Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Gebruik van de ongewervelde Galleria wasmot als een infectie model voor de studie van de Mycobacterium tuberculose complex
Summary June 30th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Galleria wasmot werd onlangs opgericht als een reproduceerbaar, goedkoop, en ethisch aanvaardbare infectie model voor de Mycobacterium tuberculose complex. Hier beschrijven en demonstreren we de stappen die genomen zijn om succesvolle infectie van G. wasmot met bioluminescent Mycobacterium bovis BCG Lux vast te stellen .
Transcript
Dit protocol beschrijft het gebruik van Galleria mellonella als een alternatief infectiemodel om tuberculose te bestuderen, waardoor het aantal modellen van zoogdieren dat in onderzoek wordt gebruikt, wordt verminderd. In vergelijking met conventionele zoogdiermodellen zoals muizen, is Galleria mellonella een goedkoper, ethisch aanvaardbaar en toegankelijker model om tuberculose te bestuderen. Verdere optimalisatie van dit model zal het mogelijk maken om kandidaat-antimycobacteriële geneesmiddelen te screenen en toxiciteit te gebruiken en zal bijdragen aan de ontwikkeling van dringend noodzakelijke nieuwe therapieën voor tuberculose.
Galleria mellonella bezit een complex aangeboren immuunsysteem vergelijkbaar met dat van zoogdieren. De studie van gastheer-pathogene interactie kan verder onthullen de rol van aangeboren immuniteit in tuberculose. Het gebruik van Galleria mellonella als infectiemodel is niet beperkt tot tuberculose en is de afgelopen tien jaar veel gebruikt voor andere bacteriële en schimmelpathogenen.
Om te beginnen ontdooien een bevroren 1,2-milliliter glycerol voorraad Van Mycobacterium bovis BCG lux, de Montreal vaccin stam getransformeerd met de shuttle plasmid pSMT1 die de luxAB genen. In een gelabelde 250-milliliter Erlenmeyer-kolf inent 15 milliliter Middlebrook 7H9-bouillon met een ontdooide 1,2 milliliter aliquot van BCG lux. Plaats de kolf in een verzegelde bioveiligheidscontainer en broed op 37 graden Celsius in een orbitale shaker incubator bij 220 rpm gedurende 72 uur.
Bereid na incubatie 1:10 verdunningen van de cultuur in fosfaatgebufferde zoutoplossing in luminometerbuizen, vortex, en laad de luminometerbuizen in de luminometer. Laad het substraat 1%n-decyl aldehyde in absolute ethanol in het injectorplatform en meet de bioluminescentie. Zet de bioluminescentie om in kolonievormende eenheden om de groei van bcg lux cultuur te controleren.
Breng de cultuur over op een centrifugebuis en centrifuge op 2, 175 keer g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren. Gooi het supernatant in een geschikt ontsmettingsmiddel met bekende mycobactericideactiviteit. Was de cel pellet twee keer in 50 milliliter PBS-T door centrifugeren op 2, 175 keer g gedurende 10 minuten om bacteriële klonteren te voorkomen.
Na de laatste wasbeurt decanteert u het afval supernatant en wordt de mycobacteriële celpellet opnieuw opgetrokken in het vereiste volume van PBS-T om de mycobacteriële suspensie te verdunnen tot de gewenste celdichtheid. Bereid vervolgens 10-voudige seriële verdunningen van het entmateriaal in 24-well platen met pbs-t. Plaat 10 microliter van elke verdunning op Middlebrook 7H11 agar platen in dubbele opsomt enumereren inoculum CFU telt.
Houd de gekochte instar larven in het donker op 18 graden Celsius bij aankomst en gebruik binnen een week na aankoop. Identificeer en selecteer gezonde larven voor experimenten op basis van uniforme crèmekleur, geschikte grootte en gewicht, hoge beweeglijkheid en het bezit van de mogelijkheid om zichzelf te rechtzetten wanneer ze omdraaien. Met behulp van stompe pincet, zorgvuldig tellen de gezonde larven in een petrischaal bekleed met een laag filterpapier en op te slaan bij kamertemperatuur in het donker tot gebruik.
Bereid het injectieplatform voor door een cirkelvormig filterpapier met een diameter van 94 millimeter op een plat, verhoogd oppervlak te tappen. Spoel drie volumes van 70% ethanol in een 25-microliter microsyringe om te steriliseren, te verwijderen en verder te spoelen met drie volumes steriele PBS-T. Vervolgens resuspend de bereide BCG lux en aspirate 10 microliter in de gesteriliseerde microsyringe.
Gebruik een aparte spuit om PBS-T aan te lokken voor een negatieve controle. Na 10 injecties, resuspend de BCG lux entmateriaal om een uniforme cel suspensie te garanderen. Gebruik een pincet om één larve op te halen en plaats op het injectieplatform.
Op het platform, flip de larve op zijn rug en immobiliseren door het vastzetten van de kop en staart met de pincet. Zoek het laatste linkerproleg, tel af van het hoofd van de larve en steek voorzichtig de punt van de naald vijf tot zes millimeter diep in een hoek van 10 tot 20 graden naar het horizontale vlak. Injecteer het entmateriaal uit de spuit.
Na elke infectie, breng de geïnfecteerde larve in een petrischaal bekleed met een laag filterpapier. Een enkele petrischaal van 94 millimeter is geschikt voor maximaal 30 larven. Bewaar de petrischaal in een geventileerde, donkere doos in een couveuse op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide.
Monitor de overleving van de larven elke 24 uur. Larven worden als dood beschouwd wanneer ze niet bewegen in reactie op aanraking. Nota van de overleving en beoordeel statistische significantie met de Mantel-Cox test.
Selecteer elke 24 uur willekeurig vijf geïnfecteerde larven en gebruik een wattenstaafje gedrenkt in 70%-ethanol om de larveoppervlakken voorzichtig te steriliseren. Plaats de larven individueel in twee-milliliter lysing matrix buizen met 800 microliter van steriele PBS. Gebruik vervolgens een homogenisator om de larven gedurende 60 seconden te homogeniseren op zes meter per seconde.
Centrifugeer de lysingbuizen op 3, 500 keer g gedurende vijf seconden om het homogenaat uit de deksels te verwijderen en het homogenaat voorzichtig te decanteren in vijf steriele luminometerbuizen afzonderlijk. Reserveer 100 microliter homogenaat in een steriele reactiebuis van 1,5 milliliter. Herstel het resterende homogenaat terug door de lysing matrixbuizen met één milliliter PBS-T en pipet in de bijbehorende luminometerbuizen te wassen.
Vortex de luminometerbuizen en meet de bioluminescentie van de homogenaten op een luminometer. Bereid vervolgens 10-voudige seriële verdunningen van de gereserveerde 100 microliter homogenaat in 24-put kweekplaten met PBS-T. Pipette 10 microliter van de verdunning op elke Middlebrook 7H11 agar plaat en gebruik een steriele plaatspreader te verspreiden.
Incubeer op 37 graden Celsius voor twee weken. Tel daarna kolonievormende eenheden. Bepaal de RLU to CFU ratio van BCG lux na in vivo infectie.
In dit experiment werd BCG lux dosisafhankelijke virulentie waargenomen bij G.mellonella larven gedurende een incubatieperiode van 96 uur. De dodelijke dosis die nodig was voor 50%larve mortaliteit werd vastgesteld op een keer 10 aan de kracht van zeven CFU. Controlegroepen geïnjecteerd met een 10-microliter dosis PBS-T of die gewoon geprikt simuleren naaldverwondingen niet van invloed larve gezondheid of leiden tot een toename van de mortaliteit.
Voor larven die besmet waren met de twee keer 10 tot de kracht van zeven CFU-dosis BCG lux, werd melanisatie van de larve dorsale lijn waargenomen vanaf 48 uur na infectie en systemische melanisatie werd waargenomen vanaf 96 uur na infectie. Infectie met een een keer 10 tot de kracht van zeven CFU dosis BCG lux resulteerde in een eerste daling van de bioluminescentie binnen de eerste 72 uur na infectie. Echter, na 72 uur na infectie, de bioluminescentie van BCG lux begon te plateau, wat wijst op de oprichting van aanhoudende infectie.
In dit specifieke infectiesysteem varieerde de in vivo ratio van RLU en CFU van 2:1 tot 5:1 met een gemiddelde van 4:1 over de 168-uurstijdcursus. Tijdens de injectie, vergeet niet om de larven te beveiligen, zodat het risico van overpenetratie wordt geminimaliseerd. Accidentele punctie van de darm kan leiden tot een verhoogde sterfte.
Door histopathologische analyse uit te voeren, kan de introductie van mycobacteriën met de gastheercellen worden gevisualiseerd. Verdere transcriptomische analyse zou de interactie op genomisch niveau kunnen onthullen. Het gebruik van dit infectiemodel kan het mogelijk maken om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen in een vroeg stadium van de ontwikkeling snel te testen, waardoor het aantal dieren dat bij drugsscreening wordt gebruikt, aanzienlijk wordt verminderd.
Dit infectiemodel vereist het gebruik van een spuit, die kan worden geassocieerd met naald-stok letsel. Wij raden het gebruik van onze injectietechniek aan om dit risico te minimaliseren.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
