Summary
Galleria wasmot werd onlangs opgericht als een reproduceerbaar, goedkoop, en ethisch aanvaardbare infectie model voor de Mycobacterium tuberculose complex. Hier beschrijven en demonstreren we de stappen die genomen zijn om succesvolle infectie van G. wasmot met bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux vast te stellen .
Abstract
Tuberculose is de leidende wereldwijde oorzaak van besmettelijke ziekte sterfte en ongeveer een kwart van de wereldbevolking wordt verondersteld te worden besmet met Mycobacterium tuberculose. Ondanks decennia van onderzoek, moeten veel van de mechanismen achter het succes van M. tuberculose als pathogene organisme worden onderzocht, en de ontwikkeling van veiliger, efficiëntere antimycobacterial drugs is dringend nodig om de stijging te behandelen en verspreiding van resistente tuberculose. Echter, de progressie van tuberculose onderzoek is knelpunten door de traditionele zoogdier infectie modellen die zijn duur, tijdrovend, en ethisch uitdagend. Eerder hebben we de larven van het insect Galleria wasmot (grotere Wax Moth) als een nieuwe, reproduceerbare, lage kosten, high-throughput en ethisch aanvaardbaar infectie model voor de leden van de M. tuberculose complex. Hier beschrijven we het onderhoud, de voorbereiding en de infectie van G. wasmot met bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux. Met behulp van deze infectie model, mycobacteriële dosisafhankelijke virulentie kan worden waargenomen, en een snelle uitlezing van in vivo mycobacteriële last met behulp van bioluminescentie metingen is gemakkelijk haalbaar en reproduceerbaar. Hoewel er beperkingen bestaan, zoals het ontbreken van een volledig geannoteerde genoom voor transcriptomics analyse, kan ontologische analyse tegen genetisch gelijkaardige insecten worden uitgevoerd. Als een lage kosten, snel en ethisch aanvaardbaar model voor tuberculose, G. wasmot kan worden gebruikt als een pre-Screen om de effectiviteit van geneesmiddelen en toxiciteit te bepalen, en om te bepalen vergelijkende mycobacteriële virulentie voorafgaand aan het gebruik van conventionele zoogdieren Modellen. Het gebruik van het G. wasmot-mycobacteriën-model zal leiden tot een vermindering van het grote aantal dieren dat momenteel in het tuberculose onderzoek wordt gebruikt.
Introduction
Tuberculose (TB) is een belangrijke bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid met 9.000.000 nieuwe gevallen per jaar en 1.500.000 sterfgevallen1. Bovendien wordt geschat dat een kwart van de wereldbevolking is geïnfecteerd met de oorzakelijke agent van de ziekte, Mycobacterium tuberculose (MTB). Onder de geïnfecteerde bevolking, 5 − 10% zal de ontwikkeling van actieve TB ziekte over hun leven. Bovendien, de opkomst en verspreiding van multi-drug resistente (MDR) en uitgebreid-drug (XDR) resistente MTB vormt een ernstige bedreiging voor de Ziektebestrijding, met 123 landen de rapportage ten minste een XDR geval1. Behandeling van TB vereist een cocktail van ten minste vier anti-mycobacteriële geneesmiddelen, waarvan isoniazid en rifampicin worden voorgeschreven voor een minimumduur van zes maanden; de behandeling wordt vaak geassocieerd met complexe bijwerkingen en toxische effecten. Bescherming tegen de enige licentie vaccin tegen TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-GUÉRIN (BCG), is variabel2. Een onvolledig begrip van de pathogenese van TB belemmert de ontwikkeling van nieuwe therapeutische en vaccinatiestrategieën aanzienlijk.
Voor decennia dierlijke infectie modellen zijn van vitaal belang voor TB onderzoek naar de fundamentele pathogenese en gastheer reactie op infectie te begrijpen, en om nieuwe anti-mycobacteriële agenten, immuun-therapeutische en nieuw vaccin kandidaten3te evalueren, 4. echter, onderzoek met behulp van dierlijke infectie modellen van TB is berucht moeilijk als de pathogenese en progressie van TB-infectie zijn complex, en er is geen enkel diermodel dat het volledige spectrum en de belangrijke kenmerken van de ziekte nabootst5 ,6. Bovendien zijn dierproeven duur, tijdrovend om te ondernemen en vereisen volledige ethische rechtvaardiging. Toch zijn dierlijke infectie modellen van TB beschreven in niet-menselijke primaten (bijv. Makaken), cavia's, konijnen, vee, varkens, muizen en zebravis, met elk met hun beperkingen3,4. De muizenmodel is het meest gebruikte model als gevolg van kosten, beschikbaarheid van ingeteelde lijnen, reproduceerbaarheid van de infectie en de overvloed van immunologische reagentia. Echter, ze niet typisch vorm granulomen geassocieerd met gebieden van hypoxie die kenmerkend zijn voor latente tuberculose-infectie (LTBI)6. Cavia's zijn zeer gevoelig voor MTB -infectie, met pathologie en vroege granuloomvorming vergelijkbaar met die in de mens, en worden veel gebruikt in vaccin testen; Toch is het gebrek aan immunologische reagentia belemmert het gebruik ervan als een infectie model7. Zebravis zijn geschikt voor grootschalige screening in vroege stadia Preklinische studies vanwege hun geringe omvang, snelle voortplanting en geavanceerde genetische hulpmiddelen, maar zijn anatomisch en fysiologisch verschillend van de mens en zijn alleen vatbaar voor Mycobacterium Marinum besmetting3. De diermodellen die het meest lijken op de menselijke MTB -infectie zijn niet-menselijke primaten (bijvoorbeeld de Makaken), maar ze zijn duur en hebben belangrijke ethische en praktische overwegingen die aanzienlijk beperkt hun gebruik8.
De insecten larve van de grotere Wax mot of honingraat mot, Galleria wasmot, zijn steeds populairder geworden als een infectie model voor een verscheidenheid van bacteriële en schimmel pathogenen9, en als een scherm voor nieuwe antimicrobiële drugs kandidaten 10. G. wasmot is een succesvolle ongewervelde model te wijten aan zijn verfijnde aangeboren immuunsysteem (bestaande uit cellulaire en humorale verdediging) dat een hoge mate van structurele en functionele gelijkenis met die van gewervelde dieren11 aandelen . Dit omvat immune mechanismen zoals fagocytose van ziekteverwekkers door hemocytes (functioneel gelijkaardig aan zoogdier macrofagen en neutrofielen)12,13, de productie en de omloop van anti-microbiële peptides (versterkers) en aanvulling-als proteïnen binnen hemolymph (analoog aan zoogdier bloed) van G. wasmot11. Andere voordelen9,14,15 van G. wasmot de larven als model omvatten 1) hun grote grootte (20 − 30 mm) die voor gemakkelijke manipulatie en besmetting toestaat, evenals de inzameling van weefsel en hemolymph voor analyses, 2) gemakkelijk onderhoud bij 37 °C, geschikt voor het bestuderen van menselijke pathogenen, 3) precieze infectie door injectie zonder de noodzaak voor anesthesie, 4) effectiviteit van antimicrobiële stoffen kan worden beoordeeld met behulp van minder drugs voor de evaluatie, 5) gebrek aan ethische beperkingen ten opzichte van het gebruik van zoogdieren, 6) de grote groepsgrootte kan worden gebruikt in vergelijking met dierlijke modellen die grotere reproduceerbaarheid toestaan, en 7) kortere tijden voor besmettings experimenten zijn vereist.
In een recente studie, hebben we aangetoond dat G. wasmot kan worden gebruikt als een nieuwe infectie model voor het bestuderen van de pathogenese van de infectie door bioluminescent M. bovis BCG Lux, een genetisch gemodificeerde versie van het vaccinstam en de lidstaten van de MTB -complex (MTBC)16. Terwijl G. wasmot eerder is gebruikt als een infectie model voor niet-tuberculose mycobacteriën (NTM), voornamelijk M. marinum en Mycobacterium abcesus17,18, studies met behulp van MTBC zijn beperkt tot dat van Li et al.16. Bioluminescent niet-pathogene mycobacteriële stammen, die kunnen worden gebruikt op insluiting niveau (CL) 2 als een surrogaat voor MTB, bieden de voordelen van veiligheid en uitvoerbaarheid over pathogene mycobacteriën. Na besmetting met BCG Lux, beginnen de larven vroege granuloom-als structuren te ontwikkelen, die waardevol inzicht in de rol van ingeboren immuniteit in de totstandbrenging van TB besmetting16konden verstrekken. Bovendien, deze eenvoudige ongewervelde infectie model heeft de potentie om een snelle, goedkope, en betrouwbare evaluatie van TB pathogenese waarin gecontroleerde uitdaging en meerdere repliceert voor reproduceerbaarheid te bieden. Bovendien, het model heeft de potentie om te worden gebruikt om nieuwe anti-TB drugs en vaccin kandidaten scherm in de vroege ontwikkeling, het verminderen van het totale aantal dieren in experimenten. Het vermogen om veranderingen in gastheer en pathogeen structuur, transcriptoom en proteome te meten om drug doelstellingen te bepalen en mechanismen van actie van nieuwe drugs en therapeutische vaccins te beoordelen, zijn ook voordelig.
Hier beschrijven we de experimentele protocollen voor de voorbereiding van een bioluminescent M. bovis BCG Lux entmateriaal en G. wasmot larven voor mycobacteriële infectie, evenals de bepaling van zowel larvale en mycobacteriële overleving in reactie op infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: alle hieronder beschreven werkzaamheden worden uitgevoerd in een CL2 laboratorium binnen een klasse 2 microbiologische veiligheidskabinet (MSC) volgens de lokale richtlijnen inzake gezondheid en veiligheid.
1. voorbereiding van M. bovis BCG Lux voor infectie
- Ontdooien bevroren 1,2 mL glycerol (15%) voorraad van M. bovis BCG Lux, de Montreal Vaccine stam getransformeerd met de shuttle plasmide pSMT1 het dragen van de luxAB genen uit Vibrio harveyi codering van de Luciferase enzym19.
- Inoculeren 15 mL Middlebrook 7H9 bouillon met 0,2% glycerol, 10% albumine, dextrose, catalase (ADC) verrijking en 50 µ g/mL hygromycin met een ontdooide 1,2 mL hoeveelheid BCG Lux, in een gelabelde 250 ml erlenmeyer kolf.
- Plaats de kolf in een verzegelde Biosafety-container en incubatie bij 37 °C in een orbitale Shaker incubator bij 220 rpm voor 72 h (of totdat de cultuur bereikt de mid-log fase van de groei).
- Controleer de groei van BCG Lux cultuur door de voorbereiding van 1:10 verdunningen van de cultuur in luminometer buizen met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4, 0,01 m fosfaatbuffer, 0,0027 m kaliumchloride en 0,137 m natriumchloride) in tweevoud. Vortex, en laad de luminometer buizen in de luminometer en meet de bioluminescentie (relatieve licht eenheid [RLU]/mL) met behulp van n-Decyl aldehyde als het substraat (1% v/v in absolute ethanol)20.
Opmerking: De verhouding van RLU/kolonie die eenheden (CFU) vormt werd eerder bepaald om 3:1 te zijn toen BCG Lux in vitro in Middlebrook 7H9 Bouillon20werd gekweekt. - Centrifugeer de cultuur bij 2.175 x g voor 10 min bij kamertemperatuur om de cellen te pelleten en de bovendrijvende in een aangewezen ontsmettingsmiddel met bekende mycobactericidal activiteit te verwerpen. Gooi alle cultuur afval met ontsmettingsmiddelen geschikt voor mycobacteriën volgens lokale richtlijnen.
- Was de Cell pellet tweemaal in PBS met 0,05% polysorbaat 80 (PBS-T) om bacteriële klonteren te voorkomen.
- Na de laatste wasbeurt, decant afval bovendrijvende, opnieuw op te schorten de mycobacteriële Cell pellet in PBS-T en Verdun de mycobacteriële schorsing om de gewenste cel dichtheid met behulp van RLU metingen.
- Bereid tien-voudige seriële verdunningen van de entmateriaal in 24-Well platen met behulp van PBS-T. Plaat uit 10 µ L op Middlebrook 7H11 agar platen (0,5% glycerol, 50 µ g/mL hygromycin, 10% oliezuur, albumine, dextrose, catalase [OADC]) in tweevoud om entmateriaal CFU tellingen te inventariseren.
2. bereiding van G. wasmot larven
- Koop laatste instar larven uit de juiste bronnen en handhaven van de larven in het donker bij 18 ° c bij aankomst en gebruik binnen 1 week na aankoop. Als alternatief kunnen larven zelf gefokt worden volgens het Protocol van Jojāo et al.21. Voor gekochte larven, gooi alle dode, verkleurde of pupating larven voorafgaand aan de opslag.
Opmerking: Pupating larven zijn morfologisch te onderscheiden van de laatste instar larven. - Identificeer en selecteer gezonde larven voor experimenten, die op eenvormige roomkleur worden gebaseerd met weinig tot geen verkleuring (melanization), grootte (2 − 3 cm in lengte), gewicht (ongeveer 250 mg), tonend een hoog niveau van beweeglijkheid, en bezittend de capaciteit aan recht zichzelf wanneer omgedraaid.
- Tel zorgvuldig de gezonde larven (minimum van 20 − 30 per groep) in een Petri schaaltje (94/15 mm) bekleed met een laag van filtreerpapier (94/15 mm) gebruikend stomp-eind pincet om verontreiniging en opslag bij kamertemperatuur in het donker tot gebruik te minimaliseren.
3. infecteren G. wasmot met BCG Lux
- Minimaliseer de rommel binnen de MSC om het risico van besmetting en naald stok letsel te verminderen.
- Bereid het injectie platform voor door een cirkelvormig filtreerpapier (94 mm) vast te binden aan een plat verhoogd oppervlak. De zachte of harde oppervlakten kunnen worden gebruikt en zijn volledig afhankelijk van gebruikersvoorkeur, b.v., pipet doosdeksels of een nylon schurende spons.
- Steriliseren van een 25 µ L microspuit (25 G) door opzuigen 3 volumes van 70% ethanol en verder spoelen met 3 volumes van steriele PBS-T.
- Aspireren 10 µ L van BCG Lux entmateriaal (voorbereid in sectie 1) of PBS-T in de gesteriliseerde 25 µ l microspuit. Gebruik een aparte spuit voor de PBS-T negatieve controle.
Opmerking: Hersuspendeer de BCG Lux entmateriaal na 10 injecties om een uniforme cel schorsing te garanderen. - Gebruik een pincet op te pikken een larve en plaats op het injectie platform.
- Op het perron, Flip de larve op zijn rug en immobiliseren door het veiligstellen van het hoofd en de staart met de pincet. Zoek de laatste links proleg aftellen van het hoofd van de larve en voorzichtig steek de punt van de naald (5 − 6 mm) op een 10 − 20 ° hoek naar het horizontale vlak.
Opmerking: Korte en smalle pincet zorgen voor een eenvoudige immobilisatie met minimale larvale stress. Besteed aandacht niet aan meer dan doordringen die de darm kan doorprikken en niet-BCG Lux specifieke melanization of dood veroorzaken. - Tel de geïnfecteerde larven in een Petri schaaltje bekleed met een laag van filtreerpapier, een enkele 90 mm Petri schaaltje is geschikt voor maximaal 30 larven.
- Bewaar de Petri schaal met de larven in een geventileerde of niet-verzegelde donkere doos in een incubator op 37 ° c met 5% CO2.
4. monitoring van het voortbestaan van G. wasmot na infectie
- Gedurende de tijd cursus, toezicht houden op het voortbestaan van de larven elke 24 h. larven worden beschouwd als dood als ze niet te bewegen in reactie op aanraking.
5. het meten van de in vivo last van BCG Lux in G. wasmot
- Op elk moment punt, willekeurig selecteren vijf geïnfecteerde larven eerder bereid in sectie 3 en zachtjes steriliseren de larvale oppervlakken met behulp van wattenstaafjes gedrenkt in 70% ethanol.
Opmerking: Deze stap is belangrijk bij het plateren van larvale homogenaat voor mycobacteriële CFU opsomming als niet-gesteriliseerde larven kan leiden tot vervuiling. - Plaats de larven individueel in 2 mL Lysing matrix buizen met 800 µ L van steriele PBS.
- Meng de larven met behulp van een homogeniseer voor 60 s op 6,0 m/s.
- Centrifugeer de Lysing buizen bij 3.500 x g voor 5 s om homogenaat van de deksels te verwijderen, en zorgvuldig Decanteer de homogenaat in steriele luminometer buizen afzonderlijk.
Opmerking: Voor CFU opsomming (stap 5,7), zorg ervoor dat 100 µ L van homogenaat te reserveren in een steriele 1,5 mL reactiebuis. - Herstel alle resterende homogenaat door de Lysing matrix tubes met 1 mL PBS-T en pipet in de overeenkomstige luminometer buizen te wassen.
- Draai de luminometer buizen en meet de Bioluminescentie van de homogenates eerder beschreven in stap 1,4.
- Bereid tien-voudige seriële verdunningen van de homogenaat in 24-Well cultuur platen met behulp van PBS-T. Plaat uit 10 µ L van de verdunning op Middlebrook 7H11 agar-platen met 0,5% glycerol, 50 µ g/mL hygromycin, 10% OADC en 20 µ g/mL piperacilline, om de RLU/CFU verhouding van BCG Lux na in vivo infectie te bepalen.
Opmerking: Piperacilline elimineert native G. wasmot microbiota met minimale groeiremming van BCG Lux16.
6. statistische analyse
- Plot de Kaplan-Meier Survival curve met behulp van gegevens verzameld en het uitvoeren van de mantel-Cox (log-Rank) test om de betekenis van het resultaat, waar * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001, en * * * * p < 0,0001 te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier presenteren we representatieve gegevens die kunnen worden verkregen met behulp van de g. wasmot -BCG Lux infectie model en markeer de voordelen van G. wasmot als een infectie model voor de leden van de MTBC (Figuur 1). In Figuur 2worden experimentele procedures met belangrijke technische punten beschreven.
Figuur 1: de voordelen van G. wasmot als een infectie model. Dit cijfer is aangepast van Kavanagh en Sheehan22. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: schets van experimentele procedures. (A) onderhoud en bereiding van G. wasmot voor infectie met M. bovis BCG Lux. Bvoorbereiding van de cultuur en ENTMATERIAAL van BCG Lux voor infectie. Cinfectie van G. wasmot met BCG Lux. Dmeting van virulentie en in vivo last van BCG Lux in G. wasmot larven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
BCG Lux dosisafhankelijke virulentie werd waargenomen in G. wasmot larven over een 96 h incubatietijd (Figuur 3), en de dodelijke dosis die nodig is voor 50% larvale sterfte (LD50) was vastbesloten om 1 x 107 CFU. De overlevings verdeling als gevolg van de virulentie van de doses BCG Lux getest was significant verschillend (p < 0,0001). Controlegroepen geïnjecteerd met een 10 µ L dosis PBS-T of die gewoon prikken simuleren naald verwondingen, heeft geen invloed op de gezondheid van larven of leiden tot een toename van de sterfte, zoals bepaald door observationele controles op de beweeglijkheid en melanization op verschillende tijdpunten.
Figuur 3: overlevings curve Kaplan-Meir van G. wasmot in reactie op verschillende entmateriaal van M. bovis BCG Lux. Gezonde larven (n ≥ 10 per groep), werden besmet met verschillende doses van BCG Lux. Larven werden uitgebroed op 37 ° c en bewaakt om te overleven elke 24 uur voor maximaal 96 h. De niet-geïnfecteerde groep werd geïnjecteerd met PBS, en een prik groep (invoeging van de naald alleen) aangetoond dat het effect van naald letsel op larvale gezondheid. De middelen van twee onafhankelijke experimenten worden getoond, met 95% betrouwbaarheidsinterval, dat als gestippelde lijnen in overeenkomstige kleur aan de entmateriaal wordt vertegenwoordigd. Dit cijfer is aangepast van Li et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Alle larven geïnfecteerd met BCG Lux weergegeven fysiologische veranderingen in de tijd en, voor de larven geïnfecteerd met een 2 x 107 CFU dosis van BCG Lux, melanization van de larvale dorsale lijn werd waargenomen vanaf 48 h post-infectie (PI), en systematische melanization werd waargenomen vanaf 96 h PI (Figuur 4). Bovendien werd de beweeglijkheid van de larven verminderd met de ernst van de melanization en het vermogen van larven om verpoppen werd verloren bij infectie in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles.
Figuur 4: Melanization van G. wasmot in reactie op infectie met M. bovis BCG Lux. Gezonde larven op 0 h werden besmet met een 2 x 107 CFU dosis BCG Lux. Op 48 h en 96 h Pi, melanization langs de larvale dorsale lijn en systematische melanization, respectievelijk, werd waargenomen.
Overleving van BCG Lux binnen de G. wasmot larven werd bepaald meer dan 2 weken door bioluminescentie meting van larvale homogenates. Infectie met een 1 x 107 CFU dosis BCG Lux resulteerde in een eerste daling van BCG Lux bioluminescentie van 0 − 72 h pi. Echter, van 72 − 144 h Pi, de Bioluminescentie van BCG Lux plateaued, met vermelding van de oprichting van aanhoudende infectie (Figuur 5).
Figuur 5: in vivo last van M. bovis BCG Lux in G. wasmot gekwantificeerd met behulp van BIOLUMINESCENTIE (relatieve licht eenheid, RLU/ml) over een twee weken durende cursus. Gezonde larven (n = 30) werden besmet met 1 x 107 CFU dosis BCG Lux. In vivo werd de last gekwantificeerd door homogeniseren vijf larven bij elk tijdpunt (0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 h), en het meten van bioluminescentie van homogenaat. De middelen van drie onafhankelijke experimenten worden getoond, en de fouten staven vertegenwoordigen de standaardafwijking van het gemiddelde. Dit cijfer is herdrukt van Li et al.16. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aangezien de snelle en reproduceerbare kwantificering van in vivo mycobacteriële groei in deze studies werd bepaald door de meting van bioluminescentie, moet de verhouding van RLU en CFU ook in vivo worden bepaald. In ons specifieke infectie systeem varieerden de in vivo ratio van RLU en CFU van 2:1-5:1, met een gemiddelde van 4:1 over de 168-h tijd cursus (Figuur 6).
Figuur 6: bepaling van de in vivo RLU/CFU verhouding van M. bovis BCG Lux in G. wasmot. Gezonde larven (n = 30) werden besmet met 1 x 107 CFU dosis BCG Lux. Bij elk tijdpunt (0, 24, 96 en 168 h), waren vier besmette/controle (PBS-T) larven gehomogeniseerd, en homogenates werden gemeten voor bioluminescentie en werden verzilverd uit op 7H11 agar om CFU tellingen op te sommen. De middelen van twee onafhankelijke experimenten worden getoond en de fouten staven vertegenwoordigen de standaardafwijking van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gebruik van G. wasmot als een infectie model is vastgesteld voor een aantal bacteriële en schimmelziekte verwekkers voor de studie van virulentie, gastheer-pathogeen interactie, en als een scherm voor nieuwe therapeutische10,22. De volgende bespreking is gebaseerd op de experimentele procedure voor het gebruik van G. wasmot als besmettings model voor MTBC.
De gezondheid van de naïeve larven voorafgaand aan experimenten kan een aanzienlijke impact hebben op de uitkomst van het experiment. Daarom is het van vitaal belang dat eventuele verkleurde en/of gewonde larven worden verwijderd bij aankomst en worden niet gebruikt voor een experiment. Als een groot aantal larven zijn dood aangetroffen in dezelfde container bij aankomst, is het raadzaam om de partij te ontdoen als reeds bestaande infecties kan de oorzaak van de dood. Indien mogelijk experimenten uit te voeren met behulp van de larven als dicht bij de dag van aankoop/aankomst. Voor gebruik Zorg ervoor dat de larven op te slaan bij 18 ° c om verpoppen te voorkomen en om het aantal larven beschikbaar voor experimenten te maximaliseren. Gezonde larven kunnen worden gebruikt voor maximaal 7 dagen na levering/aankoop. Na infectie, ervoor te zorgen dat alle dode larven te verwijderen uit de Petri schaal als, om redenen die nog onbekend is, de aanwezigheid van dode larven lijkt te verhogen het sterftecijfer in de steekproef populatie. Voor gebruikers van zelf gefokte larven, is het belangrijk om bewust te zijn van biologische variabiliteit in vergelijking met gekochte larven, als variantie in dieet en groeiomstandigheden kan een impact hebben op de larvale immuniteit21,23. Inter-experimentele veranderlijkheid kan worden beperkt door het houden van de bron, indien gekocht, of de feed en groei voorwaarden van de gefokte larven consistent tussen experimenten. Bij alle experimenten zijn de opneming van ' blanco ' en ' prikken ' negatieve controles essentieel; de blanco-controle is een indicator van de verontreiniging of toxiciteit van de suspension matrix (PBS-T of media Bouillon), en de Gestekelde controle bootst het effect van de naald letsel op larvale gezondheid. Bovendien normaliseren deze controles elke biologische variatie tussen partijen larven, waardoor reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid tussen experimenten.
Voor injectie van g. wasmot larven, het gebruik van een 25 G naald wordt aanbevolen als grotere meter naalden kan leiden tot overmatig bloeden en scherper kleinere gauge naalden kan gemakkelijk punctie de darm van de larven, wat leidt tot larvale sterfte en vals-positieve Resultaten. Conventionele methodes van naald injectie typisch immobiliseren de larven door hand, die het risico van naald verwonding verhoogt. Door het gebruik van een pincet om de larven te immobiliseren, het risico van naald stok letsel is aanzienlijk verminderd als de hand niet in de nabijheid van de naald op elk punt tijdens de infectie. Alternatief, kunnen de larven door te koelen worden gemobiliseerd. Echter, koude Shock bij 12 ° c voor 15 min voorafgaand aan de infectie is gedocumenteerd om de aangeboren immuunrespons op infectie te verbeteren. Daarom moet de analyse van de resultaten verkregen via koeling zorgvuldig te overwegen de impact ervan24. Met behulp van onze techniek, middelmatige doorvoer van injectie (2 − 3 larven per minuut) kan worden bereikt met de praktijk van de gebruiker; Dit is vergelijkbaar met de snelheid van de conventionele injectie van onze ervaring (3 − 4 larven per min). Bovendien kan onze methode worden aangepast voor een hogere doorvoersnelheid injectie door gebruik te maken van een pedaal bediend injectie platform bestaat uit een infuuspomp met een wegwerpspuit aangesloten op een 25 G vlinder bril.
De voorbereiding van BCG Lux entmateriaal is gebaseerd op de snelle schatting van CFU gebruikend RLU van mycobacteriële cultuur20. In onze ervaring met Bouillon cultuur, de verhouding van RLU tot CFU is 3:120, in contrast met BCG Lux groeit in G. WASMOT waar de RLU naar CFU ratio is 5:120. Mycobacteriële cel aggregatie of ' klonteren ' vaak gezien in dichte culturen kan een impact hebben op de RLU metingen, zoals klonteren kan resulteren in onbetrouwbare bioluminescentie metingen. Als dusdanig, wordt het gebruik van samenklonken mycobacteriële cultuur voor entmateriaal voorbereiding niet geadviseerd. Echter, de toevoeging van polysorbaat 80 aan de groeimedia minimaliseert cel klonteren zonder wijziging van de groei van BCG Lux. 16 elke kleine cel klonteren kan worden opgelost door het wassen van de cultuur met PBS-T en is van vitaal belang voor de voorbereiding van een nauwkeurige entmateriaal met behulp van RLU als de uitlezing. Bovendien is de PBS-T Wash is van vitaal belang voor het verwijderen van alle extracellulaire virulentie factor afgescheiden tijdens de groei. Mycobacteriële stam en passage nummer moet ook in aanmerking worden genomen, omdat dit kan de ernst van de mycobacteriële aggregatie effect25. In alle gevallen moet de entmateriaal worden opgesomd door CFU op 7H11 agar platen om ervoor te zorgen dat de juiste CFU werd voorbereid door bioluminescentie meting. Bovendien, de RLU/CFU ratio in vivo moet worden bepaald met de nieuwe bioluminescent reporter of voorraden, als de ratio zal waarschijnlijk variëren.
G. wasmot heeft verschillende voordelen ten opzichte van conventionele modellen van TB-infectie, met inbegrip van goedkopere acquisitie-en onderhoudskosten, gemak van infectie en onderzoek throughput, vooral in combinatie met bioluminescent stammen16. Het gebrek aan ethische beperkingen zorgt voor een grotere steekproefomvang (minimum van 20 − 30 larven per groep) in vergelijking met zoogdier modellen, waardoor meer vertrouwen en betrouwbaarheid in de behaalde resultaten26,27. Echter, er zijn een aantal beperkingen in het gebruik van G. wasmot als een infectie model. Als een ongewervelde, ze natuurlijk gebrek aan adaptieve immuniteit waardoor ze ongeschikt voor antigenicity of immunologische studies10. Cellulaire ingeboren immuunrespons van G. wasmot bestaan uit een aantal hemocyte soorten, en plasmatocytes en granulocyten zijn gemeld om te functioneren op dezelfde wijze als zoogdier fagocyten (neutrofielen en macrofagen)12. Nochtans, blijven de rol en de mechanismen van deze cel types onder gekenmerkt, en de directe vergelijkende studies tussen zoogdier en insect fagocyten moeten nog worden uitgevoerd. Voorts belemmert het ontbreken van een geannoteerd G. wasmot genoom de analyse van de gastheer reactie op besmetting, en dit is momenteel afhankelijk van de analyse van de ontologie van het gen tegen transcriptomics bibliotheken van andere ongewervelden, zoals fruitvliegje melanogaster en Bombyx Mori28.
Als een TB-infectie model, G. wasmot houdt een veelbelovende toekomst met haar vermogen om granuloom-achtige structuren te ontwikkelen in reactie op BCG Lux infectie16, die van vitaal belang zijn pathofysiologische kenmerken van TB-infectie en zijn een belangrijke functie in de ontwikkeling van LTBI. Toekomstig werk zal ernaar streven dit model te karakteriseren met een bijzondere interesse in de vorming van granuloom structuren met behulp van referentie-, klinische en Mutante MTB -isolaten onder CL3 omstandigheden. Daarnaast, we verwachten dat het ook nuttig kan zijn voor nieuwe anti-mycobacteriële agent screening, als een soortgelijke G. wasmot model werd gebruikt voor NTMs18, maar dit moet nog worden bepaald. De aanneming van dit model heeft de mogelijkheid om een significante vermindering van het aantal dieren die worden gebruikt binnen de TB onderzoekgemeenschap, terwijl gelijktijdig versnellen in vivo TB onderzoek output onder ethisch meer aanvaardbare voorwaarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door subsidies van de biotechnologie en biologisch wetenschappelijk Onderzoekraad (BBSRC), toegekend aan PRL en YL (BB/P001262/1), en het nationaal centrum voor de vervanging, verfijning en vermindering van dieren in onderzoek (NC3Rs) toegekend aan PRL, SMN, BDR, en YL (NC/R001596/1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1,000 µL pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 mL pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 mL) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0 mL) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µL, 25 G) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15 mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94 mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. , Geneva. (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), TBTB2-004-2015 (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research - where is the beef? Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella - a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), e02539-17 (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), e3332-e3332 (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis - BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
