Summary
Vi beskriver en protokoll som bruker fluorescens in situ hybridisering (FISH) for å visualisere flere herpesviral RNAs innen lytically infiserte menneskelige celler, enten i suspensjon eller tilhenger. Denne protokollen inkluderer kvantifisering av fluorescens produsere en nucleocytoplasmic ratio og kan utvides for samtidig visualisering av vert og viral proteiner med immunofluorescence (IF).
Abstract
Mekanistisk innsikt kommer fra nøye studie og kvantifisering av spesifikke RNAs og proteiner. De relative plasseringene av disse biomolekyler i hele cellen til bestemte tider kan fanges opp med fluorescens in situ hybridisering (FISH) og immunofluorescence (IF). Under lytisk herpesvirus infeksjon hijacks viruset verts cellen for å fortrinnsvis uttrykke virale gener, forårsaker endringer i celle morfologi og oppførselen til biomolekyler. Lytisk aktiviteter er sentrert i kjernefysiske fabrikker, kalt viral replikasjon rom, som er merkes bare med FISH og IF. Her beskriver vi en tilpasningsdyktig protokoll av RNA FISH og IF teknikker for Kaposis ' s sarkom-assosiert herpesvirus (KSHV)-infiserte celler, både tilhenger og i suspensjon. Metoden inneholder trinn for utvikling av spesifikke anti-Sense-oligonukleotider, dobbel RNA FISH, RNA FISH med IF og kvantitative beregninger av fluorescens intensitet. Denne protokollen har blitt brukt på flere celletyper, infisert celler, latente celler, lytisk celler, tid-kurs, og celler behandlet med hemmere å analysere spatiotemporal aktiviteter av spesifikke RNAs og proteiner fra både den menneskelige verten og KSHV.
Introduction
I sin lytisk (aktiv) fase, herpesviruses kapre verten cellen, forårsaker endringer i celle morfologi og lokalisering av biologiske molekyler, å produsere virions. Basen av operasjoner er kjernen, der dobbel-strandet DNA viral Genova er kopiert og pakket inn i et protein skall, kalt en kapsid1. For å begynne, uttrykker viruset sine egne proteiner, kapre vertsmaskiner og hindre uttrykk for ikke-essensielle vert gener, en prosess betegnet verten stenge effekt. Flertallet av denne aktiviteten er lokalisert til bestemte 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-gratis kjernefysiske regioner kalt viral replikering rom, bestående av både vert og viral proteiner, RNAs, og viral DNA2. Cellen er gjennomgått for å gi plass og ressurser for replikering avdelinger og dermed montering av viral capsids. Når kapsid utganger kjernen, hvordan kapsid er innhyllet i cytoplasma å produsere en membran-bundet viral partikkel, også kjent som en virionet, er uklart. Forståelse av lokalisering og romlig Skift av både vert og viral biomolekyler i løpet av lytisk fasen gir dypere mekanistisk innsikt i arrangement av replikering kupé, vert utkobling effekt, den virionet-utgående veien, og andre prosesser knyttet til herpesviral infeksjon og replikering.
For tiden den beste metoden for å oppdage og studere disse endringene er visualisering av proteiner og RNAs i infiserte celler med immunofluorescence (IF) og fluorescerende in situ hybridisering (fisk), henholdsvis. Bruk av en time-kurs med disse teknikkene avslører lokalisering av biomolekyler på viktige punkter i lytisk fase eller bare, spatiotemporal data. FISK og IF utfyller andre biokjemiske teknikker, slik som hemming av en cellulær prosess (for eksempel hemming av viral DNA-replikering), RT-qPCR (real-time polymerase kjedere reaksjon), RNA sekvensering, Northern blots, masse massespektrometri, vestlig blotting, og analyse av viral DNA-produksjon, som kan gi et mer globalt bilde av cellulære aktiviteter.
Vi har utviklet RNA FISH-strategier for å undersøke RNA-produktene fra spesifikke gener og en beregningsorientert analyse som kvantitativt beregner nucleocytoplasmic forholdet mellom et bestemt gen produkt. Prøven forberedelse, modifisert fra tidligere publikasjoner av Steitz og kolleger3,4, er relativt lett og kan brukes til både tilhenger og suspenderte celler. Protokollen kan også tilpasses for samtidig bruk av flere RNA FISH-strategier (dobbel RNA FISH) eller RNA FISH med IF-strategier. Utvikling av en bestemt FISH strategi er utfordrende, men forslag til å forbedre suksessen er skissert. Dataanalysen som beskrives her, er kvantitativ hvis fluorescerende perler og sterke markører for kupé grenser brukes og gir ytterligere innsikt i micrographs, innsikt som fjerner observasjons bias. Det detaljert protokollen er beregnet på begge to latent og lytisk celler infisert av Kaposis ' sarkom-forbundet herpesvirus (KSHV) og kan brukes med infisert celler eller celler infisert av annet herpesviruses5. Metodene for kvantifisering gjelder for studier på nucleocytoplasmic SKIFT eller relocalization mellom subcellulære rom i de fleste celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design av fluorescens in situ (FISH) anti-Sense oligonukleotider for å oppdage en spesifikk herpesviral transkripsjon
- Velg 25 til 40 NT segmenter fra sekvensen av RNA interesse og konvertere til å være anti-Sense. En vellykket FISH strategi kan inneholde fra en opp til ti eller flere forskjellige anti-Sense oligonukleotider. Når du velger sekvenser, bør du vurdere følgende:
- Hvis RNA av interesse inneholder et unikt gjentakelses område, kan du utnytte denne funksjonen og utforme en anti-Sense-oligonukleotid for å målrette repetisjonssekvensen.
Merk: Tycowski og kollegaer5 gir et eksempel på denne strategien med rhesus RHADINOVIRUS (RRV) polyadenylated KJERNEFYSISK (PAN) RNA. - Hvis RNA av interesse inneholder en kjent protein-bindende område eller stilk-løkke struktur, design oligonukleotider som unngår disse regionene.
- Avhengig av målene for eksperimentene, vurdere intronic sekvensen og om ikke å designe en anti-Sense oligonukleotid for det.
- Hvis RNA av interesse inneholder et unikt gjentakelses område, kan du utnytte denne funksjonen og utforme en anti-Sense-oligonukleotid for å målrette repetisjonssekvensen.
- Utfør enkle beregnings analyse på de utvalgte anti-Sense-sekvensene for å sikre bindende spesifisitet og redusere aggregering av anti-Sense-oligonukleotid.
- Sekvensene må være omtrent 50% GC-rik (høyt Guanin og cytosin innhold) og ha en Smeltetemperatur i området 60 til 70 ° c.
- Bruk et sekvens analyseverktøy til å velge sekvenser som ikke selv dimerize eller form pinner med smelte temperaturer over 37 ° c, hybridisering temperatur.
- Utfør en NCBI BLASTn (National Center for bioteknologi informasjon grunnleggende Local Alignment søkeverktøy for nukleotid justeringer) søk av de valgte sekvenser mot både verts-og viral transcriptomes bruker "noe lignende" innstilling. Dette søket vil identifisere unike anti-Sense oligonukleotider som ikke vil trolig binde til andre verten eller viral transkripsjoner.
Merk: Hvis transcriptomes ikke er tilgjengelige, Utfør BLAST-søk med genomisk sekvenser. Det er ideelt hvis søkene er utført på sekvenser fra viruset isolert fra de infiserte cellene som brukes i eksperimentet fordi ville stammer har en tendens til å diversifisere og inneholde en kombinasjon av sekvenser fra ulike Lab stammer.
- Bestill renset DNA-oligonukleotider tilsvarende den anti-Sense sekvensen som er verifisert beregningsmessig å være unik og sannsynlig å binde til målet RNA. Ingen spesielle modifikasjoner må innføres i oligonukleotider.
- Test den utformede anti-Sense-oligonukleotider for bindende spesifisitet av FISH og Northern blot.
- Bruke en infisert celle-linje fra samme verts arter (f. eks 293T) og ideelt sett samme celle type, gjennomføre en transfeksjoner med en plasmider uttrykke RNA av interesse fra en robust promoter (CMV, Cytomegalovirus) og en med den tomme vektoren (f. eks, pcDNA3). Bruk en positiv kontroll for transfeksjoner, for eksempel transfeksjoner med et GFP (grønt fluorescerende protein) plasmider (f.eks. pmaxGFP) eller vektoren som inneholder GFP.
Merk: det er viktig å unngå celle-linjer som er udødeliggjort ved hjelp av herpesvirus Epstein-Barr virus (EBV) siden det er sekvens likheter mellom herpesviruses. - Utfør fisk som beskrevet i avsnitt 3 på begge settene med celler med anti-Sense-oligonukleotider som beskrevet i denne protokollen. Utlede de vellykkede kandidatene ved å sammenligne FISH eksperimenter med individuelle, par, eller sett av anti-Sense oligonukleotider. Bruk en positiv kontroll for FISH-protokollen, for eksempel U2 snRNA (liten kjernefysisk RNA) FISH, som er til stede ved 500 000 eksemplarer per humant celle kjerne6 (tabell 1).
- Det fluorescerende signalet skal være spesifikt og sterkt i cellen som inneholder RNA av interesse. Design ekstra anti-Sense oligonukleotider å styrke signalet og fjerne anti-Sense oligonukleotider som binder nonspecifically fra betraktning. Signal styrken må være over bakgrunnen og autofluorescence.
- Test bindende spesifisitet av Northern blot.
- Bruke en infisert celle-linje fra samme verts arter (f. eks 293T) og ideelt sett samme celle type, gjennomføre en transfeksjoner med en plasmider uttrykke RNA av interesse fra en robust promoter (CMV, Cytomegalovirus) og en med den tomme vektoren (f. eks, pcDNA3). Bruk en positiv kontroll for transfeksjoner, for eksempel transfeksjoner med et GFP (grønt fluorescerende protein) plasmider (f.eks. pmaxGFP) eller vektoren som inneholder GFP.
2. oligonukleotid og celle forberedelse
- Følg produsentens anvisninger, bruk Terminal glutamyltransferase for å merke den anti-Sense-oligonukleotider med dioxigenin (DIG)-dUTP eller, hvis den er sterkt bindende, direkte med et fluorescerende nukleotid som Alexa fluor 594-5-dUTP. Etter merking, er ekstra rensing ikke nødvendig. Oppbevar merket oligonukleotider ved-20 ° c opp til flere år og i tinn folie hvis direkte merket for å hindre photobleaching.
FORSIKTIG: merkings løsningen inneholder et giftig materiale, kalium cacodylate. Håndter merkings reaksjoner med hansker.
Merk: for å spare ressurser kan flere forskjellige anti-Sense-oligonukleotider merkes i én reaksjon. Denne protokollen benytter 3 '-end merking. Intern merking er utfordrende fordi den kjemiske gruppen (f. eks DIG eller fluoroforen) blir fanget eller ikke er i stand til å gå inn i det aktive stedet av en DNA-polymerase. Et eksperiment med to forskjellige RNAs kan utføres ved hjelp av direkte merket anti-Sense-oligonukleotider og anti-DIG-immunofluorescence med en annen fluoroforen (f.eks. FITC (fluorescein) eller Alexa fluor 488 med Alexa fluor 594). - Følg cellene til de åtte-kammer lysbilder.
Merk: åtte-kammer lysbilder tillate flere samtidige eksperimenter samtidig minimere dyrebare ressurser som antistoffer. Et alternativ til åtte-kammer lysbilder er en seks-brønn vev kultur plate med standard coverslips (22 mm x 22 mm) som er både sterile. En lignende ordning er mulig med sirkulære coverslips og en 24-brønn vev kultur plate. For begge, Øk volumene som er nevnt i denne protokollen med 10-1,75 (f.eks. mL hybridisering oppløsning), og 4X (f.eks. 600 μL hybridisering-oppløsning).- For tilhenger lytisk celler, bruk 1x Trypsin/PBS ved 37 ° c og 5% CO2 for 10 min å suspendere celler og fortynne til 60% confluency.
Merk: tilhenger cellelinjer som brukes i fiske eksperimenter inkluderte 293T, iSLK. 2197, og ISLK-BAC36 celler8. - Påfør 200 μL av celle fjæring til hvert kammer av de sterile åtte kamret lysbildene og tillater frø vekst for 12-24 t ved 37 ° c og 5% CO2. Juster etter behov for langsomme eller raskt voksende celler og for celler som er lett skadet av Trypsin.
Merk: målet er å ha jevnt fordelte celler godt festet til lysbildet. Vurder å indusere lytisk fase etter vedheft hvis de lytisk cellene er skjøre. Konklusjoner trukket fra eksperimenter med iSLK celler er begrenset9. - For lytisk suspensjon-celler, pre-behandle åtte-kammer lysbilder med 1:10 Poly L-lysin i 5 min under vevet kultur panseret. La deretter lysbildene tørke over natten ved romtemperatur eller 1 time ved 65 ° c. Ruge 800 μL av lytisk celler ved en konsentrasjon på 1 x 106 celler/ml med kamret slides i 30 min til 1 time ved 37 ° c og 5% co2.
Merk: suspensjon-celler vil bosette seg i en monolag, stikker til Poly L-lysin og dermed overflødig celler er ikke en bekymring i forhold til tilhenger celler. Lytisk celler som danner drue klynger, hvis mulig, bør skilles med milde virvlingen eller kjemiske midler. Riktignok har forfatterne ikke hatt mye suksess med slike anbefalinger i tilfelle av lytisk BJAB-RRV-GFP celler. Hvis suspensjon-celler ikke overholder godt, bør du vurdere å øke enten tid eller konsentrasjon av Poly L-lysin inkubasjons.
- For tilhenger lytisk celler, bruk 1x Trypsin/PBS ved 37 ° c og 5% CO2 for 10 min å suspendere celler og fortynne til 60% confluency.
3. fiksering, Immunofluorescence (valgfritt), hybridisering, og visualisering av viral RNAs
- Fjern medier og overflødige celler. Gjennom denne protokollen, bruk vakuum suging for å fjerne løsninger og skånsom micropipetting for å legge til løsninger.
Merk: styrken i et vakuum kan reduseres ved å plassere en 200 μL micropipette spiss over glasset Pasteur-pipette. Skift ut micropipette spissen mellom vaske trinnene for å hindre forurensning. Hver vask trinn må utføres raskt fordi det er viktig at cellene aldri tørker ut. - Umiddelbart fikse cellene med pre-kjølt 4% formaldehyd/PBS (fosfat-bufret saltvann) på isen i 30 min. vask cellene tre ganger med 200 μL 1x PBS avkjølt til 4 ° c og ruge i 5 minutter ved romtemperatur eller på is.
- Permeabilize de faste cellene med 200 μL av pre-kjølt 0,5% Triton-X/PBS (fosfat bufret saltvann) i 10 minutter på is eller 750 μL av pre-kjølt 70% etanol ved 4 ° c i 1 t (min) til 7 d (maks.).
Merk: samle proteiner, total RNA og genomisk DNA-prøver på det punktet av fiksering for å sikre konsekvens mellom bilder og biokjemiske analyser. Alle vasker gjennom denne protokollen utføres på samme måte, med mindre annet er spesifisert. 70% etanol løsner limet mellom kamrene og raset, noe som letter senere separasjon, og gir også en betydelig pause i protokollen. Likevel, bruk parafin film rundt kammeret lysbildet for å redusere fordampning og kontrollere nivået av etanol i hvert kammer om hver 8 h. 70% etanol flater også cellene, noe som gjør et skarpere bilde, mens Triton-X ikke tørke cellene og endrer dimensjoner i cellen.
- Permeabilize de faste cellene med 200 μL av pre-kjølt 0,5% Triton-X/PBS (fosfat bufret saltvann) i 10 minutter på is eller 750 μL av pre-kjølt 70% etanol ved 4 ° c i 1 t (min) til 7 d (maks.).
- Fjern kamrene forsiktig for å hindre at lysbildet sprekker. Hvis eksperimentet inneholder immunofluorescence (IF) av en viral eller vert protein med et polyklonale primære antistoff, Utfør IF som beskrevet nedenfor før du fortsetter til RNA FISH. Hvis immunofluorescence bruker en monoklonale primære antistoff, deretter utføre immunofluorescence som beskrevet i trinn 3.3.1 etter trinn 3,11.
Merk: Bruk en fersk fjerning enhet eller en med svært lite leftover lim levert av produsenten og forsiktig lette kamrene av for å hindre at lysbildet fra cracking. Bruke 70% etanol som permeabilizing reagens for 4 h sterkt reduserer sannsynligheten for sprekker. I tilfelle av en sprekk, fortsetter protokollen på kamre som ikke er berørt av sprekk og være oppmerksom på høyere oksidasjon rate av ufullkomment forseglet lysbilder (dvs. redusert lagrings levetid).- Skyll celler med pre-kjølt 1x PBS og blokk med pre-kjølt 4% BSA (storfe serum albumin)/1x PBS for 30 min ved 4 ° c.
Merk: bruk av BSA gjennom denne protokollen begrenser ikke-spesifikk merking. - Fjern blokkerings løsningen og ruge cellene med 1:200 eller et annet polyklonale primær antistoff i 0,1% BSA/1x PBS for 1 time ved 4 ° c. Deretter vaskes tre ganger med 1x PBS.
Merk: et antistoff10 for påvisning av SSB/ORF6 (viral single-strandet DNA binding protein) ble brukt ved 1:200 fortynning. - Ruge cellene med et sekundært antistoff med fluoroforen som er kompatible med fiske-deteksjon antistoff for 1 t ved 4 ° c. Vask tre ganger med 1x PBS. Deretter fikse med 4% formaldehyd/1x PBS for 10-15 min og permeabilize med enten Triton-X eller 70% etanol som tidligere beskrevet før du går videre til fisk. Cover Slide med tinn folie for å bevare fluorescerende signal og forhindre photobleaching.
- Skyll celler med pre-kjølt 1x PBS og blokk med pre-kjølt 4% BSA (storfe serum albumin)/1x PBS for 30 min ved 4 ° c.
- Vask cellene med 2x SSC (saltvanns-natrium citrate) én gang, og påfør 45 μL av hybridisering oppløsning bestående av 50% formamid, 10% dextran sulfat, 2x SSC, 0,1% BSA, 500 μg/mL lakse sæd DNA, 125 μg/mL E. coli tRNA og 1 mm vanadyl ribonucleoside Komplekser. Ruge for 1 t ved 37 ° c i et luft fuktighets kammer som kan være en 150 mm Petri rett med fuktet sterile kluter.
Merk: Forbered frisk hybridisering løsning minst en time før bruk. Oppløse den dextran sulfat i vann først, virvlingen ofte og incubating i et 37 ° c vannbad. - Beregn for å ha en foreslått konsentrasjon på 25 μM-oligonukleotider i 35-uL-hybridisering-oppløsning per kammer. Juster konsentrasjonen av anti-Sense-oligonukleotid etter behov. Legg destillert vann til oligonukleotider for å bringe denaturering volum til 10 μL.
Merk: etter merkings reaksjonen lagres oligonukleotider i den slukket løsningen som inneholder 0,18 M kalium cacodylate, 23 mM Tris-HCl, 0,23 mg/mL BSA, 4,5 mM CoCl2, 18 mm EDTA, 2,7 mm K-fosfat og 6,8 mm KCl, 45 μM 2-Mercaptoethanol, 0,02% Triton X-100, og 2% glyserol. Konsentrasjonene er høye nok til at fortynning med vann vil bringe denaturering oppløsning til konsentrasjoner i nærheten av 1x TE (10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA), en standard oligonukleotid denaturering buffer. - Denaturere DIG-og/eller Alexa fluor 594-merket oligonukleotider ved 95 ° c i 5 min. Deretter legges 35 μL frisk hybridisering løsning per tiltenkte kammer til denaturert oligonukleotider. Hvis du utfører dobbel fisk, kan begge settene med anti-Sense-oligonukleotider være denaturert og hybridisert sammen.
- Fjern den forhånds hybridisering løsningen, og legg deretter til hybridisering løsning som inneholder de merkede oligonukleotider i cellene. Ruge overnatter i luft fuktighets kammeret ved 37 ° c med tinn folie for å beskytte fluoroforen-merket oligonukleotider.
Merk: Inkubasjons bør være minst 10 timer og ikke mer enn 24 h. - Neste dag, vask cellene to ganger med 2x SSC i 10 min ved 37 ° c og deretter to ganger med 1x SSC i 10 min ved 25 ° c.
- Fix cellene med pre-kjølt 4% formaldehyd/1x PBS for 10-15 min på isen. Vask deretter cellene med PBS tre ganger og permeabilize for 1 t med pre-kjølt 70% etanol eller 10 min med pre-kjølt 0,5% Triton-X/1x PBS ved 4 ° c.
- Ruge cellene med 1:200 anti-DIG FITC i pre-kjølt 0,1% BSA/1x PBS for 1 t ved 4 ° c. Fjern antistoff oppløsningen og vask tre ganger med 1x PBS.
- Fix med pre-kjølt 4% formaldehyd/1x PBS for 10-15 min ved 4 ° c og deretter vaske tre ganger med 1x PBS. Hvis utfører immunofluorescence for en vert eller viral protein med en monoklonale primære antistoff, permeabilize cellene og deretter utføre IF-protokollen som er beskrevet i trinn 3.3.1. Ellers går du videre til DAPI farging.
- Ruge cellene med 0,4 μg/mL DAPI i pre-kjølt 0,5% Triton-X/1x PBS for 15 min på isen og vask deretter tre ganger med 1x PBS.
- Monter lysbilder med fluorescerende perler (valgfritt) og et monterings medium. Deretter forsegle dekkglass til raset med klar neglelakk.
- Ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop, samle bilder av prøvene innen en time til en uke for å utføre protokollen ved 630x forstørrelse. Påfør flere strøk med neglelakk å forsegle dekselet slip og å forlenge fluoroforen liv ved å redusere frekvensen av oksidasjon.
Merk: ikke bruk et DAPI som inneholder festemiddel. Når du samler inn bildene, ta med Skalerings linjen på hvert bilde for senere kvantifisering. Fluorescerende perler tjene som kontroller av fluorescens intensitet mellom lysbilder og prøve forberedelser11. Hent bilder ved midsection av cellen for todimensjonale (2D) kvantifisering i trinn 4.
4. kvantifisering av fisk og IF bilder for å fremheve subcellulære lokalisering og for å bestemme nucleocytoplasmic ratio av fluorescens
- Utfør bildeanalyse på en samlet stabel av de ulike fluorescerende-farget og fusjonerte bilder for å sikre konsistens. Angi skalaen for bildeanalyse programvaren ved hjelp av Skalerings linjen som er inkludert når bildene ble samlet inn.
- For å kvantifisere fluorescens intensitet over flere kanaler og i referanse til den kjernefysiske DAPI flekken, bruk et linje verktøy og en plot-profil funksjon. Angi deretter linjen permanent på en kopi av bildet ved hjelp av markører som ikke hindrer eller påvirker seer dommen.
- Etablere kriterier for å veilede hvor linjen trekkes, for eksempel et spor som fanger opp et mangfold av topografiske funksjoner, topper og daler, langs en sentral akse eller en linje som ikke går gjennom ikke-overmettet områder.
Merk: disse linje spor avbilder rå fluorescens i en celle og dermed er begrenset til sammenligninger av plasseringen av en flekk, ikke intensitet. Hvis du vil sammenligne intensiteten av den samme flekken mellom lysbilder, behandlinger eller forberedelser, legger du til en fluorescerende perle i lysbildet som en intern kontroll under trinn 3,13. Den fluorescerende perlen må tilsettes under monteringsprosessen og oppdages med de samme innstillingene på eksitasjon laser og photomultiplier Tube (konfokalmikroskopi).
- Etablere kriterier for å veilede hvor linjen trekkes, for eksempel et spor som fanger opp et mangfold av topografiske funksjoner, topper og daler, langs en sentral akse eller en linje som ikke går gjennom ikke-overmettet områder.
- For å kvantifisere et skifte i subcellulære lokalisering, beregne nucleocytoplasmic prosenter av celler gjennomgår ulike behandlinger.
- Målområdet og rå fluorescens intensitet av både kjernen og cytoplasma ved hjelp av kjernefysiske DAPI flekken for å sette den indre grensen. Inkluder kjernefysiske og cytoplasmatiske kontroller, for eksempel en kjernefysisk RNA (f.eks. KSHV PAN RNA) og cytoplasmatiske RNA (f.eks. vert GAPDH mRNA). Videre beregne bakgrunns intensitet for tre celle-lignende områder og gjennomsnittlig verdiene per piksel eller μm2.
Merk: intensitet verdier har en tendens til å mangle enheter og så begrepet ' enheter ' brukes. - Normalisere både kjernefysiske og cellulære rå intensitet verdier ved først å bestemme gjennomsnittlig bakgrunn for det samme området, og deretter trekke den individualisert verdi fra rå intensiteten i området.
- For eksempel har en kjerne av en lytisk B-celle et areal på 133,4 μm2 og en rå intensitet av 75976 enheter mens bakgrunns intensiteten for samme fluorescerende signal var fast bestemt på å være 0,67 enheter per μm2. Den normalisert kjernekraft intensiteten ville være
- For eksempel har en kjerne av en lytisk B-celle et areal på 133,4 μm2 og en rå intensitet av 75976 enheter mens bakgrunns intensiteten for samme fluorescerende signal var fast bestemt på å være 0,67 enheter per μm2. Den normalisert kjernekraft intensiteten ville være
- Angi verdiene i følgende ligning.
Merk: denne beregningen kontroller for endringer i subcellulære området. Lytisk induksjon og narkotika behandlinger kan forstørre kjernen eller endre størrelsen på cellen, henholdsvis. - Hvis du vil tolke resultatene, oppretter du en boks whisker plott. En lik fordeling av fluorescerende signalet vil være nær null, mens en kjernefysisk distribusjon ville favorisere en positiv ratio verdi og en cytoplasmatiske fordeling ville trenden mot en negativ ratio verdi.
- Målområdet og rå fluorescens intensitet av både kjernen og cytoplasma ved hjelp av kjernefysiske DAPI flekken for å sette den indre grensen. Inkluder kjernefysiske og cytoplasmatiske kontroller, for eksempel en kjernefysisk RNA (f.eks. KSHV PAN RNA) og cytoplasmatiske RNA (f.eks. vert GAPDH mRNA). Videre beregne bakgrunns intensitet for tre celle-lignende områder og gjennomsnittlig verdiene per piksel eller μm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
The FISH and IF metoder beskrevet i dette manuskriptet er vist i figur 1 sammen med kvantifisering av resultatene etter linje spor av fluorescerende intensitet. Resultatene som presenteres her er semi-kvantitative og gir innsikt i lokalisering, snarere enn i sammenligninger mellom intensitet av ulike fluorescerende flekker fordi eksperimenter ikke inkluderte en fluorescerende perle i raset forberedelse. Figur 1 avslører også at cytoplasmatiske og kjernefysiske områder og deres forhold er forskjellige for latent og lytisk KSHV-infiserte celler. Dermed er området styres i nucleocytoplasmic forholdet vist frem i figur 2. Figur 2 validerer beregningen som er beskrevet i dette manuskriptet for et nucleocytoplasmic forhold med bruk av en kjernefysisk kontroll, viral polyadenylated KJERNEFYSISKE (PAN) RNA, og en cytoplasmatiske kontroll, verten GAPDH mRNA. Figur 3 avslører at når KSHV DNA replikering er hemmet i lytisk fasen ved bruk av enten phosphonoacetic syre (DOXY + PAA) eller Cidofovir (Doxy + Cido), tidlig ORF59-58 transkripsjon Skift til en overveiende cytoplasmatiske lokalisering. Micrographs og de to kvantifisering metodene i Figur 3 støtter dette resultatet, og AVSLØRER at Pan RNA lokaliseres til spesifikke kjernefysiske steder til tross for hemming av viral DNA-replikering og endringen sett for tidlig ORF59-58 transkripsjon.
Figur 1: linjer spor av fluorescerende intensitet avslører raffinert i fluorescens in situ HYBRIDISERING (Fish) av KSHV transkripsjoner og IMMUNOFLUORESCENCE (IF) av KSHV replikering avdelinger. (A-B) Konfokalmikroskopi bilder av TREx RTA (Tetracycline induserbart viral replikering og transkripsjon aktivator protein) BCBL-1 celler12 som har blitt indusert i lytisk fase for 24 h med Doxycycline (Doxy). Scale-linjen indikerer 10 μm. (A) fluorescens in situ HYBRIDISERING (Fish) for viral RNAs (grønn) og IMMUNOFLUORESCENCE (IF) for viral enkelt-strandet DNA binding PROTEIN (ORF6/SSB) (rød), en del av KSHV replikeringer avdelinger, avslører at viral transkripsjoner lokalisere i cytoplasma, kjernen, og i kjernefysiske fokus utenfor ORF6/SSB beriket områder, også kjent som replikering avdelinger. Anti-SSB antistoff10 ble fortynnet til 1:200 i 0,4% BSA/1x PBS og oppdaget med 1:500 anti-kanin Alexa fluor 594 sekundært antistoff i 0,4% BSA/1x PBS. Alle anti-Sense oligonukleotider som brukes gjennom denne studien er gitt i tabell 1. Påvisning av ORF59-58 mRNA inkluderer både bicistronic og monocistronic transkripsjoner. Men i KSHV-infiserte JSC-1 celler, den monocistronic mRNA er minst 18-fold mindre rikelig enn bicistronic transkripsjon og sannsynligvis bidrar bare en mindre del av det totale fluorescerende signalet observert13. Videre en av PAN RNA oligonukleotider (SB88) kan også oppdage viral transkripsjon for K7. Signalet fra en påvisning av K7 vil ikke være så signifikant sammenlignet med signalet som oppdager KSHV PAN RNA, som er tilstede på nesten 80% av alle polyadenylated RNA i en lytisk KSHV-infisert celle14. I tillegg en av de fire anti-Sense oligonukleotider (tkv13) i påvisning av K 8.1 mRNA er i stand til å binde til flere isoformene av K 8.1 og andre isoformene av nærliggende åpne lese RAM mer (ORF). FISH-signalet fra bare oligonukleotid tkv13 er utilstrekkelig (data ikke vist). Den kombinerte hybridisering av de fire oligonukleotider og bindingen av dem på samme transkripsjon sannsynlig gir observert sterkt signal. Hvite linjer flankerer celler i (A) avbilder linjen banen av fluorescens intensitet for FISH og IF signaler, plottet i (C). (B) digitalt zoomet bilder av celler i (A) flankert av hvite linjer. For enkelhets skyld er den blå DAPI-kanalen utelatt. (C) plott viser relative fluorescerende intensitet for hver flekk langs samme linje: αSSB (rød), viral transkripsjoner (grønn; transkripsjon angitt på tomten), og DAPI (blå). Skyggelagte områder indikerer DAPI-reduserte områder som tilsvarer virale rep like Rings rom eller SSB/ORF6-beriket områder. (D) forholdet mellom kjernefysiske området til mobilnettet området endringer og dermed fluorescens intensitet forholdet brukes hele ble normalisert for området. (E) kjernefysiske og cellulære områder målt for TREX RTA BCBL-1 celler med og uten gjennomgår lytisk aktivering. Statistisk signifikante endringer er sett i forhold til uninduced celler. Boksen og whisker tomter representerer 10 og 90 prosentiler. Figur gjengitt med små modifikasjoner fra Vallery, manken, og kolleger15 under en Creative Commons Attribution-lisens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Kontroll kjernefysiske og CYTOPLASMATISKE Fish strategier validere beregningsmetoden for nucleocytoplasmic ratio. (A) fisk for verten GAPDH mRNA (Red) og for viral polyadenylated KJERNEFYSISKE (PAN) lncRNA (grønn) og DAPI kjernefysiske flekker (blå) er positive Fish kontroller for beregningsmetoden bestemme nucleocytoplasmic ratio. Host GAPDH mRNA er et Kanonisk mål for KSHV vert utkobling effekt og er degradert på lytisk induksjon som vist her. (B) fluorescens intensitet langs en linje som indikeres av hvite linjer flankerer lytisk celler i (a). DAPI (blå), PAN RNA (grønn) og GAPDH mRNA (rød). Skyggelagte områder er som definert i figur 1. (C) kvantifisering av fluorescens intensitet av celler representert ved (A) (n = 150 for hver GAPDH sample, n = 75 for ORF59-58 eller k 8.1 prøver) ble utført for tre biologiske replikerer av celler vist i figur 2 og Figur 3 . P-verdier: > 0,05 (ns), < 0,05 (*), < 0.005 (* *) og < 0.0005 (* * *). (D) representant Northern blot av RNA fra TREx RTA BCBL-1 celler 24 h etter Doxy. Boksen og whisker tomter representerer 10 og 90 persentil. Figur gjengitt med små modifikasjoner fra Vallery, manken, og kolleger15 under en Creative Commons Attribution-lisens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: linje spor og beregning av nucleocytoplasmic prosenter avslører et sterkt skifte til cytoplasma for tidlig lytisk ORF59-58 transkripsjon ved hemming av viral DNA-replikering. TREx RTA BCBL-1 celler ble behandlet for 24 h uten rusmiddel (Unind), Doxycycline bare (Doxy), eller med Doxycycline og en hemmer av herpesviral DNA replikering, phosphonoacetic syre (Doxy + PAA) eller cidofovir (Doxy + Cido). Paneler (A-C) viser data fra prøver som er samlet inn fra tre biologiske replikeres. (A) qPCR verdier for viral intracellulære DNA under hemming av viral DNA replikering ble normalisert til mengden av promoter DNA av Host-Cell GAPDH genet. (B) Northern blot (venstre) og kvantifisering (høyre) viser total RNA nivåer under hemming av viral DNA-replikering. Uninduced nivåer av alle RNAs var undetectable. (C) representative Fish bilder for viral ORF59-58 transkripsjoner (grønn) og Pan RNA (rød) ved hemming av viral DNA-replikering. DAPI (blå) var den kjernefysiske flekken. (D) kvantifisering av fluorescens intensitet av celler representert ved (C) (n = 75 hver) ble gjort på biologiske triplicates. (E) fluorescens intensitet langs linjer trukket over celler indikert med hvite linjer i (C) er vist: DAPI (blå), Pan RNA (rød) og ORF59-58 mRNA (grønn). P-verdier: > 0,05 (ns), < 0,05 (*), < 0.005 (* *) og < 0.0005 (* * *). Sekvensene av alle oligonukleotider i denne studien er gitt i tabell 1. Boksen og whisker tomter representerer 10 og 90 prosentiler. Figur gjengitt fra Vallery, manken, og kolleger15 under en Creative Commons Attribution lisens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Nordre oligos | |||||||
| Oligo. | Genet | Sekvens | Posisjon innenfor genet | Posisjon med referanse NC 009333.1 Genova (tall reflekterer ikke retning eller tråd) | |||
| KORF50 | KSHV RTA/ORF50 | CGCATTGCGGTGGTTGAAATTGCTGG | 1284 til 1309 | 73936 til 73961 | |||
| JBW249 | KSHV SOX/ORF37 | TAACCTGACACCACCAAACACACGGTCCAC | 262 til 291 | 57633 til 57662 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCGGTATAGAATCGGGAACCT | 941 til 967 (ORF59 ORF) | 95879 til 95905 | |||
| tkv13 | KSHV K 8.1 | AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT | 16 til 57 | 76029 til 76070 | |||
| SB2 | KSHV PAN RNA | ACAAATGCCACCTCACTTTGTCGC | 664 til 687 | 29496 til 29519 | |||
| Rnase P | Human RNase P | TGGGCGGAGGAGAGTAGTCTG | 319 til 339 | N/a | |||
| FISKE sonder | |||||||
| Oligo. | Genet | Sekvens | |||||
| SB2 | KSHV PAN RNA | ACAAATGCCACCTCACTTTGTCGC | 664 til 687 | 29496 til 29519 | |||
| SB85 | KSHV PAN RNA | CGCTGCTTTCCTTTCACATT | 373 til 392 | 29205 til 29224 | |||
| SB88 | KSHV PAN RNA | GTGAAGCGGCAGCCAAGGTGACTGG | 1 til 22 | 28830 til 28854 | |||
| tkv13 | KSHV K 8.1 | AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT | 16 til 57 | 76029 til 76070 | |||
| tkv14 | KSHV K 8.1 | TGATATTAAGGCATCGGTCAGTTCTGTGGTGGCCTGGA | 377 til 414 | 76390 til 76427 | |||
| tkv15 | KSHV K 8.1 | GTAAGGTTACGCTTTATCCCTACACACCGACGGTTTACCC | 461 til 500 | 76474 til 76513 | |||
| tkv16 | KSHV K 8.1 | GGACAAGTCCCAGCAATAAACCCACAGCCCATAGTATG | 688 til 725 | 76701 til 76738 | |||
| tkv376 | KSHV ORF59-58 | TAATGTGTTCATTGACCCTCCTGATT | 54 til 79 | 96767 til 96792 | |||
| tkv377 | KSHV ORF59-58 | GCCGATCCGTGCACTTGCACTACTCCGGTT | 93 til 122 | 96724 til 96753 | |||
| tkv378 | KSHV ORF59-58 | AAGGCTATGCCAGCGTCGAGTACATTCGCA | 300 til 329 | 96517 til 96546 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCGGTATAGAATCGGGAACCT | 941 til 967 | 95879 til 95905 | |||
| tkv380 | KSHV ORF59-58 | AAAGAGTGTGAACGAGTACAGGGCCTT | 1289 til 1315 | 95531 til 95557 | |||
| tkv381 | KSHV ORF59-58 | AAACACTGCTGACGCGCAGATCCATTCC | 1423 til 1450 | 95396 til 95423 | |||
| tkv382 | KSHV ORF59-58 | TACCTGTGTACTATTGGCGGCGCCTGATACAC | 1571 til 1602 | 95244 til 95275 | |||
| tkv383 | KSHV ORF59-58 | GGGTCGAGATTCAGCTAATTAGGCGAAAACTCCACAGG | 2136 til 2173 | 94673 til 94710 | |||
| Stellaris | GAPDH | Forhåndslagde av Stellaris | N/a | N/a | |||
| qPCR primere | |||||||
| tkv458 | GAPDH promoter | CTGCACCACCAACTGCTTAG | N/a | N/a | |||
| tkv459 | GAPDH promoter | GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT | N/a | N/a | |||
| tkv319 | KSHV ORF39 (gM) | GTGAGGTGCTTCGCTGAGTT | N/a | 60075 til 60094 | |||
| tkv320 | KSHV ORF39 (gM) | CCTGGGTCAAGCTGTTGTTT | N/a | 60218 til 60237 | |||
| RT-qPCR primere | |||||||
| TKV 455 | K8/K-bZIP forover RT qPCR primer | CGAAAGCAAGGCAGATACG | 655 til 673 | 75603 til 75621 | |||
| TKV 456 | K8/K-bZIP omvendt RT qPCR primer for unspliced | GCCATTGTTCCCATTTGAGT | 755 til 774 | 75703 til 75722 | |||
| TKV 457 | K8/K-bZIP omvendt RT qPCR primer for skjøtes | CATCAGCATGTCGCGAAG | 871 til 888 | 75819 til 75836 | |||
| JBW479 | Human RNase P Forward | AGCTTGGAACAGACTCACGG | 238 til 257 | N/a | |||
| JBW480 | Human RNase P omvendt | GCGGAGGAGAGTAGTCTGAA | 317 til 336 | N/a | |||
Tabell 1: alle oligonukleotider som brukes i analysene av denne publikasjonen. Tabell 1 ble gjengitt med tillatelse fra American Society for mikrobiologi under en Creative Commons Attribution lisens fra Vallery et al.15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som beskrives i denne rapporten kan tilpasses forskjellige celletyper og inneholder trinn for dobbel RNA FISH og RNA FISH med IF ved bruk av både monoklonale og polyklonale primære antistoffer. Selv om de tilberedte lysbildene vanligvis er avbildet med et konfokalmikroskopi mikroskop, kan bildebehandling utføres med STED (stimulert utslippsreduksjon) etter modifikasjoner av økt antistoff konsentrasjon og et annet monterings medium. For forbedret analyse av enkeltceller kan prøver som er klargjort med denne protokollen, også sorteres, avbildet og analyseres av en celle sortering eller flyte flowcytometer med beskjedne endringer, som vist av Borah og kolleger16. Denne protokollen kan imidlertid ikke vedtas for direkte celle avbildning.
Den kvantifisering metoder detaljert eliminere observasjon bias og tjene til å validere en potensiell nucleocytoplasmic SKIFT. Nucleocytoplasmic forholdet peikt også når en biomolekyler justerer seg fra å bli jevnt fordelt til lokalisere i et bestemt subcellulære kammer. Resultatene som presenteres her er semi-kvantitative mens protokollen skisserer måter å styrke kvantifisering. Styrken i nucleocytoplasmic ratio og linje spor (trinn 4) avhenger av bruk av fluorescerende perler som intensitet kontroller (trinn 3,13) og bruk av klare subcellulære markører, slik som en for kjernefysisk Lamin A/C. På dette tidspunktet, en klar grense markør finnes ikke for KSHV viral replikering avdelinger. Uansett, denne beregningen kan utvides til andre subcellulære avdelinger med bruk av egnede markører.
Det store hinderet for protokollen som er beskrevet i denne rapporten, er utviklingen av fiske strategier for spesifikke transkripsjoner (trinn 1). Suksess er avhengig av overflod og bindende styrke anti-Sense oligonukleotider. Spesifisitet til bestemte transkripsjoner er gjort enda vanskeligere ved tilstedeværelsen av overlappende åpne lese RAM mer (ORFs) i viral genomer. Dermed viral transkripsjoner har ofte sekvens likhet17 med andre viral transkripsjoner fra samme genomisk regionen, spesielt i tilfelle herpesviruses. Ofte utviklingen av en FISH strategi må dra nytte av mer rikelig transkripsjoner. For å feilsøke mangel på et FISH-signal bør brukere utføre FISH-protokollen med U2 snRNA FISH-strategien for å bekrefte at teknikker i humane celler og utarbeidelse av reagenser er tilstrekkelige. På samme måte kan KSHV PAN RNA FISH-strategien bekrefte lytisk aktivering i KSHV-infiserte celler. For å feilsøke binding av anti-Sense oligonukleotider, forfatterne anbefaler å utvikle flere anti-Sense oligonukleotider. Hvis alt svikter, er et kommersielt alternativ tilgjengelig som demonstrert ved bruk av GAPDH FISH strategi i figur 2 og av Vallery, manken, og kolleger15.
Sterkere algoritmer for å definere cellulære og subcellulære grenser vil ytterligere eliminere kvantifisering bias. Noen analytisk bildebehandling programvare kan sette grenser for cellen, kjernen, og mer, men krever definitive markører. Uvanlige celle morfologier som viral replikering rom er vanskelig for slik programvare-en utfordring for fremtidig utvikling. Videre kvantifisering metodene som er beskrevet her er begrenset til en optisk skive av en celle (2D bildeanalyse). Mens 3D image oppkjøpet er mulig18, fremtidig utvikling av en kvantitativ 3D bildeanalyse kan gi ytterligere innsikt i spatiotemporal regulering av viral replikering avdelinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski, og Johanna B. manken for råd om dataanalyse. Vi takker også G. Hayward for anti-SSB-antistoff. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd T32GM007223 og T32AI055403 fra National Institutes of Health (til TKV) og NIH Grant (CA16038) (til JAS). JAS er en undersøker av Howard Hughes Medical Institute. Tall 1-3 og tabell 1 ble gjengitt med tillatelse fra American Society for mikrobiologi under en Creative Commons Attribution-lisens fra følgende publikasjon: Vallery, T. K., manken, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposis ' s sarkom-Associated Herpesvirus mRNA akkumulering i kjernefysiske fokus er påvirket av viral DNA-replikering og viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), Doi: 10.1128/JVI. 00220-18, (2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
References
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A.
- Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
- Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
- Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
- Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
- Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
- Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
- Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
- Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
- Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
- Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
- Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).
