesso dal blocco con una carta da filtro.
- Applicare sottile adesivo (super colla) al tavolo affettatrice. Posizionare il blocco di agar su di esso e pulire l'adesivo in eccesso utilizzando una carta da filtro.
- Applicare delicatamente una piccola quantità di ACSF ghiacciato utilizzando una pipetta dalla parte superiore del blocco di cervello-agar. Questo aiuterà a solidificare super colla in eccesso e impedire alla colla di coprire il cervello e disturbare il taglio.
- Fissare il tavolo dei filtri dei dati nel vassoio dei filtri dei dati (Figura 3C) e versare l'ACSF modificato.
- Impostare il filtro dei dati a una velocità lenta, con la frequenza della lama al massimo.
- Impostare lo spessore della fetta su 350-400 m e iniziare a affettare (Figura 3C). Posizionare le fette sull'angolo del vassoio delle fette in una sequenza, in modo che la profondità delle fette possa essere facilmente distinta. Di solito da tre a cinque fette possono essere ottenute da un emisfero.
- Tagliare la porzione di gambo del cervello utilizzando un ago 30 G (Figura 3D).
NOT: La microchirurgia sulla fetta cerebrale, come un taglio tra il confine CA3-CA1, deve essere eseguita in questa fase al microscopio binoculare, se necessario. - Utilizzando un piccolo pennello a punta, posizionare la fetta al centro del filtro a membrana (0,45 m pori, PTFE-membrana, 13 mm di diametro) tenuto con l'anello di plexiglass17 (15 mm di diametro esterno, 11 mm di diametro interno, 1 mm di spessore, Figura 3E). Posizionare l'anello nella camera di recupero umida (Figura 2) e fissare il coperchio per mantenere alta la pressione interna.
NOT: Le fette si attaccano alla membrana entro 30 min e possono essere maneggiate con gli anelli nelle fasi successive della camera di registrazione. Non è necessario utilizzare pesi o altre misure per mantenere la sezione in posizione. - Regolare la direzione e la posizione della fetta nell'anello per assicurarsi che sia ben centrata e abbia una direzione coerente (vedere il passaggio 9.3).
- Lasciare l'esemplare a 28 gradi centigradi per 30 min, quindi a temperatura ambiente per almeno 10-30 min per il recupero delle fette.
NOT: Le fette possono ora mantenere una buona condizione fisiologica almeno per 15 h.
7. Colorazione e risciacquo delle fette (Topi)
- Applicare delicatamente 100-110 l'applicazione della soluzione di colorazione (passaggio 4) su ogni fetta sull'anello utilizzando una micropipetta. Da otto a nove fette possono essere macchiate con una soluzione di colorazione preparata nel passaggio 4. Lasciare le fette per 20 min per la colorazione.
- Preparare 50-100 mL di ACSF in un contenitore e mettere l'anello con campione a fette in esso per sciacquare la soluzione di colorazione.
- Conservare la fetta sciacquata in un'altra camera di incubazione. Attendere più di 1 h per il recupero prima dell'esperimento.
NOT: La camera di incubazione può essere staccata dal gas e spostata nel luogo di registrazione in condizioni sigillate strette. La fetta può rimanere viva per almeno 20 min senza alimentazione di gas. Ciò è utile nel caso in cui sia necessario spostare la sezione in un'altra posizione per la registrazione.
8. Preparazione giornaliera di Apparatus Sperimentale
- Accendere l'amplificatore, il computer e il sistema di fotocamera e verificare che il software sia in esecuzione.
- Mettere ACSF in un tubo da 50 mL e bolla con carbogen.
- Utilizzare una pompa peristaltica per far circolare l'ACSF. Regolare la portata a circa 1 mL/min.
- Regolare l'altezza della pipetta di aspirazione in modo che il livello del liquido all'interno della camera di esperimento sia sempre costante.
NOT: Il livello della soluzione è importante per ottenere una registrazione stabile, quindi, la regolazione deve essere fatta utilizzando un micromanipolatore. - Installare l'elettrodo di terra costituito da chip giallo riempito con 3 M KCl agar (2%) (passaggio 1.8) in un supporto con un filo Ag-AgCl con piccola quantità di soluzione KCl 3 M.
- Riempire una piccola quantità di ACSF (circa due terzi del volume) nell'elettrodo di vetro (1 mm di diametro esterno, diametro interno di 0,78 mm tirato con un estrattore di micropipette) utilizzando una punta gialla sottile tubo latatrice e posizionarla nel supporto dell'elettrodo.
- Attaccare il supporto all'asta installata nel manipolatore. Assicurarsi con un amplificatore che la resistenza dell'elettrodo è di circa 1 M.
NOT: L'elettrodo di tipo patch a lunga apertura (4-8 m di apertura) dovrebbe essere buono per la registrazione sul campo e come elettrodo stimolante.
9. Avvio di una sessione di registrazione
- Prendere una fetta di preparazione dalla camera umida con pinze.
- Posizionare rapidamente la fetta su una camera sperimentale al microscopio (Figura 4).
- Spingere saldamente il bordo dell'anello nell'anello O in silicone. Fare attenzione a non rompere la membrana o il fondo della camera di esperimento.
NOT: La direzione della fetta deve essere presa in considerazione per quanto riguarda la direzione degli elettrodi stimolanti e di registrazione nel campo visivo. La fetta sana deve attaccarsi al filtro della membrana in modo che non sia necessario utilizzare altri dispositivi per fissare le fette come pesi e maglie di nylon. - Posizionare la punta dell'elettrodo stimolante e il potenziale di campo che registra l'elettrodo sulla fetta al microscopio con luce trasmessa.
- Utilizzare il sistema di registrazione elettrofisiologica per controllare la risposta. Confermare la consueta registrazione elettrofisiologica (non macchiata) con una determinata configurazione.
NOT: L'elettrodo di registrazione può essere omesso, ma è utile per controllare la fisiologia della fetta. - Regolare l'intensità della luce di eccitazione a circa il 70-80% della capacità massima della fotocamera che corrisponde a 13-15 mW/cm2 al campione durante il campionamento a 10 kHz con obiettivo obiettivo ad immersione in acqua 5x e obiettivo tubo 1x PLAN APO. La lunghezza d'onda della luce di eccitazione è di 530 nm e il filtro di emissione deve essere > 590 nm.
NOT: Utilizzare un otturatore per ridurre al minimo la quantità di luce di eccitazione. L'esposizione alla luce continua può deteriorare la fisiologia della fetta. Il possibile effetto dannoso della luce dipende dall'intensità e dalla durata della luce. Utilizzare la registrazione elettrofisiologica per giudicare l'effetto della luce. In caso di resistenza di 13-15 mW/cm2, circa 1 s esposizione dovrebbe essere il limite superiore della tolleranza. - Regolare la messa a fuoco con il sistema di acquisizione utilizzando la fonte di luce fluorescente perché la messa a fuoco può essere diversa a seconda della lunghezza d'onda e avviare l'acquisizione.
- Esaminare i dati in un software di acquisizione immagini.
NOT: Abbiamo utilizzato un pacchetto di microprogrammazione originale di software di analisi numerica per un'analisi dettagliata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figura 5 mostra il segnale ottico rappresentativo sulla stimolazione elettrica della garanzia Schaffer nell'area CA1 di una fetta di ippocampo di topo. Le immagini consecutive in Figura 5A mostrano il segnale ottico prima dell'applicazione di qualsiasi filtro spaziale e temporale, mentre la figura 5B mostra gli stessi dati dopo l'applicazione di un filtro cubico 5 x 5 x 5 (una convoluzione del kernel gaussiano, 5 x 5 spaziale- e 5 per dimensione temporale) due volte. A causa dell'elevata frequenza fotogrammi (0,1 ms/frame) e dell'alta risoluzione spaziale (100 x 100 pixel), l'applicazione del filtro non ha modificato il segnale ma ha filtrato il rumore, che può essere osservato anche nel corso del tempo registrato in pixel in un'unica prova ( Figura 5C, nessun filtro; Figura 5D, con filtro; e Figura 5E, sovrapposta).
Nella figura 6 viene confrontata la risposta tipica nell'area CA1 di una fetta di ippocampo tra il mouse (Figura 6A) e il ratto (Figura 6B). Come è evidente nella figura, la risposta iperpolarizzante dovuta agli input inibitori è evidente nella fetta di ippocampo del ratto dopo l'applicazione dello stesso stimolo alla garanzia Schaffer vicino al confine CA1/CA3. La piccola risposta iperpolarizzante si osserva nel lato distale del CA1 dopo 24 ms nella fetta di ippocampale del topo, ma una risposta iperpolarizzante più massiccia ha superato la risposta depolarizzante nella fetta dell'ippocampo del ratto. L'imaging VSD può dimostrare chiaramente la differenza tra le fette di ippocampale di topo e ratto.
Figura 1 : Un'illustrazione del blocco di agar utilizzato per montare il tessuto cerebrale per affettare e una giga per fare il blocco. (A) Illustrazione schematica del blocco cerebrale e del blocco di agar del 4% (B). (C, D) Fotografia di un jig regolabile realizzato da una piastra di plexiglass (5 mm di spessore ciascuno) per rendere il blocco di agar. Quando si prepara il blocco di agar, le piastre superiori e inferiori devono essere impilate come mostrato in D. (E) Inserendo una lama negli slot lunghi e sottili (1) e (2), la parte triangolare viene tagliata, la fessura (3) viene utilizzata per tagliare l'intera profondità del blocco. 4 La rimozione della piastra superiore consente di affettare le parti non necessarie. Utilizzando gli slot 1 e 2, effettuare solo 5 mm di tagli profondi in modo che risultante il blocco è come mostrato in (A) e (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Illustrazione del tipo di interfaccia camera di incubazione utilizzata per mantenere la fisiologia delle fette. (A) Panoramica del sistema. (B) Dettagli interni. (C) Illustrazione della camera di recupero. L'campione deve essere posizionato su un filtro posizionato su una parabola Petri di 90 mm e 60 mm riempita da ACSF. Quest'ultimo piatto è quello di sostenere la carta da filtro. I piatti e il contenitore gorgogliante ACSF sono conservati in posizione con un piatto di plexiglass. La carta da filtro non deve toccare la parete della scatola ad aria stretta né il contenitore. L'aria viene fornita attraverso una bottiglia gorgogliante che incorpora gas inumiditi nella camera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Preparazione della fetta di ippocampo da un cervello di topo. (A) Il cervello del topo isolato deve essere tagliato prima alla linea tratteggiata (a), quindi (b). Infine, il taglio deve essere effettuato lungo la linea (c). Il taglio deve essere perpendicolare al fondo. (B) Il blocco cerebrale deve essere montato su un blocco di agar. (C) Il blocco di agar deve essere posizionato sulla affettatrice. (D) Sezione risultante. Il tessuto in eccesso deve essere tagliato alla linea tratteggiata. (E) La fetta deve essere posizionata al centro del filtro a membrana con un supporto di plexiglass (diametro esterno 15 mm, diametro interno 11 mm, il filtro della membrana PTFE di 13 mm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Sistema di registrazione per segnali ottici provenienti dalla preparazione delle fette. (A) Una fotografia del microscopio utilizzata per l'immagine delle fette nel manoscritto corrente. L'ottica è costituita da un obiettivo (5x NA0.60), una scatola a specchio per il filtro dicroico (580 nm) e una lente di proiezione (tubo) (PLAN APO x1.0). Una telecamera ad alta velocità è attaccata sulla parte superiore dell'obiettivo di proiezione attraverso un supporto a C. C'è un'altra solita telecamera USB per l'osservazione. La luce di eccitazione viene introdotta utilizzando la fibra ottica. (B) Fotografia delle lenti compatibili con la scatola dello specchio. (C) Diagramma schematico del sistema di registrazione. Il sistema di imaging e il sistema di registrazione elettrofisiologica sono controllati da un PC. Il sistema di illuminazione a LED con sistema di controllo del feedback foto-diodo è stato utilizzato come fonte di luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Segnale ottico rappresentativo nell'area CA1 di una fetta di ippocampo del topo in un'unica prova. (A) Le immagini consecutive mostrano la propagazione del segnale neuronale acquisito alla frequenza fotogrammi di 0,1 ms/fotogramma lungo il percorso collaterale di Schaffer prima di applicare qualsiasi filtro spaziale e temporale (ogni 0,2 ms). L'eccitazione era di 530 nm e le emissioni erano >590 nm. (B) Gli stessi dati dopo l'applicazione di un nucleo gaussiano tridimensionale di 5 x 5 x 5 due volte. (C, D) Le tracce dei segnali ottici nei pixel rappresentativi [ciascuno dei due pixel (36 m) lungo una linea al centro del CA1 è mostrata al quadrato in A, il segno : indica il pixel nella piramide dello strato] dai dati mostrati in A e B. (E) Il segnale sovrapposto dal segnali ottici in C e D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Confronto del segnale ottico tra le fette di ippocampo di topi e ratti. Le immagini consecutive rappresentative sulla stimolazione elettrica del percorso collaterale Schaffer vicino al bordo CA3/CA1 di una fetta di topo (A) e ratto (B) hippocampal. Video 1 mostra la fetta di ippocampo del topo e il video 2 mostra la fetta di ippocampo del ratto. La linea temporale del segnale ottico al centro del CA1 presso lo strato piramidale (st. pyr.) e il radiato strato (st. rad.) è mostrato a destra della figura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| MM finale | peso | |
| NaH2PO4 - 2H2O | 1,25 mM | 3,90 g |
| MgSO4x 7H2O | 2 mM | 9,86 g |
| Kcl | 2,5 mM | 3,73 g |
| Aggiungere H2O per fare 50 mL |
Tabella 1: Stock A.
| MM finale | peso | |
| MgSO4x 7H2O | 2 mM | 12,32 g |
| Aggiungere H2O per fare 50 mL |
Tabella 2: Magazzino B.
| MM finale | peso | |
| CaCl2s2H2O | 2 mM | 5,88 g |
| Aggiungere H2O per fare 50 mL |
Tabella 3: Stock C.
| Finale (mM) | peso | |
| Nacl | 124 mM | 7,25 g |
| NaHCO3 | 26 mM | 2,18 g |
| glucosio | 10 mM | 1,8 g |
| Magazzino A | 2,5 mL | |
| Aggiungere circa 950 mL di H2O e bolla con gas misto (95 % O2/5 % CO2) (10 min) | ||
| Magazzino C (CaCl2) | 2 mM | 2,5 mL |
| Aggiungere H2O per fare 1.000 mL | ||
Tabella 4: Preparazione giornaliera di ACSF.
| Finale (mM) | peso | |
| NaHCO3 | 26 mM | 2,18 g |
| saccarosio | 205,35 mM | 70,29 g |
| glucosio | 10 mM | 1,8 g |
| Magazzino A | 2,5 mL | |
| Magazzino B | 2,0 mL | |
| Aggiungere circa 900 mL di H2O e bolla con gas misto (95 % O2/5% CO2) (10 min) | ||
| Magazzino C | 0,4 mM | 0,5 mL |
| Aggiungere H2O per fare 1.000 mL | ||
Tabella 5: ACSF modificato (soluzione di taglio).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La fisiologia della fetta è fondamentale per raccogliere il segnale giusto. L'uso del sistema di filtro ad anello-membrana in questo protocollo assicura chela fetta rimanga sana e non distorta durante tutta la procedura 2,16,17. Altri sistemi possono essere utilizzati per mantenere la fisiologia della fetta durante la registrazione, ma la fetta non dovrebbe deformarsi in qualsiasi momento in quanto l'imaging ha bisogno di ogni parte della fetta per essere sana. Il sistema di filtro ad anello-membrana è anche migliore per la colorazione, in quanto questo ci aiuta a ridurre al minimo il volume della soluzione di colorazione richiesta. È anche importante controllare l'intensità della luce di eccitazione, in quanto dovrebbe essere bassa rispetto alla frazione di tempo. L'illuminazione continua può danneggiare il campione; pertanto è necessario un uso appropriato dell'otturatore.
La tossicità del VSD è stata spesso discussa29, ma è il risultato della moltiplicazione non lineare della concentrazione di coloranti, dell'intensità della luce di eccitazione e della durata dell'esposizione alla luce. La procedura di colorazione illustrata in questo protocollo non ha causato cambiamenti misurabili nei parametri fisiologici della fetta, come le relazioni input-output delle registrazioni di potenziale di campo e quelle sul potenziamento a lungo termine (LTP), facilitazione (PPF). Il deterioramento della fisiologia della fetta è considerevole soprattutto sotto l'illuminazione continua16, ma può essere gestito monitorando il potenziale di campo. Utilizzando queste precauzioni, possiamo registrare LTP con registrazione ottica continua utilizzando VSD per più di 12 h24, che è paragonabile ai migliori esperimenti in vitro condizionati.
Durante la registrazione, il tavolo dell'aria potrebbe essere utile, ma l'isolamento da altri dispositivi dovrebbe essere consentito a causa del basso ingrandimento delle ottiche. Tuttavia, i disturbi meccanici sono una delle cause principali alla base di una scarsa imaging. Se la notevole quantità di falso segnale nell'immagine è costituita da segni opposti sul bordo dell'oggetto, quindi la differenza di luminosità, è il più probabilmente causato dai disturbi meccanici. I movimenti del campione e del fluido sono le cause più frequenti di rumore di movimento e, di conseguenza, dovrebbero essere evitati o minimizzati.
Il segnale VSD (cambio frazionario nell'intensità della luce) è piccolo (10-3 a 10-4 della fluorescenza iniziale). Per rilevare un cambiamento così piccolo, la fluorescenza deve superare 10 5-106 fotoni al rivelatore nella frazione di tempo per superare l'effetto del rumore foton-shot. Inoltre, per seguire l'attività neuronale, il frame rate dovrebbe essere veloce, vicino alle costanti temporali necessarie per eseguire la registrazione elettrofisiologica come quella intorno alla gamma kHz. Una combinazione di queste due condizioni richiede la quantità di fluorescenza che è molto più estesa rispetto ad altri tipi di imaging fluorescente. Ciò richiede un'apertura numerica elevata in tutta l'ottica, e il solito microscopio non è l'opzione migliore. La pupilla e l'apertura più grandi sono necessarie come illustrato nella Figura 4.
Il sistema di ricodifica dovrebbe corrispondere con la maggiore profondità del pozzo fotone, la frequenza fotogrammi veloce e il basso rumore. La scelta dipende principalmente dalla velocità del sistema neurale. Il segnale più veloce, come la trasduzione del segnale ippocampale, richiede un sistema specializzato a ultraveloce e basso rumore. Tuttavia, il segnale lento come la lenta diffusione dell'attività nei cortici potrebbe essere rilevato utilizzando le solite telecamere di grado ma scientifiche.
Anche la selezione della sorgente luminosa è fondamentale. La scelta della luce dipende dalla sua intensità, stabilità e l'area di illuminazione. Nel caso di immagini a campo wide a basso ingrandimento, la sorgente di luce puntiformata come archi e laser deve espandersi, il che rende difficile l'uso di queste fonti. Gli archi, come il mercurio e le lampade Xenon, sono la fonte di luce brillante, ma di solito non sono stabili. Tuttavia, il recente sviluppo della luce Xenon potrebbe superare il problema. La lampada alogena è stabile e ha un'area di filamento più ampia che può facilmente corrispondere con l'imaging a campo largo, ma è limitata nella forza soprattutto a 530 nm. Il recente sviluppo di potenza LED ci ha permesso di usarlo come potenziale fonte di luce, ma deve avere lo stabilizzatore di feedback a causa della dipendenza dalla temperatura. I laser possono essere utilizzati, ma l'elevata coerenza si traduce in un rumore maculato, che di solito è inaccettabile per l'imaging a campo largo.
Il protocollo di imaging VSD presentato in questo articolo misura un valore relativo alla condizione di riposo. La misurazione assoluta del potenziale della membrana non può essere eseguita utilizzando la tecnica corrente. L'imaging ratiometrico e le misurazioni a vita della fluorescenza possono essere utilizzate per valutare i potenziali di membrana assoluti.
L'imaging di fette cerebrali macchiate alla rinfusa con VSD a basso ingrandimento può dimostrare i potenziali cambiamenti della membrana sotto-soglia nelle interazioni micro-circuiti del cervello. Tale portata funzionale per quanto riguarda la connessione tra il microcircuito a risoluzione in tempo reale sarà utile in molte aree della ricerca cerebrale, in particolare per analizzare gli aspetti patologici molto probabilmente causati da tale eccitatorio e inibitorio funzionale connessioni tra diverse aree cerebrali. Questa applicazione sarà fondamentale per studiare i cambiamenti nei circuiti neurali relativi a determinati tipi di malattie neuropsichiatriche30,31,32.
Lo sviluppo dell'indicatore di tensione geneticamente codificato33,34 è la direzione futura per le registrazioni potenziali di membrana ottica che apriranno la strada per le applicazioni interessanti dell'analisi tipo di cellula del neurale eventi a livello di circuito.
C'è molto spazio per migliorare l'ottica, soprattutto per visualizzare le connessioni funzionali ad ampio campo. La nostra nuova ottica confocale35 consentirà la registrazione del rapporto ad alta velocità e ad alta velocità del segnale VSD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
TT ha ricevuto il JSPS KAKENHI Grant (JP16H06532, JP16K21743, JP16H06524, JP16K0038 e JP15K00413) di MEXT e sovvenzioni del Ministero della Salute, del Lavoro e del Welfare (MHLW-kagaku-ippan-H27 [15570760] e H30 [18062156]). Ringraziamo Editage (www.editage.jp) per l'editing in lingua inglese.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM - Ultima | Imaging system |
| High speed image acquisition system | Brainvision co. Ltd. | MiCAM 02 | Imaging system |
| Macroscepe for wide field imaging | Brainvision co. Ltd. | THT macroscope | macroscope |
| High powere LED illumination system with photo-diodode stablilizer | Brainvision co. Ltd. | LEX-2G | LED illumination |
| Image acquisition software | Brainvision co. Ltd. | BV-ana | image acquisition software |
| Multifunctional electric stimulator | Brainvision co. Ltd. | ESTM-8 | Stimulus isolator+AD/DA converter |
| Slicer | Leica | VT-1200S | slicer |
| Slicer | Leica | VT-1000 | slicer |
| Blade for slicer | Feather Safety Razor Co., Ltd. | #99027 | carbon steel razor blade |
| Membrane filter for slice support | Merk Millipore Ltd., MA, USA | Omnipore, JHWP01300, 0.45 µm pores, | membrane filter/0.45 13 |
| Numerical analysis software | Wavemetrics Inc., OR, USA | IgorPro | analysing software |
| Stimulation isolator | WPI Inc. | A395 | Stimulus isolator |
| AD/DA converter | Instrutech | ITC-18 | AD/DA converter |
| Voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | catalog number: D-1199 | VSD: Di-4-ANEPPS |
| Poloxamer | Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Pluronic F-127 P30000MP | poloxamer/Pluronic F-127 (20% solution in DMSO) |
| Polyethoxylated castor oil | Sigma-Aldrich | Cremophor EL C5135 | polyethoxylated castor oil |
References
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Tominaga, T., Kajiwara, R., Tominaga, Y. VSD Imaging Method of Ex Vivo Brain Preparation. Journal of Neuroscience and Neuroengineering. 2 (3), 211-219 (2013).
- Homma, R., et al. Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Methods Mol Biol. 364 (1529), 2453-2467 (2009).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Tasaki, I., Watanabe, A., Sandlin, R., Carnay, L. Changes in fluorescence, turbidity, and birefringence associated with nerve excitation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 61 (3), 883-888 (1968).
- Cohen, L., Keynes, R., Hille, B. Light Scattering and Birefringence Changes during Nerve Activity. Nature. 218 (5140), 438-441 (1968).
- Hill, D., Keynes, R.
- Waggoner, A., Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. A Large Change in Axon Fluorescence that Provides a Promising Method for Measuring Membrane Potential. Nature New Biology. 241 (109), 159 (1973).
- Salzberg, B., Davila, H., Cohen, L. Optical Recording of Impulses in Individual Neurones of an Invertebrate Central Nervous System. Nature. 246 (5434), (1973).
- Cohen, L., lzberg, B., Grinvald, A. Optical Methods for Monitoring Neuron Activity. Annual Review of Neuroscience. 1 (1), 171-182 (1978).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Davila, H. V. A large change in dye absorption during the action potential. Biophysical Journal. 14 (12), 983-986 (1974).
- Loew, L. M., Cohen, L. B., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Bezanilla, F. Charge-shift probes of membrane potential. Characterization of aminostyrylpyridinium dyes on the squid giant axon. Biophysical Journal. 47 (1), 71-77 (1985).
- Loew, L. M., et al. A naphthyl analog of the aminostyryl pyridinium class of potentiometric membrane dyes shows consistent sensitivity in a variety of tissue, cell, and model membrane preparations. The Journal of Membrane Biology. 130 (1), 1-10 (1992).
- Mullah, S., et al. Evaluation of Voltage-Sensitive Fluorescence Dyes for Monitoring Neuronal Activity in the Embryonic Central Nervous System. The Journal of Membrane Biology. 246 (9), 679-688 (2013).
- Momose-Sato, Y., Sato, K., Arai, Y., Yazawa, I., Mochida, H., Kamino, K. Evaluation of Voltage-Sensitive Dyes for Long-Term Recording of Neural Activity in the Hippocampus. Journal of Membrane Biology. 172 (2), 145-157 (1999).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices. Journal of Neuroscience Methods. 102 (1), 11-23 (2000).
- Experimental apparatus for sliced specimen of biological tissue and specimen holder. US Patent. Tominaga, T., Ichikawa, M. , US 6,448,063 B2 (2002).
- Buskila, Y., Breen, P. P., Tapson, J., van Schaik, A., Barton, M., Morley, J. W.
- Tanemura, K., et al. Neurodegeneration with Tau Accumulation in a Transgenic Mouse Expressing V337M Human Tau. Journal of Neuroscience. 22 (1), 133-141 (2002).
- Tominaga, Y., Ichikawa, M., Tominaga, T. Membrane potential response profiles of CA1 pyramidal cells probed with voltage-sensitive dye optical imaging in rat hippocampal slices reveal the impact of GABAA-mediated feed-forward inhibition in signal propagation. Neuroscience Research. 64 (2), 152-161 (2009).
- Suh, J., Rivest, A. J., Nakashiba, T., Tominaga, T., Tonegawa, S. Entorhinal Cortex Layer III Input to the Hippocampus Is Crucial for Temporal Association Memory. Science. 334 (6061), 1415-1420 (2011).
- Juliandi, B., et al. Reduced Adult Hippocampal Neurogenesis and Cognitive Impairments following Prenatal Treatment of the Antiepileptic Drug Valproic Acid. Stem cell reports. 5 (6), 1-14 (2016).
- Stepan, J., Dine, J., Eder, M. Functional optical probing of the hippocampal trisynaptic circuit in vitro: network dynamics, filter properties, and polysynaptic induction of CA1 LTP. Frontiers in Neuroscience. 9, 160 (2015).
- Tominaga, Y., Taketoshi, M., Tominaga, T. Overall Assay of Neuronal Signal Propagation Pattern With Long-Term Potentiation (LTP) in Hippocampal Slices From the CA1 Area With Fast Voltage-Sensitive Dye Imaging. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 389 (2018).
- Kajiwara, R., Tominaga, Y., Tominaga, T. Network Plasticity Involved in the Spread of Neural Activity Within the Rhinal Cortices as Revealed by Voltage-Sensitive Dye Imaging in Mouse Brain Slices. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 20 (2019).
- Popovic, M., Gao, X., Zecevic, D. Voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Sakmann, B., Stuart, G. Single-Channel Recording. , (1995).
- Tominaga, T., Tominaga, Y., Ichikawa, M. Optical imaging of long-lasting depolarization on burst stimulation in area CA1 of rat hippocampal slices. Journal of neurophysiology. 88 (3), 1523-1532 (2002).
- Mennerick, S., et al. Diverse Voltage-Sensitive Dyes Modulate GABAAReceptor Function. The Journal of Neuroscience. 30 (8), 2871-2879 (2010).
- Canitano, R., Pallagrosi, M. Autism Spectrum Disorders and Schizophrenia Spectrum Disorders: Excitation/Inhibition Imbalance and Developmental Trajectories. Frontiers in Psychiatry. 8, 69 (2017).
- Anticevic, A., Murray, J. D. Rebalancing Altered Computations: Considering the Role of Neural Excitation and Inhibition Balance Across the Psychiatric Spectrum. Biological Psychiatry. 81 (10), 816-817 (2017).
- Busche, M., Konnerth, A. Impairments of neural circuit function in Alzheimer’s disease. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (1700), 20150429 (2016).
- Knöpfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nature Reviews Neuroscience. 13 (10), 687 (2012).
- Knöpfel, T. Expanding the toolbox for remote control of neuronal circuits. Nature Methods. 5 (4), 293 (2008).
- Tominaga, T., Tominaga, Y. A new nonscanning confocal microscopy module for functional voltage-sensitive dye and Ca2+ imaging of neuronal circuit activity. Journal of Neurophysiology. 110 (2), 553-561 (2013).
