Summary
אנו מתארים פרוטוקול ניצול הקרינה היברידיזציה באתרו (דג) כדי להמחיש RNAs מרובים של הרפס בתוך תאים אנושיים נגועים ליקיה, או בהשעיה או חסיד. פרוטוקול זה כולל כימות של זריחה המייצרת יחס נוקלאוציטוסמטי וניתן להארכה להדמיה סימולטני של חלבונים מארחים ונגיליים עם immunofluorescence (IF).
Abstract
תובנה מכניסטית מגיעה מלמידה קפדנית ומקוונפיקציה של RNAs וחלבונים ספציפיים. המיקומים היחסיים של biomolecules אלה ברחבי התא בזמנים ספציפיים יכולים להילכד עם אור היברידיזציה באתרו (דג) ו immunofluorescence (IF). במהלך זיהום וירוס lytic, הנגיף מעורר את התא המארח כדי להיות מעדיפים לבטא גנים ויראליים, גרימת שינויים במבנה התא והתנהגות של biomolecules. פעילויות lytic ממורכזים במפעלים גרעיניים, כינה תאי שכפול ויראלי, אשר ניתן להבחין רק עם דגים ו IF. כאן אנו מתארים פרוטוקול הסתגלות של ה-RNA פיש, אם טכניקות עבור סרקומה של קפושי וירוס הקשורים (KSHV)-תאים נגועים, שניהם חסיד ו השעיה. השיטה כוללת שלבים להתפתחות של מחלת האנטי-סנס מסוימת, דגי RNA כפולים, דגי RNA עם IF, וחישובים כמותיים של עוצמות הזריחה. פרוטוקול זה הוחל בהצלחה על סוגי תאים מרובים, תאים לא נגוע, תאים סמויים, תאים lytic, זמן קורסים, ותאים מטופלים עם מעכבי לנתח את הפעילויות הטמפורלית של rnas וחלבונים ספציפיים מהמארח האנושי ו . לא, לא.
Introduction
בשלב lytic שלהם, הרפס לחטוף את התא המארח, גרימת שינויים במבנה התא ולוקליזציה של מולקולות ביולוגיות, כדי לייצר הריטונים. הבסיס של המבצעים הוא הגרעין, שבו הגנום כפול ויראלי DNA הוא משוכפל וארוזים לתוך קליפת חלבון, נקרא capsid1. כדי להתחיל, הווירוס מבטא חלבונים משלו, חטיפת מכונות מארח ומניעת ביטוי של גנים מארחים שאינם חיוניים, תהליך המכונה אפקט שוטוף מארח. רוב הפעילות הזאת הוא מקומי ספציפי 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-אזורים גרעיניים ללא תשלום הנקרא תאי שכפול ויראלי, מורכב הן חלבונים מארחים ויראלי, RNAs, ו-DNA נגיפי2. התא הוא מוגזם כדי לספק מרחב ומשאבים עבור תאי השכפול ובכך הרכבה של הקפידים ויראלי. ברגע שהקפסיד יוצא מהגרעין, כיצד הקפיסיד אפוף בציטופלסמה כדי לייצר חלקיק נגיפי מאוגד, הידוע גם בשם וויריאון, אינו ברור. הבנת הלוקליזציה והשינויים המרחביים של הbiomolecules המארחים והנגיפי במהלך השלב lytic מספק תובנה מכניסטית עמוקה יותר לתוך הסידור של תא השכפול, אפקט שוביטוף מארח, מסלול היציאה והמעבר, ועוד תהליכים הקשורים לזיהום ושכפול הרפס.
כיום השיטה הטובה ביותר לזהות וללמוד שינויים אלה היא ויזואליזציה של חלבונים ו-RNAs בתאים נגועים עם immunofluorescence (IF) ו פלורסנט באתרו היברידיזציה (דג), בהתאמה. שימוש בזמן-קורס עם טכניקות אלה חושף את הלוקליזציה של biomolecules בנקודות מפתח של השלב lytic או פשוט, הנתונים הזמני. דגים ואם משלימים טכניקות ביוכימיות אחרות, כגון עיכוב של תהליך הסלולר (למשל, עיכוב של שכפול ה-DNA ויראלי), RT-qpcr (תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת), רצפי RNA, בלוטים צפוניים, ספקטרומטר מסה, בלוק מערבי, ו ניתוח של ייצור ה-DNA נגיפי, כי עשוי לספק תמונה גלובלית יותר של פעילויות סלולריות.
פיתחנו את האסטרטגיות של ה-RNA לבדיקת מוצרי RNA מגנים ספציפיים ואנליזה חישובית המחשבת את היחס הנוקלאולוציציסמטי של מוצר גנטי מסוים. הכנת המדגם, שונה מפרסומים קודמים על ידי steitz ועמיתים3,4, הוא קל יחסית והוא יכול לשמש הן מחסיד והן תאים מושעה. הפרוטוקול הוא גם להתאמה לשימוש בו זמנית של מספר אסטרטגיות RNA דגים (כפול רנ א) או דג RNA עם אסטרטגיות IF. פיתוח אסטרטגיית דגים ספציפית מאתגרת, אך הצעות לשיפור ההצלחה מתוארות במיתאר. ניתוח הנתונים המתואר כאן הוא כמותי אם חרוזי פלורסנט וסמנים חזקים של גבולות תא משמשים ומציעה תובנה נוספת במיקרוגרפים, תובנה המסירה הטיית תצפית. הפרוטוקול המפורט מיועד לתאים סמויים וליטיק נגוע בווירוס הקשורות סרקומה של קפושי (KSHV) והוא יכול לשמש עם תאים לא נגועים או תאים נגועים על ידי אחרים הרפס5. שיטות הקוונלויות הינן ישימות למחקרים על משמרות נוקלאוציטוצילסמטי או לוקליזציה מחדש בין תאי משנה ברוב התאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. עיצוב של הקרינה הפלואורסצנטית (דג) אנטי-סנס מקומית לזיהוי תעתיק מסוים של הרפס
- בחר 25 כדי 40 nt מקטעים מתוך רצף של RNA של עניין ולהמיר להיות אנטי הגיוני. אסטרטגיית דגים מוצלחת עשויה להכיל מאחד עד עשר או יותר אנטי-סנס שונה ומאוזן. בעת בחירת רצפים, שקול את הפרטים הבאים:
- אם ה-RNA של הריבית מכיל אזור חוזר ייחודי, ולאחר מכן הקלד את האות הרישית בתכונה זו ועצב את הפעולה האנטי-מונואותית נגד התחושה כדי למקד את רצף החזרה.
הערה: Tycowski ועמיתים5 לספק דוגמה של אסטרטגיה זו עם רזוס השרירים (rrv) הגרעין הגרעיני (פאן) RNA. - אם ה-RNA של הריבית מכיל אתר בעל כריכת חלבונים מוכר או מבנה לולאת-לולאה, עיצוב מיני-ליגונואודים הנמנעים מאזורים אלה.
- בהתאם ליעדי הניסויים, שקול את הרצף האינטרואני, והאם לתכנן את הדבר האנטי-מונואני.
- אם ה-RNA של הריבית מכיל אזור חוזר ייחודי, ולאחר מכן הקלד את האות הרישית בתכונה זו ועצב את הפעולה האנטי-מונואותית נגד התחושה כדי למקד את רצף החזרה.
- בצע ניתוחים חישוביים פשוטים ברצפי האנטי-סנס הנבחרים כדי להבטיח ספציפיות לכריכה ולצמצם את הצבירה של האנטי-שגיאות נגד היגיון.
- הרצפים חייבים להיות כ-50% GC עשיר (התוכן הגבוה גואנין ו ציטוסינוס) ויש להם טמפרטורת ההיתוך בטווח של 60 כדי 70 ° c.
- השתמשו בכלי מנתח רצף כדי לבחור רצפים שאינם מדיכים את עצמם או את סיכות השיער בטמפרטורות ההיתוך מעל 37 ° c, טמפרטורת הכלאה.
- ביצוע BLASTn NCBI ק (המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגיה בסיסי מידע יישור מקומי הכלי חיפוש עבור מערכים נוקלאוטיד) חיפוש של הרצפים שנבחרו נגד הן מארח ויראלי ההמרה באמצעות ההגדרה ' דומה במקצת '. חיפוש זה יזהה אנטי-סנס מיוחד ומלא-רגיש שסביר להניח שהוא לא ייאגד לתעתיקים אחרים של המחשב המארח או הנגיפי.
הערה: אם ההמרה אינם זמינים, בצע את החיפוש הפיצוץ עם רצפי גנומי. זה אידיאלי אם החיפושים מבוצעים על רצפי מן הווירוס מבודדים מן התאים הנגועים בשימוש בניסוי כי זנים פראי נוטים לגוון ולהכיל שילוב של רצפים מתוך זנים מעבדה שונים.
- הזמנת ה-DNA מטוהרים olig, מתאים לרצף אנטי-ההיגיון כי כבר מאומת בחינה חישובית להיות ייחודי וסביר לאגד את RNA היעד. אין צורך להציג שינויים מיוחדים. בתוך מחלת האוליונודים
- בדוק את מחלת האנטי-סנס המעוצבת באמצעות מחייב של דגים וכתמי צפון.
- באמצעות שורת תא לא נגוע מאותו זן מארח (למשל, 293T) ובאופן אידיאלי את אותו סוג תא, לנהל את הקשר עם פלסטלינה ביטוי ה-RNA של עניין מיזם חזק (CMV, cytomegalovirus) ואחד עם וקטור ריק (למשל, pcDNA3). השתמש בשליטה חיובית עבור העברה כגון שיתוף החצייה עם GFP (חלבון פלורסנט ירוק) פלפריאמצע (g., pmaxGFP) או וקטור המכיל GFP.
הערה: חשוב להימנע מקווי התאים שכבר הונצח באמצעות וירוס הרפס אפשטיין-בר (EBV) מאחר שקיימים קווי דמיון בין הרפס. - בצע את הדגים כפי שמתואר בסעיף 3 בשני הסטים של התאים עם מחלת האנטי-ביגורונואוטיים כמתואר בפרוטוקול זה. להסיק את המועמדים המצליחים על ידי השוואת ניסויים דגים עם הפרט, זוגות, או סטים של האנטי ההיגיון oligonucleotides. השתמש בפקד חיובי עבור פרוטוקול הדג כגון U2 snRNA (RNA גרעיני קטן) דג, הווה ב 500,000 עותקים לכל גרעין התא האנושי6 (טבלה 1).
- אות הפלורסנט צריך להיות ספציפי וחזק בתא המכיל את ה-RNA של הריבית. לעצב עוד מחלת האנטי-סנס-מילולית כדי לחזק את האות ולהסיר את מחלת האנטי-מונוליתים שאינם מתחשבים במיוחד. עוצמת האות חייבת להיות מעל לרקע ולפלואורסצנטית אוטומטי.
- בדוק ספציפיות לכריכה על-ידי אבן חשופה צפונית.
- באמצעות שורת תא לא נגוע מאותו זן מארח (למשל, 293T) ובאופן אידיאלי את אותו סוג תא, לנהל את הקשר עם פלסטלינה ביטוי ה-RNA של עניין מיזם חזק (CMV, cytomegalovirus) ואחד עם וקטור ריק (למשל, pcDNA3). השתמש בשליטה חיובית עבור העברה כגון שיתוף החצייה עם GFP (חלבון פלורסנט ירוק) פלפריאמצע (g., pmaxGFP) או וקטור המכיל GFP.
2. הכנות והכנת תאים
- בעקבות ההוראות של היצרן, השתמש בטרמינל טרנספראז כדי לתייג את האנטי-חוש מחלת החמצון עם dioxigenin (לחפור)-dutp או, אם מחייב בחוזקה, ישירות עם נוקלאוטיד הפלורסנט כמו אלקסה fluor 594-5-dutp. לאחר תיוג, אין צורך בטיהור נוסף. החנות מתויג oligונומטר ב-20 ° c עד מספר שנים וברדיד פח, אם מתויג ישירות כדי למנוע הלבנה.
התראה: פתרון התיוג מכיל חומר רעיל, ואשלגן מאוחר. טיפול תגובות תיוג עם כפפות.
הערה: כדי לחסוך במשאבים, ניתן לתייג מספר משאבים שונים של אנטי-סנס בתגובה אחת. פרוטוקול זה מנצל 3 '-end תיוג. תיוג פנימי מאתגר כי הקבוצה הכימית (למשל, לחפור או fluorophore) נתפס או אינו מסוגל להיכנס לאתר הפעיל של ה-DNA פולימראז. ניסוי עם שני RNAs שונים ניתן לבצע באמצעות התווית ישירות אנטי-הגיוני ואנטי לחפור אימונוofluorrvrorrrrg עם fluorophore למשל, FITC (fluorophore) או אלקסה Fluor 488 עם אלקסה Fluor 594). - להתאים את התאים לשקופיות שמונה בחדר.
הערה: השקופיות הקאמריות מאפשרות מספר ניסויים בו זמנית, תוך מזעור משאבים יקרי ערך כמו נוגדנים. חלופה לשמונה שקופיות קאמרית היא לוחית שישה היטב של תרבות הרקמה עם שמיכות סטנדרטיות (22 מ"מ x 22 מ"מ) שניהם עקרים. סידור דומה אפשרי עם שמיכות עגול ולוחית של תרבות 24 רקמה. עבור שניהם, להגדיל את אמצעי האחסון שהוזכרו בפרוטוקול זה על ידי 10-15x (למשל, 1.75 mL פתרון הכלאה), ו 4x (למשל, 600 μL הכלאה פתרון) בהתאמה.- עבור תאים ליטיים חסיד, השתמש ב-1x טריפסין/PBS ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 10 דקות כדי להשעות את התאים ולדלל ל 60% שליטה.
הערה: קווי תאים מחסיד המשמשים ניסויים דגים כללה 293T, iSLK. 2197, ו ISLK-BAC36 תאים8. - החל 200 μL של השעיית תא לכל תא של שקופיות סטרילי שמונה שעות ולאפשר צמיחת זרעים עבור 12-24 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2. התאם את הנדרש לתאים איטיים או בעלי צמיחה מהירה ועבור תאים הפגומים בקלות על-ידי טריפסין.
הערה: המטרה היא שתאים מרווחים באופן שווה מחוברים היטב לשקופית. שקול לגרימת השלב lytic לאחר הדבקה אם התאים lytic הם שבירים. מסקנות שנמשכו מניסויים. עם תאים מוגבלים ב-9 - עבור lytic ההשעיה תאים, טרום לטפל שמונה שקופיות קאמרית עם 1:10 פולי L-ליזין עבור 5 דקות תחת כיסוי התרבות רקמה. ואז להשאיר את השקופיות להתייבש בלילה בטמפרטורת החדר או 1 h ב 65 ° c. דגירה 800 μL של תאים lytic בריכוז של 1 x 106 תאים/mL עם שקופיות החדרניות עבור 30 דקות עד 1 h ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
הערה: ההשעיה-תאים יהיה ליישב מונאולייר, נדבק ליזין פולי ולכן התאים העודפים אינם חשש בהשוואה לתאים חסיד. התאים lytic היוצרים אשכולות ענבים, אם אפשרי, צריך להיות מופרדים על ידי וורטקנג עדין או אמצעים כימיים. יש להודות, המחברים לא היה הצלחה רבה עם המלצות כאלה במקרה של lytic BJAB-RRV תאים. אם ההשעיה-תאים לא לדבוק היטב, לשקול להגדיל את הזמן או הריכוז של הדגירה פולי L-ליזין.
- עבור תאים ליטיים חסיד, השתמש ב-1x טריפסין/PBS ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 10 דקות כדי להשעות את התאים ולדלל ל 60% שליטה.
3. קיבעון, אימונואופלוורנציה (אופציונלי), היברידיזציה, ויזואליזציה של RNAs ויראלי
- הסר מדיה ותאים עודפים. במהלך פרוטוקול זה, השתמש שאיבה ואקום כדי להסיר פתרונות ומיקרופיליטוף עדין כדי להוסיף פתרונות.
הערה: החוזק של ואקום יכול להיות מופחת על ידי הצבת קצה 200 μL מיקרופיפטה על גבי הזכוכית פסטר. החליפו את העצה המיקרופיפטה בין שטיפת הצעדים כדי למנוע זיהום. כל צעד לשטוף חייב להתבצע במהירות, כי זה הכרחי כי התאים לעולם לא להתייבש. - מיד, לתקן את התאים עם מקורר מראש 4% פורמלדהיד/PBS (מלוחים באגירה פוספט) על הקרח 30 דקות. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 200 μL 1x PBS מקורר 4 ° צ' ו דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר או על הקרח.
- החדירות התאים קבוע עם 200 μL של טרום מקורר 0.5% טריטון-X/PBS (מלוחים באגירה פוספט) עבור 10 דקות על קרח או 750 μL של טרום מקורר 70% אתנול ב 4 ° צ' עבור 1 h (דקות) כדי 7 d (מקסימום).
הערה: לאסוף חלבון, כולל RNA, ודגימות דנ א גנומית בנקודת הקיבעון כדי להבטיח עקביות בין התמונות הביוכימי אומר. כל שוטף בפרוטוקול זה מבוצעים באותו אופן אלא אם צוין אחרת. 70% אתנול משחרר את הדבק בין התאים לבין השקופית, המקל על הפרדה מאוחרת יותר, ומספק גם הפוגה משמעותית בפרוטוקול. עם זאת, השימוש בסרט פרפין סביב השקופית הקאמרית כדי להפחית את האידוי ולבדוק את רמת האתנול בכל חדר על כל 8 h. 70% אתנול גם ששטף את התאים, ביצוע התמונה מצנן, בעוד טריטון-X אינו מפחית את התאים ולשנות את ממדים של התא.
- החדירות התאים קבוע עם 200 μL של טרום מקורר 0.5% טריטון-X/PBS (מלוחים באגירה פוספט) עבור 10 דקות על קרח או 750 μL של טרום מקורר 70% אתנול ב 4 ° צ' עבור 1 h (דקות) כדי 7 d (מקסימום).
- להסיר את הלשכה בקפידה כדי למנוע פיצוח השקופית. אם הניסוי כולל immunofluorescence (IF) של חלבון ויראלי או מארח עם נוגדן ראשוני רב שבטים, לבצע את IF כפי שמתואר להלן לפני שאתה ממשיך ל-RNA FISH. אם האימונולופסינציה משתמשת בנוגדן ראשוני חד-שבטיים, לאחר מכן לבצע מאימונו3.3.1 לאחר מכן כמתואר בשלב לאחר שלב 3.11.
הערה: השתמש במכשיר הסרה טרי או אחד עם דבק קטן מאוד שאריות שסופקו על ידי היצרן ולהקל בעדינות את החדרים כדי למנוע סדיקה של השקופית. שימוש 70% אתנול כמו החדיר הכימית של 4 h מפחית במידה ניכרת את הסבירות של סדיקה. במקרה של סדק, להמשיך את הפרוטוקול על צ'יימברס לא מושפע הסדק ולהיות מודעים שיעור חמצון גבוה יותר של שקופיות אטום לחלוטין (כלומר ירידה בחיים האחסון).- לשטוף את התאים עם מקורר 1 x PBS ולחסום עם pre-מקורר 4% BSA (סרום שור)/1x PBS עבור 30 דקות ב 4 ° c.
הערה: השימוש ב-BSA לאורך פרוטוקול זה מגביל תיוג שאינו ספציפי. - הסרת פתרון חסימת ו-מודתאת התאים עם 1:200 או אחר נוגדן ראשי רב שבטיים ב 0.1% BSA/1x PBS עבור 1 h ב 4 ° c. ואז לרחוץ שלוש פעמים עם 1x PBS.
הערה: נוגדן10 עבור זיהוי של ssb/ORF6 (ויראלי אחד תקוע חלבון איגוד ה-DNA) שימש ב 1:200 דילול. - דגירה את התאים עם נוגדן משני עם fluorophore תואם את הנוגדן זיהוי דגים עבור 1 h ב 4 ° c. לרחוץ שלוש פעמים עם 1x PBS. לאחר מכן לתקן עם 4% פורמלדהיד/1x PBS עבור 10-15 דקות והחדירות עם טריטון-X או 70% אתנול כפי שתוארה בעבר לפני שתמשיך דג. כיסוי שקופית עם רדיד אלומיניום כדי לשמר את האות פלורסנט ולמנוע הלבנה.
- לשטוף את התאים עם מקורר 1 x PBS ולחסום עם pre-מקורר 4% BSA (סרום שור)/1x PBS עבור 30 דקות ב 4 ° c.
- לשטוף את התאים עם 2 x למטה (מלוחים נתרן ציטראט) פעם אחת ולאחר מכן להחיל 45 μl של פתרון היברידיזציה המורכבת של 50% בטופס1, 10% תוספי סולפט, 2x למעלה, 0.1% bsa, 500 μg/ml דנ א הזרע, 125 μg/ml E. coli , ו 1 מתחמי. מודטה עבור 1 h ב 37 ° c בחדר לחות שיכול להיות 150 מ"מ צלחת פטרי עם מגבונים סטרילי לחלח.
הערה: הכינו פתרון הכלאה טרי לפחות שעה לפני השימוש. לפזר את תוספי סולפט במים הראשון, vortexing לעתים קרובות הדגירה ב 37 בג ° c באמבט מים. - חישוב כדי לקבל ריכוז מוצע של 25 μM ליגורונומטר בפתרון היברידיזציה 35-uL לכל תא. התאימו את ריכוז האנטי-סנס. בזמן הדרוש הוסף מים מזוקקים ל-פורוזימטר כדי להביא את נפח הדנטורציה ל -10 μl.
הערה: בעקבות תגובת התיוג, מאוחסנים האוליונוקלאודים בתמיסה הקרה המכילה 0.18 מ' אשלגן, 23 מ"מ-HCl, 0.23 mg/mL BSA, 4.5 mM CoCl2, 18 מ"מ edta, 2.7 mM K-פוספט, ו-6.8 Mm kcl, 45 μm 2-Mercaptoethanol, 0.02% טריטון X-100, ו 2% גליצרול. הריכוזים גבוהים מספיק כי דילול עם המים יביא את הפתרון דנטורציה לריכוזים ליד 1 x TE (10 מ"מ טריס-HCl ו 1 מ"מ edta), מאגר מדיה רגילה של נוקלאוטידים. - הספרות לחפירות החפירה ו/או אלקסה פלואור 594 מסומנות ב-95 ° c עבור 5 דקות. לאחר מכן להוסיף 35 μL פתרון היברידיזציה טרי לכל חדר מיועד לחדרי ההקפאה. אם ביצוע של דג כפול, שתי הקבוצות של מחלת המין האנטי-הגיוניות עלולות להיות מהוכלא ביחד.
- הסר את הפתרון הקדם-היברידיזציה ולאחר מכן הוסף פתרון היברידיזציה המכילה את התאים המסומנים בתווית לתאי החיבור. המלון משלב בין לילה בחדר הלחות ב-37 מעלות צלזיוס עם רדיד פח כדי להגן על הלוגונואולוגאנוגורידים המתויגים.
הערה: הדגירה צריכה להיות לפחות 10 h ולא יותר מ 24 שעות. - למחרת, לשטוף את התאים פעמיים עם התחנה השנייה של 2 x עבור 10 דקות ב 37 ° c ולאחר מכן פעמיים עם 1x לפחות 10 דקות ב -25 ° c.
- תקן את התאים עם טרום מקורר 4% פורמלדהיד/1x PBS עבור 10-15 דקות על הקרח. ואז לשטוף את התאים עם PBS שלוש פעמים וחדירות עבור 1 h עם טרום מקורר 70% אתנול או 10 דקות עם pre-מקורר 0.5% טריטון-X/1x PBS ב 4 ° c.
- דגירה את התאים עם 1:200 נגד לחפור FITC ב טרום מקורר 0.1% BSA/1x PBS עבור 1 h ב 4 ° c. הסר את פתרון נוגדן ולשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS.
- תקן עם טרום מקורר 4% פורמלדהיד/1x PBS עבור 10-15 דקות ב 4 ° צ' ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS. במקרה של ביצוע אימונולופסיזציה למחשב מארח או חלבון נגיפי עם נוגדן ראשוני חד שבטיים, יש לחלחל את התאים ולאחר מכן לבצע את הפרוטוקול IF המתואר בשלב 3.3.1. אחרת, המשך לצביעת DAPI.
- דגירה את התאים עם 0.4 μg/mL DAPI ב טרום מקורר 0.5% טריטון-X/1x PBS עבור 15 דקות על הקרח ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS.
- טעינת שקופיות עם חרוזי פלורסנט (אופציונלי) ומדיום הרכבה. ואז לאטום את הכיסויים. לשקופית עם לק ברור
- באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, לאסוף תמונות של דגימות תוך שעה עד שבוע של ביצוע הפרוטוקול בהגדלה 630x. להחיל מספר מעילים של מסמר לק כדי לאטום את שובר הכיסוי כדי להאריך את החיים fluorophore ידי הפחתת שיעור של חמצון.
הערה: אין להשתמש במדיום הכולל המכיל DAPI. בשעת איסוף התמונות, כלול את סרגל הסרגל בכל תמונה לצורך כימות מאוחר יותר. חרוזי פלורסנט משמשים כפקדים של עוצמת קרינה פלואורסצנטית בין שקופיות לבין ההכנות לדוגמה11. השיגו תמונות בחלק האמצעי של התא לקוונפיקציה דו-ממדית (2D) בשלב 4.
4. הכמת של דגים ותמונות IF כדי להדגיש לוקליזציה subcellular כדי לקבוע את היחס הנוקלאולוציטוסמטי של הזריחה
- בצעו ניתוח תמונה בערימה שהורכבה של התמונות השונות של הפלורסנט והממוזגות כדי להבטיח עקביות. קבעו את קנה המידה של תוכנת ניתוח התמונה באמצעות סרגל הקנה מידה שנכלל בעת איסוף התמונות.
- כדי לכמת את עוצמת הקרינה הפלואורסצנטית על פני מספר ערוצים ובהתייחסות לכתם DAPI גרעיני, השתמש בכלי קו ובפונקציית פרופיל מזימה. לאחר מכן ציינו את הקו לצמיתות על עותק של התמונה באמצעות סמנים שאינם משפיעים על שיקול הדעת של הצופה.
- בסס קריטריונים להנחות במקומות שבהם הקו מצויר, כגון מעקב הלוכד מגוון של תכונות טופוגרפיות, פסגות ועמקים, לאורך ציר מרכזי או קו שאינו חוצה אזורים בעלי רוויה.
הערה: סימני הקווים האלה מתארים את הקרינה הגולמית בתא ולכן הם מוגבלים להשוואות של מיקומי הכתם, לא בעוצמה. כדי להשוות בין עוצמות הכתמים של אותו הכתם בין שקופיות, טיפולים או הכנות, הוסף מחרוז פלורסנט לשקופית כפקד פנימי במהלך שלב 3.13. חרוז פלורסנט יש להוסיף במהלך תהליך ההרכבה וזיהה עם הגדרות זהות על לייזר עירור ושפופרת פוטולטיפייר (confocal וקד).
- בסס קריטריונים להנחות במקומות שבהם הקו מצויר, כגון מעקב הלוכד מגוון של תכונות טופוגרפיות, פסגות ועמקים, לאורך ציר מרכזי או קו שאינו חוצה אזורים בעלי רוויה.
- כדי לכמת משמרת בלוקליזציה הסלולר, לחשב יחס נוקלאולוצילסמטי של תאים שעברו טיפולים שונים.
- למדוד את האזור ואת עוצמת הזריחה הגולמית של הגרעין הן הציטופלסמה באמצעות הכתם DAPI גרעינית כדי להגדיר את הגבול הפנימי. כלול שולטת גרעינית ו cytoplasmic כגון RNA גרעיני (g., KSHV פאן RNA) ו-RNA cytoplasmic (g., מארח מארחים של המרכז הרחב). יתר על כן, לחשב את עוצמת הרקע עבור שלושה אזורים כמו תא וממוצע הערכים לפיקסל או יקרומטר2.
הערה: ערכי העוצמה נוטים להיעדר יחידות ולכן המונח ' יחידות ' משמש. - לנרמל את הערכים הגרעיניים והסלולאריים בעוצמות התקשורת על-ידי קביעת הרקע הממוצע לאותו אזור ולאחר מכן הפחתת הערך האינדיווידואלי מעוצמת הגלם של האזור.
- לדוגמה, הגרעין של תא B-lytic יש שטח של 133.4 יקרומטר2 ו עוצמה גולמית של 75976 יחידות בעוד עוצמת הרקע של אותו אות פלורסנט נקבע להיות 0.67 יחידות לכל יקרומטר2. העוצמה הגרעינית המנורמלת תהיה
- לדוגמה, הגרעין של תא B-lytic יש שטח של 133.4 יקרומטר2 ו עוצמה גולמית של 75976 יחידות בעוד עוצמת הרקע של אותו אות פלורסנט נקבע להיות 0.67 יחידות לכל יקרומטר2. העוצמה הגרעינית המנורמלת תהיה
- הזן את הערכים במשוואה הבאה.
הערה: בקרי חישוב אלה עבור שינויים באזור משנה הסלולרית. האינדוקציה הליטיק וטיפולי הסמים יכולים להגדיל את הגרעין או לשנות את גודל התא, בהתאמה. - כדי לפרש את התוצאות, צור מזימה הקצבה תיבה. התפלגות שווה של אות הפלורסנט יהיה קרוב לאפס, בעוד התפלגות גרעינית לטובת ערך יחס חיובי התפלגות cytoplasmic היה מגמה לקראת ערך יחס שלילי.
- למדוד את האזור ואת עוצמת הזריחה הגולמית של הגרעין הן הציטופלסמה באמצעות הכתם DAPI גרעינית כדי להגדיר את הגבול הפנימי. כלול שולטת גרעינית ו cytoplasmic כגון RNA גרעיני (g., KSHV פאן RNA) ו-RNA cytoplasmic (g., מארח מארחים של המרכז הרחב). יתר על כן, לחשב את עוצמת הרקע עבור שלושה אזורים כמו תא וממוצע הערכים לפיקסל או יקרומטר2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטות ה-FISH ו-IF המפורטות בכתב יד זה מוצגות באיור 1 יחד עם כימות התוצאות בעקבות שורות של עוצמת פלורסנט. התוצאות המוצגות כאן הן למחצה כמותיים ומציעות תובנה לוקליזציה, ולא להשוואות בין עוצמות של כתמי פלורסנט שונים, משום שניסויים לא כללו מכלול פלורסנט בהכנה לשקופיות. איור 1 מגלה גם כי האזורים cytoplasmic והגרעין היחסים שלהם שונים הנסתר ו-lytic התאים הנגועים. לפיכך, האזור נשלט ביחס נוקלאולוצילסמטי לראווה באיור 2. איור 2 מאמת את החישוב המפורט בכתב יד זה עבור יחס נוקלאולוצילסמטי עם שימוש בשליטה גרעינית, הגרעין הגרעיני (פאן) של ה-RNA (PAN), ושליטה cytoplasmic, המארח של ה-mrna. איור 3 מגלה כי כאשר kshv שכפול ה-DNA הוא מעוכב בשלב lytic על ידי שימוש בחומצה פוספונאואצטט (doxy + צפות) או סידופוביר (doxy + cido), מוקדם ORF59-58 תעתיק לוקליזציה ברובו cytoplasmic. המיקרוגרפים ואת שתי שיטות הקוונפיקציה באיור 3 לתמוך בתוצאה זו ולגלות כי פאן RNA להציג אתרים גרעיניים ספציפיים למרות עיכוב של שכפול ה-DNA ויראלי ואת השינוי נראה עבור מוקדם ORF59-58 תעתיק.
איור 1: קווי עקבות של עוצמת פלורסנט לחשוף דקויות של היברידיזציה באתרו (דג) של התעתיקים של kshv ו immunofluorescence (IF) של תאי שכפול kshv. (A-B) מיקוד תמונות של TREx RTA (טטרציקלין inducible ויראלי שכפול ושעתוק activator חלבון) BCBL-1 תאים12 כי כבר המושרה לשלב lytic עבור 24 h עם דוקסיציקלין (doxy). סרגל בקנה מידה מציין 10 μm. (א) זריחה ב היברידיזציה באתרו (דג) עבור rnas ויראלי (ירוק) ו immunofluorescence (IF) עבור ויראלי מחייב חד-החלבון איגוד ה-DNA (ORF6/ssb) (אדום), רכיב של תאים שכפולים kshv, לחשוף כי תעתיקים ויראלי בתוך הציטופלסמה, גרעין, ב וקדי גרעינית מחוץ ORF6/ssb אזורים מועשרים, הידוע גם כתאי שכפול. הנוגדן נגד SSB10 היה מדולל כדי 1:200 ב 0.4% bsa/1X PBS ו זיהה עם 1:500 אנטי ארנב אלקסה fluor 594 נוגדן משני ב 0.4% bsa/1X PBS. כל מחלת האנטי-היגיון בשימוש בכל מחקר זה מסופקים בטבלה 1. זיהוי של ORF59-58 mRNA כולל הן את התעתיקים bicistronic ו-monocistronic. עם זאת, ב-KSHV נגוע JSC-1 תאים, mRNA monocionic הוא לפחות 18-קיפול פחות בשפע מאשר תעתיק bicistronic וכנראה תורם רק חלק מזערי של האות פלורסנט הכולל נצפתה13. יתר על כן, אחד של פאן RNA פורוזימטר (SB88) יכול גם לזהות את התעתיק הנגיפי עבור K7. האות מזיהוי של K7 לא יהיה משמעותי בהשוואה לאות גילוי KSHV פאן RNA, אשר קיים כמעט 80% של כל RNA polyadenylated בתוך תא KSHV מזוהם ליתיום14. בנוסף לאחד מארבעת החומרים האנטי-הגיוניים (tkv13) בזיהוי של k 8.1 mrna הוא מסוגל לאגד מספר איזופורמים של k 8.1 ואחרות של מסגרות קריאה פתוחות (orf). אות הדג מתוך מחלת הלוואי היחידה tkv13 אינו מספיק (הנתונים אינם מוצגים). הכלאה המשולב של ארבעת מונודיתים וכריכת החיבור שלהם על אותו תעתיק עשוי לספק את האות החזק שנצפה. קווים לבנים הנמצאים באגף (א) מתארים את נתיב הקו של עוצמות הקרינה של הדגים והאותות IF, המותווים ב (ג). (ב) הגדלת באופן דיגיטלי תמונות של תאים בתוך (א) מוקף קווים לבנים. עבור פשטות, ערוץ DAPI הכחול מושמט. (ג) המגרשים מראים את עוצמות הפלורסנט היחסיות לכל כתם לאורך אותה השורה: αSSB (אדום), תעתיקים ויראלי (ירוק; תעתיק המצוין בעלילה) ו-dapi (כחול). אזורים מוצללים מציינים אזורים מופחתים של DAPI המתאימים לתאי שכפול ויראלי או לאזורים מועשרים של SSB/ORF6. (ד) היחס של השטח הגרעיני לשינויים באזור הסלולר ולכן יחס האינטנסיביות הפלואורסצנטית המשמש ברחבי היה מנורמל לאזור. (ה) אזורים גרעיניים וסלולאריים שנמדדו עבור תאים RTA bcbl-1 עם וללא שעברו הפעלה lytic. שינויים משמעותיים סטטיסטית נראים לעומת תאים ללא המושרה. הקופסה ומגרשים הקצפה מייצגים את 10 ו 90 אחוזונים. האיור הודפס עם שינויים קלים של ואלארי, ווית, ועמיתים15 תחת רישיון מלאי ייחוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : שליטה אסטרטגיות דגים גרעיניות cytoplasmic לאמת את שיטת החישוב של היחס נוקלאולוצילפלסמטי. (א) דג עבור המארח החוצה mrna (אדום) ועבור הגרעין הגרעיני הנגיפי (פאן) הגרעינית (הירוק) ו dapi כתמים גרעיניים (כחול) הם בקרת דגים חיוביים עבור שיטת החישוב הקובע את היחס הנוקלאוציטוטוסמטי. מארח המחשב המארח מהווה מטרה קאנונית של אפקט שייטוף המארח של KSHV והוא מושפל באינדוקציה lytic כפי שמוצג כאן. (ב) כוונת הקרינה הפלואורסצנטית לאורך קו המצוין על ידי קווים לבנים מאגפים בתאי הבית (א). DAPI (כחול), פאן-RNA (ירוק), והגנד mRNA (אדום). אזורים מוצללים מוגדרים כמשמעותם באיור 1. (ג) כימות של עוצמות הקרינה הפלואורסצנטית של תאים המיוצגים על-ידי (א) (n = 150 עבור כל דגם של שלוש מעלות, n = 75 עבור הדגימות ORF59-58 או k) בוצעו עבור שלושה משכפל ביולוגי של תאים המוצגים באיור 2 ואיור 3 . פי-ערכים: > 0.05 (ns), < 0.05 (*), < 0.005 (* *) ו< 0.0005 (* * *). (ד) הנציג הצפוני כתם של RNA מ TREx RTA BCBL-1 תאים 24 שעות אחרי Doxy. הקופסא והחלקות מייצגות את ה -10 ו-90 אחוזון. האיור הודפס עם שינויים קלים של ואלארי, ווית, ועמיתים15 תחת רישיון מלאי ייחוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: עקבות שורה וחישוב של יחסי נוקלאוציטופטומיק לחשוף שינוי חזק הציטופלסמה עבור התעתיק המוקדם של LYTIC ORF59-58 על עיכוב של שכפול ה-DNA ויראלי. Trex rta bcbl-1 תאים טופלו עבור 24 שעות ללא תרופה (unind), דוקסיציקלין בלבד (doxy), או עם דוקסיציקלין ו אחד מעכבי של שכפול ה-DNA של הרפס, פוספוניאואצטט חומצה (doxy + צפות) או סידופוביר (doxy + cido). חלוניות (A-C) מציגות נתונים מדגימות שנאספו משלוש משכפל ביולוגי. (A) הערכים qpcr עבור DNA ויראלי תאיים במהלך עיכוב של שכפול ה-dna ויראלי היו מנורמל לכמות של ה-dna של מיזם של המארח תא מארח. (ב) כתם צפוני (משמאל) וכימות (מימין) להראות רמות RNA הכולל במהלך עיכוב של שכפול ה-DNA ויראלי. רמות לא המושרה של כל. הrnas היו בלתי מורגשת (ג) תמונות דגים מייצגים עבור ויראלי ORF59-58 התעתיקים (ירוק) ו-RNA פאן (אדום) על עיכוב של שכפול ה-DNA ויראלי. DAPI (כחול) היה הכתם הגרעיני. (ד) כימות של עוצמות הקרינה הפלואורסצנטית של תאים המיוצגים על ידי (C) (n = 75 כל אחד) נעשה על טרילקטים ביולוגיים. (ה) עוצמות האור הפלואורסצנטית לאורך קווים שצוירו על פני תאים המצוינים על ידי קווים לבנים (C) מוצגים: dapi (כחול), פאן RNA (אדום), ו-ORF59-58 mrna (ירוק). פי-ערכים: > 0.05 (ns), < 0.05 (*), < 0.005 (* *) ו< 0.0005 (* * *). הרצפים של כל מחלת האוליונואודים במחקר זה מסופקים בטבלה 1. הקופסה ומגרשים הקצפה מייצגים את 10 ו 90 אחוזונים. האיור הודפס מתוך וואלארי, ווית, ועמיתיו15 תחת רישיון מלאי ייחוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| האוליגוס הצפוני | |||||||
| . אוליגו לא | ג'ין | רצף | עמדה בתוך הגן | מיקום עם התייחסות NC 009333.1 הגנום (מספרים לא משקפים כיוון או סטרנד) | |||
| KORF50 | KSHV RTA/ORF50 | CGCATTGCGGTGGTTGAAATTGCTGG | 1284 עד 1309 | 73936 עד 73961 | |||
| JBW249 | KSHV סוקס/ORF37 | TAACCTGACACCACCAAACACACGGTCCAC | 262 עד 291 | 57633 עד 57662 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | מיכאל שלמה ברקת | 941 עד 967 (ORF59 ORF) | 95879 עד 95905 | |||
| tkv13 | KSHV K 8.1 | AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT | 16 ל 57 | 76029 עד 76070 | |||
| SB2 | א. ב. ה. רנ | מדריך ה, היכל העצמאות | 664 עד 687 | 29496 עד 29519 | |||
| מיכל | האדם האנושי | מוזיאון ה, מאגי | 319 עד 339 | N/A | |||
| דגים רגשים | |||||||
| . אוליגו לא | ג'ין | רצף | |||||
| SB2 | א. ב. ה. רנ | מדריך ה, היכל העצמאות | 664 עד 687 | 29496 עד 29519 | |||
| SB85 | א. ב. ה. רנ | CGCTGCTTTCCTTTCACATT | 373 עד 392 | 29205 עד 29224 | |||
| SB88 | א. ב. ה. רנ | מיכאל ברקת | 1 עד 22 | 28830 עד 28854 | |||
| tkv13 | KSHV K 8.1 | AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT | 16 ל 57 | 76029 עד 76070 | |||
| tkv14 | KSHV K 8.1 | TGATATTAAGGCATCGGTCAGTTCTGTGGTGGCCTGGA | 377 עד 414 | 76390 עד 76427 | |||
| tkv15 | KSHV K 8.1 | מרכז ה, בקרת כוהל | 461 עד 500 | 76474 עד 76513 | |||
| tkv16 | KSHV K 8.1 | מוזיאון ה, הפקות | 688 עד 725 | 76701 עד 76738 | |||
| tkv376 | KSHV ORF59-58 | כמוסות מגנט | 54 עד 79 | 96767 עד 96792 | |||
| tkv377 | KSHV ORF59-58 | מוטי ב, בעלי הגנה | 93 עד 122 | 96724 עד 96753 | |||
| tkv378 | KSHV ORF59-58 | AAGGCTATGCCAGCGTCGAGTACATTCGCA | 300 עד 329 | 96517 עד 96546 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | מיכאל שלמה ברקת | 941 עד 967 | 95879 עד 95905 | |||
| tkv380 | KSHV ORF59-58 | מיכאל שלמה | 1289 עד 1315 | 95531 עד 95557 | |||
| tkv381 | KSHV ORF59-58 | AAACACTGCTGACGCGCAGATCCATTCC | 1423 עד 1450 | 95396 עד 95423 | |||
| tkv382 | KSHV ORF59-58 | TACCTGTGTACTATTGGCGGCGCCTGATACAC | 1571 עד 1602 | 95244 עד 95275 | |||
| tkv383 | KSHV ORF59-58 | מוזיאון ה, מיכאל הלוי | 2136 עד 2173 | 94673 עד 94710 | |||
| סטאלריס | למעלה | שבוצעו על ידי Stellaris | N/A | N/A | |||
| קיוב התחל | |||||||
| tkv458 | יזם מגנד | כמוסות מגנט | N/A | N/A | |||
| tkv459 | יזם מגנד | מוזיאון התיירות | N/A | N/A | |||
| tkv319 | KSHV ORF39 (gM) | GTGAGGTGCTTCGCTGAGTT | N/A | 60075 עד 60094 | |||
| tkv320 | KSHV ORF39 (gM) | מיכל הגנה | N/A | 60218 עד 60237 | |||
| מיכל היסוד | |||||||
| מ455 | K8/K-bZIP העברת מיקוד | מיכל הכהן | 655 עד 673 | 75603 עד 75621 | |||
| מ456 | K8/K-bZIP היפוך הפוך qPCR פריימר עבור בלתי משולבים | היכל הגנה | 755 עד 774 | 75703 עד 75722 | |||
| מ457 | K8/K-bZIP היפוך הפוך qPCR פריימר עבור משולבים | CATCAGCATGTCGCGAAG | 871 עד 888 | 75819 עד 75836 | |||
| JBW479 | האדם הקדמי של RNase P | מיכאל שגיא | 238 עד 257 | N/A | |||
| JBW480 | הפוך האדם P הפוכה | GCGGAGGAGAGTAGTCTGAA | 317 עד 336 | N/A | |||
שולחן 1: כל השימוש בסוגי הליגונואו2 המשמש בניתוח של פרסום זה. שולחן 1 שוחזר באישור האגודה האמריקנית למיקרוביולוגיה תחת רישיון הייחוס היצירתי של וואלארי ואח '15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר בדו ח זה יכול להיות מותאם לסוגי תאים שונים וכולל שלבים עבור כפול RNA פיש ו-RNA דגים עם אם באמצעות שבטים מונוניים ונוגדנים ראשוניים רב שבטיים. למרות שקופיות מוכנות הם בדרך כלל בתמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, הדמיה ניתן לבצע עם מחסור בפליטה ממריצים) לאחר שינויים של ריכוז הנוגדן מוגבר מדיום הרכבה שונים. עבור ניתוח משופר של תאים בודדים, דגימות שהוכנו עם פרוטוקול זה עשוי גם להיות ממוין, התמונה, ונותחו על ידי סדרן תא או לזרום cytometer עם שינויים צנועים, כפי שמוצג על ידי Borah ועמיתים16. עם זאת, פרוטוקול זה אינו יכול להיות מאומץ לדימות תאים חיים.
שיטות הקוונפיקציה מפורטות מבטלות את הטיית התצפית ומשמשות לאימות משמרת נוקלאולוצילקלסמטי פוטנציאלית. היחס הנוקלאולוצילסמטי מצביע גם כאשר בסמנים מתכוונן להיות מפוזרים באופן שווה לאיתור בתא תת-תאי מסוים. התוצאות המוצגות כאן הן למחצה כמותית, בעוד שהפרוטוקול מתווה דרכים לחיזוק הקוונפיקציה. החוזק של יחס נוקלאולוצילסמטי ועקבות קו (שלב 4) תלוי בשימוש בחרוזי פלורסנט כמו בקרת עוצמה (שלב 3.13) והשימוש של סמנים subcellular ברורים, כגון אחד עבור הגרעין Lamin/C. בשלב זה, סמן גבול ברור אינו קיים עבור תאי שכפול ויראלי KSHV. ללא קשר, חישוב זה ניתן להרחיב לתאי subcellular אחרים עם שימוש של סמנים מתאימים.
המכשול העיקרי לפרוטוקול המפורט בדו ח זה הוא פיתוח אסטרטגיות דגים לתעתיקים ספציפיים (שלב 1). הצלחה מסתמכת על השפע והחוזק המחייב של מחלת המין האנטי-הגיונית. ספציפיות לתעתיקים מסוימים נעשה קשה עוד יותר על ידי נוכחות של חופפים מסגרות קריאה פתוחות (ORFs) בגנום ויראלי. לפיכך, התעתיקים הנגיפי יש לעתים קרובות רצף דמיון17 עם תעתיקים נגיפי אחרים מאותו אזור גנומית, במיוחד במקרה של הרפס. לעתים קרובות פיתוח אסטרטגיית דגים חייב לנצל את התעתיקים שופע יותר. כדי לפתור מחסור של אות דגים, משתמשים צריכים לבצע את פרוטוקול הדג עם האסטרטגיה של U2 snRNA דגים כדי לאשר כי טכניקות בתאים אנושיים והכנת ריאגנטים הם הולמים. כמו כן, the KSHV פאן RNA האסטרטגיה דגים יכול לאשר הפעלה lytic בתאים נגועים KSHV. כדי לפתור בעיות בכריכה של מחלת האנטי-סנס, המחברים ממליצים לפתח מספר מחלות אנטי-הגיוניות. אם הכל נכשל, האפשרות המסחרית זמינה כפי שניתן להדגים על ידי השימוש באסטרטגיית הדגים של הסרט באיור 2 ועל ידי ואלארי, ווית, ועמיתיו15.
אלגוריתמים חזקים יותר להגדרת גבולות הסלולר והתת-תאיים יחיסלו את ההטיה בקוונפיקציה. כמה תוכנות ניתוח התמונה האנליטית יכול להגדיר גבולות התא, הגרעין, ועוד, אבל דורשים סמנים סופי. מורפולוגיות תאים יוצאי דופן כגון תאי שכפול ויראלי קשים לתוכנה כזאת – אתגר לפיתוח עתידי. יתר על כן שיטות הקוונפיקציה המתוארות כאן מוגבלות לפרוסה אופטית אחת של תא (ניתוח תמונה דו-ממדית). בעוד רכישת תמונה 3d אפשרי18, הפיתוח העתידי של ניתוח 3d כמותי התמונה עשויה לספק תובנה נוספת בוויסות זמן רקתית של תאי שכפול ויראלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.
Acknowledgments
אנו מודים ליונתן רוזדנלס, קז'ימייז ' טיקובסקי ו ג'ואנה ב. ווית לקבלת ייעוץ בנוגע לניתוח נתונים. אנו גם מודים לג הייוורד. על נוגדן האנטי-SSB עבודה זו נתמכת על ידי מענקים T32GM007223 ו T32AI055403 מן המכונים הלאומיים לבריאות (ל TKV) ו-NIH מענק (CA16038) (כדי JAS). JAS הוא חוקר של המכון הרפואי הווארד יוז. איורים 1-3 ושולחן 1 שוחזרו באישור החברה האמריקנית למיקרוביולוגיה תחת רישיון ייחוס מלאי יצירתי מהפרסום הבא: Vallery, ט. ק., ווית, J. B., אנדו, ג'יי א., Steitz, J. א. קפוסי סרקומה של הקשורים מבנה mRNA הצטברות ב-Foci גרעינית מושפע DNA נגיפי שכפול ויראלי שאינם קידוד רב RNA גרעינית. כתב העת לוירולוגיה. 92 (13), דוי: 10.1128/jvi. 00220-18, (2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
References
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A.
- Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
- Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
- Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
- Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
- Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
- Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
- Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
- Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
- Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
- Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
- Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).
