Summary
Vi beskriver en protokol, der udnytter fluorescens in situ-hybridisering (FISH) til at visualisere flere herpes viral RNAs i lytisk inficerede humane celler, enten i suspension eller overholder. Denne protokol omfatter kvantificering af fluorescens, der producerer et nukleocytoplasmic-forhold, og kan udvides til samtidig visualisering af værts-og virale proteiner med immunofluorescens (IF).
Abstract
Mekanistisk indsigt kommer fra omhyggelig undersøgelse og kvantificering af specifikke RNAs og proteiner. De relative placeringer af disse biomolekyler i hele cellen på bestemte tidspunkter kan fanges med fluorescens in situ-hybridisering (fisk) og immunofluorescens (IF). Under lytisk herpes virus infektion, virussen kaprer værtscellen til fortrinsvis udtrykke virale gener, forårsager ændringer i cellernes morfologi og opførsel af biomolekyler. Lytiske aktiviteter er centreret i nukleare fabrikker, betegnet viral replikation rum, som kun kan skelne med fisk og hvis. Her beskriver vi en tilpasningsdygtig protokol af RNA fisk og hvis teknikker til Kaposis sarkom-associerede herpes virus (KSHV)-inficerede celler, både overholder og i suspension. Metoden omfatter trin til udvikling af specifikke anti-sense-oligonukleotider, dobbelt RNA-fisk, RNA-fisk med IF og kvantitative beregninger af fluorescens intensiteter. Denne protokol er blevet anvendt med succes på flere celletyper, ikke-inficerede celler, latente celler, lytiske celler, tids kurser og celler behandlet med hæmmere til at analysere de spatiotemporale aktiviteter af specifikke RNAs og proteiner fra både den menneskelige vært og KSHV.
Introduction
I deres lytisk (aktiv) fase, herpesvira kapre værtscellen, forårsager ændringer i celle morfologi og lokalisering af biologiske molekyler, at producere virions. Basen af operationer er kernen, hvor det dobbeltstrengede DNA-virale genom replikeres og pakkes ind i en proteinshell, kaldet et kapsid1. Til at begynde, virussen udtrykker sine egne proteiner, kapring værts maskiner og forhindre udtryk for ikke-væsentlige vært gener, en proces kaldet Host afspærring effekt. Størstedelen af denne aktivitet er lokaliseret til specifikke 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-fri nukleare regioner kaldet viral replikation rum, bestående af både vært og virale proteiner, RNAs, og viral DNA2. Cellen er overhalet for at give plads og ressourcer til replikeringsrum og dermed samling af virale capsid'er. Når kapsid forlader kernen, hvordan kapsid er indhyllet i cytoplasmaet at producere en membran-bundet viral partikel, også kendt som en virion, er uklar. Forståelse af lokalisering og rumlige forskydninger af både Host og viral biomolekyler i den lytiske fase giver dybere mekanistisk indsigt i arrangementet af replikeringsrum, Host afspærring effekt, virion-egress pathway og andre processer relateret til herpesviral infektion og replikation.
I øjeblikket den bedste metode til at opdage og studere disse ændringer er visualisering af proteiner og RNAs i inficerede celler med immunofluorescens (IF) og fluorescerende in situ hybridisering (fisk), hhv. Brug af et tidsforløb med disse teknikker afslører lokalisering af biomolekyler på centrale punkter i den lytiske fase eller blot, spatiotemporale data. FISK, og hvis supplere andre biokemiske teknikker, såsom hæmning af en cellulær proces (f. eks hæmning af viral DNA-replikation), RT-qPCR (real-time polymerase kædereaktion), RNA sekventering, nordlige blots, massespektrometri, vestlige blotting, og analyse af viral DNA-produktion, der kan give et mere globalt billede af cellulære aktiviteter.
Vi udviklede RNA-fiske strategier for at undersøge RNA-produkterne fra specifikke gener og en beregningsmæssige analyse, der kvantitativt beregner nukleocytoplasmic-forholdet for et bestemt genprodukt. Prøveforberedelsen, modificeret fra tidligere udgivelser af Steitz og kolleger3,4, er relativt let og kan bruges til både overtrædende og suspenderede celler. Protokollen kan også tilpasses til samtidig brug af flere RNA-fiske strategier (dobbelt RNA-fisk) eller RNA-fisk med IF-strategier. Udvikling af en specifik fiske strategi er udfordrende, men der skitseres forslag til forbedring af succes. Den dataanalyse, der er beskrevet her, er kvantitativ, hvis fluorescerende perler og stærke markører for rum grænser anvendes og giver yderligere indsigt i mikrografer, indsigt, som fjerner observation bias. Den detaljerede protokol er designet til både latente og lytiske celler inficeret med Kaposis sarkom-associeret herpes virus (KSHV) og kan bruges med ikke-inficerede celler eller celler inficeret med andre herpesvira5. Metoderne til kvantitation gælder for undersøgelser af nukleocytoplasmiske forskydninger eller udflytning mellem subcellulære rum i de fleste celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design af fluorescens in situ (FISH) antisense-oligonukleotider til påvisning af en specifik herpesviral udskrift
- Vælg 25 til 40 NT segmenter fra sekvensen af RNA af interesse og konverter til at være anti-sense. En vellykket fisk strategi kan indeholde fra en op til ti eller flere forskellige anti-sense oligonukleotider. Overvej følgende, når du vælger sekvenser:
- Hvis RNA af interesse indeholder en unik gentagelse region, derefter udnytte denne funktion og designe en anti-sense oligonukleotid til at målrette gentagelsessekvensen.
Bemærk: Tycowski og kolleger5 er et eksempel på denne strategi med rhesus rhadinovirus (rrv) polyadenyleret nuklear (pan) RNA. - Hvis RNA af interesse indeholder en kendt proteinbindende sted eller stem-loop struktur, design oligonukleotider at undgå disse regioner.
- Afhængigt af målene for forsøgene, overveje den intronic sekvens, og om ikke at designe en anti-sense oligonukleotid for det.
- Hvis RNA af interesse indeholder en unik gentagelse region, derefter udnytte denne funktion og designe en anti-sense oligonukleotid til at målrette gentagelsessekvensen.
- Udfør simple beregningsmæssige analyser af de valgte anti-sense-sekvenser for at sikre bindende specificitet og reducere aggregering af antisense-oligonukleotid.
- Sekvenserne skal være ca. 50% GC-rige (højt guanin-og cytosin-indhold) og have en smeltetemperatur i intervallet 60 til 70 °C.
- Brug et sekvens analysator værktøj til at vælge sekvenser, der ikke selv dimerize eller danner Hårnåle med smeltetemperaturer over 37 °C, hybridiserings temperaturen.
- Udfør en NCBI BLASTn (National Center for Biotechnology information grundlæggende lokal justering søgeværktøj til nukleotidalignments) søgning af de valgte sekvenser mod både Host og viral transkriptomes ved hjælp af "noget lignende" indstilling. Denne søgning vil identificere unikke anti-sense oligonukleotider, der ikke vil sandsynligvis binde sig til andre vært eller virale udskrifter.
Bemærk: Hvis transkriptomerne ikke er tilgængelige, kan du udføre BLAST søgningen med de genomiske sekvenser. Det er ideelt, hvis søgninger udføres på sekvenser fra virus isoleret fra de inficerede celler, der anvendes i forsøget, fordi vilde stammer tendens til at diversificere og indeholder en kombination af sekvenser fra forskellige Lab stammer.
- Bestil renset DNA-oligonukleotider svarende til den anti-sense sekvens, der er blevet verificeret beregningsmæssigt at være unik og sandsynligvis binde sig til målet RNA. Ingen særlige modifikationer skal indføres i oligonucleotides.
- Test de designede anti-sense oligonukleotider for bindende specificitet af fisk og Northern blot.
- Ved hjælp af en ikke-inficeret cellelinje fra de samme værtsarter (f. eks. 293t) og ideelt set den samme celletype, gennemfører en transfektering med et plasmid, der udtrykker RNA af interesse fra en robust promotor (CMV, Cytomegalovirus) og en med den tomme vektor (f. eks. pcDNA3). Brug en positiv kontrol for transfektering såsom Co-transfektering med et gfp (grønt fluorescerende protein) plasmid (f. eks. pmaxgfp) eller den vektor, der indeholder gfp.
Bemærk: det er vigtigt at undgå celle-linjer, der er blevet udødeliggjort ved hjælp af herpes virus Epstein-Barr virus (EBV), da der er sekvens ligheder mellem herpesvira. - Udfør fisk som beskrevet i punkt 3 på begge sæt celler med antisense-oligonukleotider som beskrevet i denne protokol. Udlede de succesfulde kandidater ved at sammenligne fiske eksperimenter med individuelle, par, eller sæt af anti-sense oligonucleotides. Brug en positiv kontrol for fiske protokollen sådanne U2 snRNA (små nukleare RNA) fisk, til stede ved 500.000 eksemplarer pr menneskecelle Nucleus6 (tabel 1).
- Det fluorescerende signal skal være specifikt og stærkt i cellen, der indeholder RNA af interesse. Design yderligere anti-sense oligonukleotider for at styrke signalet og fjerne anti-sense oligonukleotides, der binder nonspecifikt fra overvejelse. Signal styrken skal være over baggrunds-og autofluorescens.
- Test bindende specificitet af Northern blot.
- Ved hjælp af en ikke-inficeret cellelinje fra de samme værtsarter (f. eks. 293t) og ideelt set den samme celletype, gennemfører en transfektering med et plasmid, der udtrykker RNA af interesse fra en robust promotor (CMV, Cytomegalovirus) og en med den tomme vektor (f. eks. pcDNA3). Brug en positiv kontrol for transfektering såsom Co-transfektering med et gfp (grønt fluorescerende protein) plasmid (f. eks. pmaxgfp) eller den vektor, der indeholder gfp.
2. oligonukleotid og celle tilberedning
- Følg producentens anvisninger, brug Terminal transferase til at mærke anti-sense oligonukleotides med dioxigenin (DIG)-dUTP eller, hvis stærkt bindende, direkte med en fluorescerende nucleotid som Alexa fluor 594-5-dUTP. Efter mærkning, yderligere rensning er ikke nødvendig. Opbevar mærket oligonukleotider ved-20 °c op til flere år og i tinfolie, hvis den er direkte mærket for at forhindre foto blegning.
Forsigtig: mærknings opløsningen indeholder et giftigt materiale, kalium cacodylate. Håndtere mærknings reaktioner med handsker.
Bemærk: for at spare på ressourcerne kan flere forskellige antisense-oligonukleotider mærkes i én reaktion. Denne protokol udnytter 3 '-end mærkning. Intern mærkning er udfordrende, fordi den kemiske gruppe (fx grave eller fluorophore) bliver fanget eller ikke er i stand til at komme ind på det aktive sted for en DNA-Polymerase. Et eksperiment med to forskellige RNAs kan udføres ved hjælp af direkte mærkede anti-sense oligonukleotider og anti-dig immunofluorescens med en anden fluoroforet (f. eks. FITC (fluorescein) eller Alexa fluor 488 med Alexa fluor 594). - Klæber cellerne til de otte kammer slides.
Bemærk: otte-kammer slides tillade flere samtidige eksperimenter samtidig minimere dyrebare ressourcer som antistoffer. Et alternativ til otte kammer glider er en seks-brønd vævskultur plade med standard dæksedler (22 mm x 22 mm), der er begge sterile. Et lignende arrangement er muligt med cirkulære dæksedler og en 24-brønd vævskultur plade. For begge, øge mængderne nævnt i denne protokol med 10-15x (f. eks 1,75 mL hybridiseringsvæske), og 4X (f. eks, 600 μL hybridiseringsvæske) hhv.- For vedliggende lytiske celler anvendes 1x trypsin/PBS ved 37 °C og 5% CO2 i 10 min til at suspendere cellerne og fortyndes til 60% konfluency.
Bemærk: overholder cellelinjer, der anvendes i fiske eksperimenter inkluderet 293T, iSLK. 2197, og islk-BAC36 celler8. - Påfør 200 μL cellesuspension til hvert kammer i de sterile otte-Chambered-slides, og lad frøvæksten være i 12-24 h ved 37 °C og 5% CO2. Juster efter behov for langsomt-eller hurtigtvoksende celler og for celler, der let beskadiges af trypsin.
Bemærk: målet er at have jævnt fordelte celler solidt fastgjort til diaset. Overvej at inducere lytisk fase efter adhæsion, hvis de lytiske celler er skrøbelige. Konklusioner fra eksperimenter med iSLK celler er begrænset9. - For lytiske suspension-celler, pre-Treat otte-kammer glider med 1:10 poly L-lysin for 5 min under væv kultur hætte. Lad derefter slidene tørre natten over ved stuetemperatur eller 1 t ved 65 °C. Der inkubates 800 μL lytiske celler i en koncentration på 1 x 106 celler/ml med de chamberede slides i 30 min til 1 time ved 37 °c og 5% Co2.
Bemærk: suspension-celler vil bosætte sig i en monolayer, stikning til poly L-lysin og dermed overskydende celler er ikke en bekymring i forhold til vedliggende celler. Lytiske celler, der danner drueklynger, hvis det er muligt, bør adskilles af blid vortexning eller kemiske midler. Ganske vist har forfatterne ikke haft megen succes med sådanne anbefalinger i tilfælde af lytisk bjab-rrv-gfp-celler. Hvis suspension-celler ikke holder sig godt, overveje at øge enten tid eller koncentration af poly L-lysin inkubation.
- For vedliggende lytiske celler anvendes 1x trypsin/PBS ved 37 °C og 5% CO2 i 10 min til at suspendere cellerne og fortyndes til 60% konfluency.
3. fiksering, immunofluorescens (valgfri), hybridisering og visualisering af virale RNAs
- Fjern medier og overskydende celler. I hele denne protokol skal du bruge vakuum sugning til at fjerne opløsninger og blid mikropipettering for at tilføje løsninger.
Bemærk: styrken af et vakuum kan reduceres ved at placere en 200 μL mikropipette spids over glas Pasteur-pipetten. Udskift mikropipette spidsen mellem vaske trin for at undgå kontaminering. Hvert vaske trin skal udføres hurtigt, fordi det er bydende nødvendigt, at cellerne aldrig tørrer ud. - Fastgør straks cellerne med forkølet 4% formaldehyd/PBS (fosfat-bufferet saltvand) på is i 30 min. vask cellerne tre gange med 200 μL 1x PBS afkølet til 4 °C og Inkubér i 5 minutter ved stuetemperatur eller på is.
- Permeabilize de faste celler med 200 μL forkølet 0,5% Triton-X/PBS (fosfat bufferet saltvand) i 10 min på is eller 750 μL forkølet 70% ethanol ved 4 °C i 1 time (min.) til 7 d (maks.).
Bemærk: Indsaml protein, total RNA og genomiske DNA-prøver på fikserings stedet for at sikre konsistens mellem billeder og biokemiske analyser. Alle skyller i hele denne protokol udføres på samme måde, medmindre andet er angivet. 70% ethanol løsner limen mellem kamrene og sliden, som letter senere separation, og giver også en betydelig pause i protokollen. Ikke desto mindre, bruge paraffin film omkring kammeret slide for at reducere fordampning og kontrollere niveauet af ethanol i hvert kammer om hver 8 h. 70% ethanol fletter også cellerne, hvilket gør et skarpere billede, mens Triton-X ikke dehydrere cellerne og ændre dimensioner af cellen.
- Permeabilize de faste celler med 200 μL forkølet 0,5% Triton-X/PBS (fosfat bufferet saltvand) i 10 min på is eller 750 μL forkølet 70% ethanol ved 4 °C i 1 time (min.) til 7 d (maks.).
- Fjern kamrene forsigtigt for at forhindre revner i sliden. Hvis forsøget omfatter immunofluorescens (IF) af et viral eller Host protein med et polyklonal primært antistof, skal du udføre hvis som beskrevet nedenfor, før du fortsætter til RNA-fisk. Hvis immunofluorescensen anvender et monoklonalt primært antistof, skal du udføre immunofluorescens som beskrevet i trin 3.3.1 efter trin 3,11.
Bemærk: Brug en frisk fjernelse enhed eller en med meget lidt rester lim fra producenten og forsigtigt lette kamrene off for at forhindre diaset fra revner. Brug af 70% ethanol som permeabilizing reagens til 4 h reducerer i høj grad sandsynligheden for revner. I tilfælde af en revne, fortsætte protokollen om kamre ikke er berørt af revnen og være opmærksom på den højere oxidations hastighed af uperfekt forseglede lysbilleder (dvs. nedsat holdbarhed).- Skylle celler med præ-kølet 1x PBS og blok med forkølet 4% BSA (bovin serumalbumin)/1x PBS i 30 min ved 4 °C.
Bemærk: brugen af BSA i hele denne protokol begrænser ikke-specifik mærkning. - Fjern blokerings opløsningen, og Inkuber cellerne med 1:200 eller et andet polyklonal primært antistof i 0,1% BSA/1x PBS i 1 time ved 4 °C. Derefter vaskes tre gange med 1x PBS.
Bemærk: der blev anvendt et antistof10 til påvisning af SSB/ORF6 (viral enkeltstrenget DNA-bindingsprotein) ved 1:200 fortynding. - Cellerne inkubates med et sekundært antistof med fluoroforet, der er kompatibelt med det fiskdetekaliserende antistof i 1 time ved 4 °c. Vask tre gange med 1x PBS. Derefter Fix med 4% formaldehyd/1x PBS for 10-15 min og permeabilize med enten Triton-X eller 70% ethanol som tidligere beskrevet, før du fortsætter med at fiske. Cover slide med tin folie for at bevare fluorescerende signal og forhindre foto blegning.
- Skylle celler med præ-kølet 1x PBS og blok med forkølet 4% BSA (bovin serumalbumin)/1x PBS i 30 min ved 4 °C.
- Cellerne vaskes med 2x SSC (saltvands natriumcitrat) en gang, og derefter påføres 45 μL hybridiserings opløsning bestående af 50% formamid, 10% dextran sulfat, 2x SSC, 0,1% BSA, 500 μg/mL laksæds-DNA, 125 μg/mL E. coli tRNA og 1 mm vanadyl ribonucleosid Komplekser. Der inkubates i 1 time ved 37 °C i et fugtighedskammer, som kan være en 150 mm Petri skål med fugtet sterile vådservietter.
Bemærk: Forbered en frisk hybridiseringsvæske mindst en time før brug. Dextran-sulfaten opløses i vand først, mens den ofte hvirverer og inkuberet i et 37 °C-vandbad. - Beregn at have en foreslået koncentration på 25 μM oligonukleotider i 35-uL-hybridiseringsvæske pr. kammer. Justér koncentrationen af antisense-oligonukleotid efter behov. Tilsæt destilleret vand til oligonukleotider for at bringe Denaturerings volumenet op på 10 μL.
Bemærk: efter mærknings reaktionen lagres oligonukleotider i den afkølet opløsning, der indeholder 0,18 M kaliumcacodylate, 23 mM Tris-HCl, 0,23 mg/mL BSA, 4,5 mM CoCl2, 18 mm edta, 2,7 mm K-fosfat og 6,8 mm kcl, 45 μM 2-mercaptoethanol, 0,02% Triton X-100 og 2% glycerol. Koncentrationerne er høje nok til, at fortynding med vand vil bringe Denaturerings opløsningen til koncentrationer tæt på 1x TE (10 mM Tris-HCl og 1 mM EDTA), en standard oligonukleotid Denaturerings buffer. - Denature grave-og/eller Alexa fluor 594-mærkede oligonukleotider ved 95 °c i 5 min. Tilsæt derefter 35 μL frisk hybridiserings opløsning pr. beregnet kammer til de denaturerede oligonukleotider. Hvis der udføres dobbelt fisk, kan begge sæt antisense-oligonukleotider denatureres og hybridiseres sammen.
- Fjern præ-hybridiserings opløsningen, og tilsæt derefter hybridiserings opløsning, der indeholder de mærkede oligonukleotider til cellerne. Inkuber natten over i fugtigheds kammeret ved 37 °C med tin-folie for at beskytte de fluorophore-mærkede oligonukleotider.
Bemærk: inkubation skal være mindst 10 h og højst 24 timer. - Næste dag vaskes cellerne to gange med 2x SSC i 10 min ved 37 °C og derefter to gange med 1x SSC i 10 min ved 25 °C.
- Fastgør cellerne med forkølet 4% formaldehyd/1x PBS til 10-15 min på is. Derefter vaskes cellerne med PBS tre gange og permeabilize i 1 time med forkølet 70% ethanol eller i 10 min med forkølet 0,5% Triton-X/1x PBS ved 4 °C.
- Cellerne inkubates med 1:200 anti-DIG FITC i forkølet 0,1% BSA/1x PBS i 1 time ved 4 °C. Fjern antistof opløsningen og vask tre gange med 1x PBS.
- Fix med forkølet 4% formaldehyd/1x PBS for 10-15 min ved 4 °C og vask derefter tre gange med 1x PBS. Hvis der udføres immunofluorescens for en vært eller viral protein med et monoklonalt primært antistof, permeabilize cellerne og derefter udføre IF-protokollen skitseret i trin 3.3.1. Ellers gå videre til DAPI farvning.
- Cellerne inkubates med 0,4 μg/mL DAPI i forkølet 0,5% Triton-X/1x PBS i 15 min på is og vaskes derefter tre gange med 1x PBS.
- Monter slides med fluorescerende perler (valgfrit) og et monterings medium. Forsegl derefter dæksedlen til diaset med klar neglelak.
- Ved hjælp af en confokal mikroskop, indsamle billeder af prøverne inden for en time til en uge for at udføre protokollen ved 630x forstørrelse. Påfør flere lag neglelak at forsegle dækslet slip og forlænge fluoroforet liv ved at reducere hastigheden af oxidation.
Bemærk: Brug ikke et DAPI-indeholdende monterings medium. Når du samler billederne, skal du inkludere skala bjælken på hvert billede til senere kvantificering. Fluorescerende perler fungerer som kontrol af fluorescens intensitet mellem lysbilleder og prøve præparater11. Hent billeder i Midtersektionen af cellen for todimensionel (2D) kvantificering i trin 4.
4. kvantificering af fisk, og hvis billeder til at fremhæve subcellulære lokalisering og til at bestemme nukleocytoplasmic ratio af fluorescens
- Udfør billedanalyse på en samlet stak af de forskellige fluorescerende-farvede og fusionerede billeder for at sikre konsistens. Indstil skalaen på billedanalyse softwaren ved hjælp af skaleringsbjælken, der fulgte med, da billederne blev indsamlet.
- For at kvantificere fluorescens intensitet på tværs af flere kanaler og med henvisning til den nukleare DAPI-plet skal du bruge et linje værktøj og en plot profil funktion. Angiv derefter linjen permanent på en kopi af billedet ved hjælp af markører, der ikke hindrer eller påvirker seerens dom.
- Opstille kriterier til at vejlede, hvor linjen er tegnet, såsom et spor, der fanger en mangfoldighed af topografiske funktioner, toppe og dale, langs en central akse eller en linje, der ikke krydser overmættet områder.
Bemærk: disse linje spor skildrer rå fluorescens i en celle og er således begrænset til sammenligninger af placeringen af en plet, ikke intensitet. For at sammenligne intensiteter af samme plet mellem slides, behandlinger eller præparater, tilsættes en fluorescerende perle til diaset som en intern kontrol i trin 3,13. Den fluorescerende perle skal tilsættes under monteringsprocessen og detekteres med de samme indstillinger på excitation laser og Photomultiplier Tube (confocal).
- Opstille kriterier til at vejlede, hvor linjen er tegnet, såsom et spor, der fanger en mangfoldighed af topografiske funktioner, toppe og dale, langs en central akse eller en linje, der ikke krydser overmættet områder.
- For at kvantificere et skift i subcellulær lokalisering, Beregn nucleocytoplasmiske nøgletal for celler, der gennemgår forskellige behandlinger.
- Mål området og rå fluorescens intensitet af både kernen og cytoplasmaet ved hjælp af den nukleare DAPI-plet for at indstille den indre grænse. Omfatter nukleare og cytoplasmatiske Kontroller såsom et nukleart RNA (f. eks. KSHV PAN RNA) og cytoplasmisk RNA (f. eks. vært GAPDH mRNA). Desuden beregnes baggrunds intensitet for tre celle-lignende områder og gennemsnitlige værdierne pr. pixel eller μm2.
Bemærk: intensitetsværdier har en tendens til at mangle enheder, og derfor anvendes udtrykket "enheder". - Normaliser både nukleare og cellulære rå intensitetsværdier ved først at bestemme den gennemsnitlige baggrund for det samme område og derefter trække den individualiserede værdi fra områdets rå intensitet.
- F. eks. har en kerne af en lytisk B-celle et areal på 133,4 μm2 og en rå intensitet på 75976 enheder, mens baggrunds intensiteten for det samme fluorescerende signal blev fastlagt til at være 0,67 enheder pr. μm2. Den normaliserede nukleare intensitet ville være
- F. eks. har en kerne af en lytisk B-celle et areal på 133,4 μm2 og en rå intensitet på 75976 enheder, mens baggrunds intensiteten for det samme fluorescerende signal blev fastlagt til at være 0,67 enheder pr. μm2. Den normaliserede nukleare intensitet ville være
- Angiv værdierne i følgende ligning.
Bemærk: denne beregnings kontrol for ændringer i subcellulært område. Lytisk induktion og medicin behandlinger kan forstørre kernen eller ændre størrelsen af cellen, hhv. - For at fortolke resultaterne, oprette en kasse hale-plot. En ligelig fordeling af det fluorescerende signal ville være tæt på nul, hvorimod en nuklear distribution ville favorisere en positiv ratio værdi og en cytoplasmisk fordeling ville tendens mod en negativ ratio værdi.
- Mål området og rå fluorescens intensitet af både kernen og cytoplasmaet ved hjælp af den nukleare DAPI-plet for at indstille den indre grænse. Omfatter nukleare og cytoplasmatiske Kontroller såsom et nukleart RNA (f. eks. KSHV PAN RNA) og cytoplasmisk RNA (f. eks. vært GAPDH mRNA). Desuden beregnes baggrunds intensitet for tre celle-lignende områder og gennemsnitlige værdierne pr. pixel eller μm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FISKENE og de metoder, der er beskrevet i dette manuskript, er vist i figur 1 sammen med kvantificeringen af resultaterne ved hjælp af linje spor af fluorescerende intensitet. Resultaterne præsenteres her er semi-kvantitative og giver indsigt i lokalisering, snarere end i sammenligninger mellem intensiteter af forskellige fluorescerende pletter, fordi eksperimenter ikke omfatter en fluorescerende perle i slide forberedelse. Figur 1 afslører også, at cytoplasmatiske og nukleare områder og deres nøgletal er forskellige for latente og lytiske KSHV-inficerede celler. Således er arealet styres i nukleocytoplasmic ratio fremvist i figur 2. Figur 2 validerer beregningen detaljeret i dette manuskript for en nucleocytoplasmic ratio med brug af en nuklear kontrol, viral polyadenylated nukleare (pan) RNA, og en cytoplasmisk kontrol, VÆRTEN Gapdh mRNA. Figur 3 viser, at når KSHV-DNA-replikation hæmmes i den lytiske fase ved anvendelse af enten phosphonoeddikesyre (DOXY + paa) eller cidofovir (Doxy + Cido), skifter den tidlige ORF59-58-udskrift til en overvejende cytoplasmisk lokalisering. Mikrograferne og de to kvantificeringsmetoder i figur 3 understøtter dette resultat og afslører, at pan RNA lokaliserer til specifikke nukleare steder på trods af hæmning af viral DNA-replikation og ændringen ses for tidlig ORF59-58 transkriptionen.
Figur 1: linjer spor af fluorescerende intensitet afslører finesser i fluorescens in situ-hybridisering (fisk) af kshv-transskriptioner og immunofluorescens (IF) af kshv-replikeringsrum. (A-B) Konfokale billeder af Trex RTA (tetracyclin inducerbar viral replikation og transskription aktivator protein) bcbl-1 celler12 , der er blevet induceret i lytisk fase for 24 h med doxycyclin (Doxy). Skala bjælken angiver 10 μm.a) Fluorescens in situ-hybridisering (fisk) for viral RNAs (grøn) og immunofluorescens (IF) for viral enkeltstrenget DNA-bindingsprotein (ORF6/SSB) (rød), en bestanddel af KSHV-replikeringspulmenter, afslører, at virale udskrifter lokaliserer i cytoplasmaet, kernen, og i nukleare Foci uden for ORF6/SSB beriget områder, også kendt som replikation rum. Anti-SSB antistof10 blev fortyndet til 1:200 i 0,4% BSA/1x PBS og detekteret med 1:500 anti-kanin Alexa fluor 594 sekundært antistof i 0,4% BSA/1x PBS. Alle antisense-oligonukleotider, der anvendes i hele dette studie, er angivet i tabel 1. Påvisning af ORF59-58 mRNA omfatter både bicistronic og monocistronic transskriptioner. Men i KSHV-inficerede JSC-1 celler, monocistronic mRNA er mindst 18-fold mindre rigelige end bicistronic afskrift og sandsynligvis bidrager kun en mindre del af det samlede fluorescerende signal observeret13. Desuden kan en af PAN RNA oligonukleotides (SB88) også detektere viral udskrift for K7. Signalet fra en påvisning af K7 vil ikke være så signifikant i forhold til signalet afsløre KSHV PAN RNA, som er til stede på næsten 80% af alle polyadenyleret RNA i en lytisk KSHV-inficerede celle14. Desuden er en af de fire anti-sense oligonukleotider (tkv13) til påvisning af k 8.1 mRNA i stand til at binde sig til flere isoformer af k 8.1 og andre isoformer af nærliggende åbne læse rammer (ORF). FISKE signalet fra kun oligonukleotid tkv13 er utilstrækkeligt (data ikke vist). Den kombinerede hybridisering af de fire oligonukleotider og bindingen af dem på samme udskrift giver sandsynligvis det observerede stærke signal. Hvide linjer med ledsage af celler i (A) skildrer linje vejen for fluorescens intensiteter for fiskene og hvis signalerne, afbildet i (C). (B) digitalt zoomet billeder af celler i (A) flankeret af hvide linjer. For nemheds skyld er den blå DAPI-kanal udeladt. C) observationsområderne viser de relative fluorescerende intensiteter for hver plet langs samme linje: αSSB (rød), virale udskrifter (grøn; udskrift angivet på plot) og dapi (blå). Skraverede områder indikerer DAPI-reducerede områder, der svarer til virale replikeringsrum eller SSB/ORF6-beriget område. (D) forholdet mellem det nukleare område og cellernes område ændres, og dermed er det anvendte fluorescens intensitets forhold normaliseret i området. E) nukleare og cellulære områder målt for TREX RTA bcbl-1-celler med og uden lytisk aktivering. Der ses statistisk signifikante ændringer i forhold til ikke-inducerede celler. Boksen og hale-plots repræsenterer 10 og 90 percentiles. Figur genoptrykt med små modifikationer fra Vallery, Withers og kollegaer15 under en Creative Commons Attribution-licens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Kontrol af nukleare og cytoplasmiske fisk strategier validere beregningsmetoden for nucleocytoplasmic ratio. (A) fisk til VÆRTEN Gapdh mRNA (rød) og til viral polyadenyleret nuklear (pan) lncRNA (grøn) og dapi nuklear farvning (blå) er positive fiske kontrol for beregningsmetoden, der bestemmer nukleocytoplasmic ratio. Host gapdh mRNA er et kanonisk mål for kshv's Host afspærring-effekt og nedbrydes ved lytisk induktion som vist her. B) Fluorescens intensiteter langs en linje, der er angivet med hvide linjer, der flanken lytiske celler i litra a). DAPI (blå), PAN-RNA (grøn) og GAPDH mRNA (rød). Skraverede områder er som defineret i figur 1. C) kvantificering af fluorescens intensiteter for celler repræsenteret ved (A) (n = 150 for hver gapdh-prøve, n = 75 for prøverne ORF59-58 eller k 8.1) blev udført for tre biologiske replikater af celler vist i figur 2 og figur 3 . P-værdier: > 0,05 (NS), < 0,05 (*), < 0,005 (* *) og < 0.0005 (* * *). (D) repræsentativt Northern blot af RNA fra TREx RTA BCBL-1 celler 24 h efter Doxy. Boksen og hale-plots repræsenterer 10 og 90 percentil. Figur genoptrykt med små modifikationer fra Vallery, Withers og kollegaer15 under en Creative Commons Attribution-licens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: linje spor og beregning af nukleocytoplasmiske nøgletal afslører et stærkt Skift til cytoplasmaet for de tidlige LYTISKE ORF59-58 transkriptionen ved hæmning af viral DNA-replikation. TREx RTA BCBL-1-celler blev behandlet for 24 timer uden lægemiddel (Unind), doxycyclin (Doxy), eller med doxycyclin og en hæmmer af herpesviral DNA-replikation, phosphonoeddikesyre (Doxy + PAA) eller cidofovir (Doxy + Cido). Paneler (A-C) viser data fra prøver indsamlet fra tre biologiske replikater. (A) qPCR-værdier for viral intracellulært DNA under hæmning af viral DNA-replikering blev normaliseret til mængden af promotor-DNA fra værtscellens gapdh-gen. (B) Northern blot (venstre) og kvantificering (højre) viser totale RNA-niveauer under hæmning af viral DNA-replikering. Ikke-inducerede niveauer af alle RNAs var målbart. C) repræsentative fiske billeder for viral ORF59-58 transkriptioner (grøn) og pan RNA (rød) ved hæmning af viral DNA-replikation. DAPI (blå) var den nukleare plet. D) kvantificering af fluorescens intensiteter for celler repræsenteret ved (C) (n = 75 hver) blev udført på biologiske triplicater. E) Fluorescens intensiteter langs linjer, der er trukket på tværs af celler angivet med hvide linjer i (C), vises: dapi (blå), Pan-RNA (rød) og ORF59-58 mRNA (grøn). P-værdier: > 0,05 (NS), < 0,05 (*), < 0,005 (* *) og < 0.0005 (* * *). Sekvenserne af alle oligonukleotider i dette studie er angivet i tabel 1. Boksen og hale-plots repræsenterer 10 og 90 percentiles. Figur Genoptrykt fra Vallery, Withers og kolleger15 under en Creative Commons Attribution-licens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Nordlige oligos | |||||||
| Oligo nej. | Gen | Sekvens | Position inden for genet | Position med referencen NC 009333.1 Genome (tal afspejler ikke retning eller streng) | |||
| KORF50 | KSHV RTA/ORF50 | CGCATTGCGGTGGTTGAAATTGCTGG | 1284 til 1309 | 73936 til 73961 | |||
| JBW249 | KSHV SOX/ORF37 | TAACCTGACACCACCAAACACACGGTCCAC | 262 til 291 | 57633 til 57662 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCGGTATAGAATCGGGAACCT | 941 til 967 (ORF59 ORF) | 95879 til 95905 | |||
| tkv13 | KSHV K 8.1 | AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT | 16 til 57 | 76029 til 76070 | |||
| SB2 | KSHV PAN RNA | ACAAATGCCACCTCACTTTGTCGC | 664 til 687 | 29496 til 29519 | |||
| RNase P | Human RNase P | TGGGCGGAGGAGAGTAGTCTG | 319 til 339 | Nielsen | |||
| FISH probes | |||||||
| Oligo nej. | Gen | Sekvens | |||||
| SB2 | KSHV PAN RNA | ACAAATGCCACCTCACTTTGTCGC | 664 til 687 | 29496 til 29519 | |||
| SB85 | KSHV PAN RNA | CGCTGCTTTCCTTTCACATT | 373 til 392 | 29205 til 29224 | |||
| SB88 | KSHV PAN RNA | GTGAAGCGGCAGCCAAGGTGACTGG | 1 til 22 | 28830 til 28854 | |||
| tkv13 | KSHV K 8.1 | AAGGCATAGGATTAGGAGCGCCACAGGGATTTCTGTGCGAAT | 16 til 57 | 76029 til 76070 | |||
| tkv14 | KSHV K 8.1 | TGATATTAAGGCATCGGTCAGTTCTGTGGTGGCCTGGA | 377 til 414 | 76390 til 76427 | |||
| tkv15 | KSHV K 8.1 | GTAAGGTTACGCTTTATCCCTACACACCGACGGTTTACCC | 461 til 500 | 76474 til 76513 | |||
| tkv16 | KSHV K 8.1 | GGACAAGTCCCAGCAATAAACCCACAGCCCATAGTATG | 688 til 725 | 76701 til 76738 | |||
| tkv376 | KSHV ORF59-58 | TAATGTGTTCATTGACCCTCCTGATT | 54 til 79 | 96767 til 96792 | |||
| tkv377 | KSHV ORF59-58 | GCCGATCCGTGCACTTGCACTACTCCGGTT | 93 til 122 | 96724 til 96753 | |||
| tkv378 | KSHV ORF59-58 | AAGGCTATGCCAGCGTCGAGTACATTCGCA | 300 til 329 | 96517 til 96546 | |||
| tkv379 | KSHV ORF59-58 | TGGAGTCCGGTATAGAATCGGGAACCT | 941 til 967 | 95879 til 95905 | |||
| tkv380 | KSHV ORF59-58 | AAAGAGTGTGAACGAGTACAGGGCCTT | 1289 til 1315 | 95531 til 95557 | |||
| tkv381 | KSHV ORF59-58 | HAR du en af de mest... | 1423 til 1450 | 95396 til 95423 | |||
| tkv382 | KSHV ORF59-58 | TACCTGTGTACTATTGGCGGCGCCTGATACAC | 1571 til 1602 | 95244 til 95275 | |||
| tkv383 | KSHV ORF59-58 | Har du en anden til at gøre det, så... | 2136 til 2173 | 94673 til 94710 | |||
| Stellaris | GAPDH | Premade by Stellaris | Nielsen | Nielsen | |||
| qPCR Primers | |||||||
| tkv458 | GAPDH Promoter | CTGCACCACCAACTGCTTAG | Nielsen | Nielsen | |||
| tkv459 | GAPDH Promoter | GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT | Nielsen | Nielsen | |||
| tkv319 | KSHV ORF39 (gM) | GTGAGGTGCTTCGCTGAGTT | Nielsen | 60075 til 60094 | |||
| tkv320 | KSHV ORF39 (gM) | CCTGGGTCAAGCTGTTGTTT | Nielsen | 60218 til 60237 | |||
| RT-qPCR Primers | |||||||
| TKV 455 | K8/K-bZIP Forward RT qPCR primer | CGAAAGCAAGGCAGATACG | 655 til 673 | 75603 til 75621 | |||
| TKV 456 | K8/K-bZIP reverse RT qPCR primer til usplejret | GCCATTGTTCCCATTTGAGT | 755 til 774 | 75703 til 75722 | |||
| TKV 457 | K8/K-bzip reverse rt qPCR primer til splejset | CATCAGCATGTCGCGAAG | 871 til 888 | 75819 til 75836 | |||
| JBW479 | Human RNase P fremad | AGCTTGGAACAGACTCACGG | 238 til 257 | Nielsen | |||
| JBW480 | Human RNase P omvendt | GCGGAGGAGAGTAGTCTGAA | 317 til 336 | Nielsen | |||
Tabel 1: alle oligonukleotider, der anvendes i analyserne af denne publikation. Tabel 1 blev gengivet med tilladelse fra American Society for Microbiology under en Creative Commons Attribution-licens fra Vallery et al.15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet i denne rapport, kan tilpasses til forskellige celletyper og omfatter trin for dobbelt RNA-fisk og RNA-fisk med ved brug af både monoklonale og polyklonale primære antistoffer. Selvom forberedte slides typisk er afbildet med et konfokalt mikroskop, kan billeddannelse udføres med et STED (stimuleret udlednings udtynding) mikroskop efter ændringer af øget antistofkoncentration og et andet monterings medium. For øget analyse af individuelle celler, kan prøver udarbejdet med denne protokol også sorteres, imaged, og analyseres ved en celle sortering eller flow flowcytometer med beskedne ændringer, som vist af Borah og kolleger16. Denne protokol kan dog ikke vedtages for levende celle billeder.
De kvantificeringsmetoder detaljeret eliminere observation bias og tjene til at validere en potentiel nucleocytoplasmic Skift. Nucleocytoplasmic forholdet peger også, når en biomolekyle justerer fra at være jævnt spredt til lokalisering i et bestemt subcellulært rum. De resultater, der præsenteres her, er semikvantitative, mens protokollen skitserer, hvordan kvantificeringen kan styrkes. Styrken af nucleocytoplasmic ratio og linje spor (trin 4) afhænger af brugen af fluorescerende perler som intensitet kontrol (trin 3,13) og brugen af klare subcellulære markører, såsom en for nuklear Lamin A/C. På dette tidspunkt findes der ikke en klar grænse markør for KSHV viral replikeringsrum. Uanset, denne beregning kan udvides til andre subcellulære segmenter med brug af passende markører.
Den største forhindring for den protokol, der er beskrevet i denne rapport, er udviklingen af fiske strategier for specifikke udskrifter (trin 1). Succes afhænger af den overflod og bindende styrke af anti-sense oligonukleotider. Specificitet til bestemte udskrifter gøres endnu vanskeligere ved tilstedeværelsen af overlappende åbne læse rammer (Orf'er) i virale genomer. Således, virale udskrifter ofte har sekvens lighed17 med andre virale udskrifter fra samme genomisk region, især i tilfælde af herpesvira. Ofte udvikling af en fisk strategi skal drage fordel af mere rigelige udskrifter. For at fejlfinde en mangel på et fiske signal skal brugerne udføre fiske protokollen med U2 snRNA-fiske strategien for at bekræfte, at teknikker i humane celler og klargøring af reagenser er tilstrækkelige. På samme måde kan KSHV PAN RNA FISH Strategy bekræfte lytisk aktivering i KSHV-inficerede celler. For at foretage fejlfinding af binding af anti-sense-oligonukleotider anbefaler forfatterne at udvikle flere antisense-oligonukleotider. Hvis alle fejler, en kommerciel mulighed er tilgængelig som påvist ved brug af GAPDH fisk strategi i figur 2 og af Vallery, Withers, og kolleger15.
Stærkere algoritmer til at definere de cellulære og subcellulære grænser ville yderligere eliminere kvantificering bias. Nogle analytiske billedbehandling software kan sætte grænser for cellen, kernen, og mere, men kræver definitive markører. Usædvanlige celle morfologier som viral replikation rum er vanskelige for sådan software-en udfordring for den fremtidige udvikling. Desuden er de kvantificeringsmetoder, der er beskrevet her, begrænset til ét optisk udsnit af en celle (2D-billedanalyse). Mens 3D-billed erhvervelse er mulig18, kan fremtidig udvikling af en kvantitativ 3D-billedanalyse give yderligere indsigt i spatiotemporale regulering af virale replikeringsrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Jonathan Rodenfels, Kazimierz Tycowski og Johanna B. Withers for rådgivning om dataanalyse. Vi takker også G. Hayward for anti-SSB antistof. Dette arbejde blev støttet af tilskud T32GM007223 og T32AI055403 fra National Institutes of Health (to TKV) og NIH Grant (CA16038) (til JAS). JAS er undersøger af Howard Hughes Medical Institute. Figur 1-3 og tabel 1 blev gengivet med tilladelse fra American Society for Microbiology under en Creative Commons Attribution-licens fra følgende publikation: Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposis sarkom-associeret Herpes virus mRNA ophobning i nukleare Foci er påvirket af viral DNA-replikation og viral Noncoding Polyadenyleret nukleare RNA. Tidsskrift for virologi. 92 (13), Doi: 10.1128/jvi. 00220-18, (2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlexaFluor594-5-dUTP | Life Technologies | C1100 | |
| anti-DIG FITC | Jackson Lab Immunologicals | 200-092-156 | |
| Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody | Invitrogen | A-11037 | Goat |
| Anti-SSB Antibody | N/A | N/A | Ref. Chiou et al. 2002 |
| BLASTn | NIH NCBI | N/A | Free Sequence Alignment Software |
| Dextran Sulfate | Sigma Aldrich | D8906 | Molecular Biology Grade |
| DIG-Oligonucleotide Tailing Kit | Sigma Roche | #03353583910 | 2nd Gen |
| Eight-Chamber Slides | Nunc Lab Tek II | #154453 | Blue seal promotes surface tension but separation by clear gel is also available. |
| Formamide | Sigma Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| GAPDH Probes | Stellaris | SMF-2019-1 | Compatible with protocol, Quasar 670 |
| ImageJ | NIH, Bethesda, MD | N/A | Free Image Analysis Software, [http:rsb.info.nih.gov/ij/] |
| OligoAnalyzer | IDT | N/A | Free Oligonucleotide Analyzer |
| pcDNA3 | Invitrogen | A-150228 | |
| pmaxGFP | Amaxa | VDF-1012 | |
| Poly L-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 | |
| Terminal Transferase | Sigma Roche | #003333574001 | |
| Vanadyl Ribonucleoside Complexes | NEB | S1402S | |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | DAPI within the mounting media scatters the light and reduces contrast. |
References
- Amen, M. A., Griffiths, A. Packaging of Non-Coding RNAs into Herpesvirus Virions: Comparisons to Coding RNAs. Frontiers in Genetics. 2, 81 (2011).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A.
- Pawlicki, J. M., Steitz, J. A. Primary microRNA transcript retention at sites of transcription leads to enhanced microRNA production. Journal of Cell Biology. 182 (1), 61-76 (2008).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. Public Library of Science Pathogens. 7 (10), e1002300 (2011).
- Tycowski, K. T., Shu, M. D., Borah, S., Shi, M., Steitz, J. A. Conservation of a triple-helix-forming RNA stability element in noncoding and genomic RNAs of diverse viruses. Cell Reports. 2 (1), 26-32 (2012).
- Weinberg, R. A., Penman, S. Small molecular weight monodisperse nuclear RNA. Journal of Molecular Biology. 38 (3), 289-304 (1968).
- Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. Journal of Virology Methods. 174 (1-2), 12-21 (2011).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. Journal of Virology. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Sturzl, M., Gaus, D., Dirks, W. G., Ganem, D., Jochmann, R. Kaposi's sarcoma-derived cell line SLK is not of endothelial origin, but is a contaminant from a known renal carcinoma cell line. International Journal of Cancer. 132 (8), 1954-1958 (2013).
- Chiou, C. J., et al. Patterns of gene expression and a transactivation function exhibited by the vGCR (ORF74) chemokine receptor protein of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Journal of Virology. 76 (7), 3421-3439 (2002).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Nakamura, H., et al. Global changes in Kaposi's sarcoma-associated virus gene expression patterns following expression of a tetracycline-inducible Rta transactivator. Journal of Virology. 77 (7), 4205-4220 (2003).
- Majerciak, V., Yamanegi, K., Zheng, Z. M. Gene structure and expression of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus ORF56, ORF57, ORF58, and ORF59. Journal of Virology. 80 (24), 11968-11981 (2006).
- Sun, R., Lin, S. F., Gradoville, L., Miller, G. Polyadenylylated nuclear RNA encoded by Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Proceedings of the National Academy Sciences U S A. 93 (21), 11883-11888 (1996).
- Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA. Journal of Virology. 92 (13), (2018).
- Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry. RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).
- Bruce, A. G., et al. Quantitative Analysis of the KSHV Transcriptome Following Primary Infection of Blood and Lymphatic Endothelial Cells. Pathogens. 6 (1), (2017).
- Chen, C. P., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. Journal of Virology. 91 (11), (2017).
