这种使用dsDNA间染的实时RT-PCR适用于诊断裂解病毒感染。该方法从从狂犬病疑似前身或死后样本中提取的RNA开始,详细说明主混合物制备、RNA添加、实时机器的设置以及结果的正确解释。
分子测定是快速、敏感和特异性的,已成为诊断狂犬病的核心。几十年来,基于PCR的检测一直被用来确认狂犬病诊断,但直到最近才被世界动物卫生组织(OIE)接受,作为检测狂犬病感染的主要方法。实时 RT-PCR 检测提供实时数据,是闭管系统,可最大限度降低设置过程中的污染风险。脱氧核糖核酸(DNA)交相氟铬实时RT-PCR检测不需要昂贵的探针,将每个样品的成本降至最低,当引物设计在保存区域时,该检测是跨病毒属的特异性检测,而不是仅针对一种病毒。物种是可能的。在这里,我们描述了泛莱沙病毒SYBR实时RT-PCR检测,检测莱莎病毒属的莱沙病毒,包括最发散的病毒IKOV,WCBV和LLEBV。结合解结曲线分析,该测定是敏感和具体的,具有检测所有莱沙病毒物种的优点。该检测已在许多具有质量保证环境的诊断实验室中采用,能够对动物和人类狂犬病病例进行可靠、快速、灵敏的诊断。
2018年,世界动物和动物事务厅接受了使用分子方法诊断狂犬病,认识到这些技术在确认狂犬病病例方面的优势,特别是在样本不理想的情况下,或用于验尸诊断,因为不需要活病毒或新鲜样本。由于基因组为RNA,在PCR开始之前,对莱沙病毒的PCR检测需要逆转录(RT)。RT-PCR检测基因组的3’近区域被认为是最敏感的,因为转录梯度发生在莱西病毒复制期间。常用的RT-PCR测定可以大致分为两类:端点(或凝胶基)和实时。两种方法都是敏感和具体的;然而,实时测定还有一些额外的好处,如在”实时”中获得结果,并在全封闭管系统中执行,从而减少操作员污染的可能性。有两种主要方法检测使用实时测定获得的莱沙病毒特异性放大组。第一种利用含荧光和环流的水解探针(如TaqMan探头)。当探针在放大过程中与目标区域结合时,聚合酶的外糖酶活性会导致荧光和淬火的解结,从而能够测量产生的荧光。第二种利用DNA间质染料(氟色素如SYBR绿色),在扩增过程中与双绞合DNA结合。结合的荧铬会发出在每个周期中检测到的荧光,从而能够实时检测和定量产品。由于与任何dsDNA结合的非特定性质,进行解结曲线分析以确认反应的特异性。实时RT-PCR由于放大剂尺寸小,长度通常小于200 bp,因此速度很快;然而,在保存区域中确定设计引物和探头的适当区域可能具有挑战性,因此取消探头要求是一个明显的优势。
一些实时RT-PCR被设计专门检测RABV2的单个菌株或谱系,并检测第3、4、5、6属的赖沙病毒。 7,8,9.所有检测都有检测限制,这取决于引物(如有必要,探针)序列在整个属中保存程度。事实上,新兴或新型病毒株可能使高度特异性的基于探针的检测无效。实时检测(染料与探头)的选择将取决于预期应用。对于对本地来源的大脑材料进行监测并期望大量阴性样本的实验室来说,使用更便宜的间质染料是一个明智的选择。SYBR Green 方法在进行扫描监测时也是最佳方法,因为基于更有限的基于探头的检测不会检测到新型或发散性莱沙病毒的存在。
Lyssa病毒属的所有成员都引起狂犬病,一旦出现症状,狂犬病就致命。绝大多数人畜狂犬病病例都是狂犬病病毒(RABV)引起的,狂犬病的主要宿主是家犬10。蝙蝠是溶于溶类病毒的重要宿主宿主,除了两种利沙病毒外,所有病毒种类都直接在蝙蝠中被识别——伊科马利萨病毒(IKOV)和莫科拉病毒(MOKV)——在这两种中,IKOV被推测有一个蝙蝠宿主宿主水库11.除了16种公认的莱沙病毒12外,最近还有两种莱沙病毒被描述:台湾蝙蝠莱沙病毒(TWBLV)13和科塔拉赫蒂蝙蝠利沙病毒(KBLV)14。裂氧病毒在基因上可以分为三个植物群,大多数裂源病毒,包括RABV,属于植物群I。然而,最发散的赖萨病毒属于植物群III,并且不太可能被设计为RABV或Phylogroup I病毒序列的RT-PCR检测到。
此处描述的测定利用了实时引物对 JW12-N165,在 2005年首次描述 3 。引引被设计成泛莱沙病毒,尽管最初的应用是作为TaqMan检测与探针来区分莱沙病毒物种。随后确认引物对是泛莱沙病毒的特异性是通过2步SYBR实时测定所有可用的莱沙病毒物种,包括WCBV15。引物对在这里描述在一步RT-PCR实时测定使用中钙化氟铬,验证使用代表从所有16个公认的裂解病毒物种。这种一步式实时测定是一种快速、灵敏、感染病毒特异性测定,并表明引物集的鲁棒性能够识别甚至高度不同的流毒病毒物种。
描述的泛莱沙病毒实时RT-PCR测定是一种闭管、一步检测,可检测所有三个植物群的莱沙病毒。该检测已验证为动物和人类狂犬病诊断,包括死后脑组织(最佳脑干),以及前验尸样本,如皮肤活检、连续收集的唾液或脑脊髓液 (CSF)。该测定中使用的引引剂首先用于基于探针的测定,以区分RABV、EBLV-1和EBLV-2 3,这些引源已在许多OIE狂犬病实验室中使用,并在EURL熟练度方案中持续进行。随后,使用两步实时测定15,证实了这些引物的”泛利沙病毒”性质。此处描述的测定利用引材在一步式 SYBR 测定中进一步优化 RT-PCR,从而实现闭管快速系统。此外,在狂犬病流行国家使用这种检测的培训已证实适合在任何实验室实施,具有基本的PPE和质量系统,以减少交叉污染和微量样本,设施储存试剂和实时带 SYBR 检测的机器。测定非常可靠,与FAT有100%的相关性,对分解样品3的灵敏度提高。与基于探针的测定相比,基于DNA的间印染料测定的主要优点之一是相对成本。另一个好处是,测定只使用两个引基,因此由于序列发散,检测失败的风险较小,这在以前发布的基于探针的检测中一直是一个弱点。事实上,所有裂解病毒物种(除了TWBLV和KBLV)的代表都使用这种测定检测,并且对TWBLV和KBLV在引种位进行序列分析后发现,没有显著差异,强烈表明它们也将被检测使用此方法。在所分析的病毒中观察到的检测极限范围,可视为由两个主要因素造成的。首先,RNA是从临床脑材料中分离出来的,因此每个未稀释样品中的基因组拷贝量不能直接比较。RNA通过将总RNA调整到1μg/μL而”正常化”;然而,病毒基因组RNA在样本中的比例会有所不同。第二是莱沙病毒序列的多样性,尽管引物位位于保存区域,但仍然存在变化位置。因此,大多数对测定灵敏度较低的莱沙病毒是植物群II和III病毒也就不足为奇了。解结曲线分析代表一个基本参数,将由于引精华二聚器的形成或宿主基因组中非特定区域的扩增而可能产生的假阳性结果降至最低。在现实中,这是罕见的发生,解结曲线分析相当于运行一个胶合,以可视化正确大小的常规RT-PCR放大剂。根据在我们的实验室收集的数据,提供了可接受的 Tm值范围(77-80 °C)。强烈建议各实验室整理内部数据,以确保范围可转让并作相应修改。解释放大和解离图的结果,以及正负对照和β-actin结果,可实现稳健且可重复的诊断结果。
在该协议的范围之外是用于获得高质量RNA的RNA提取方法。本协议中分析的所有RNA均使用TRIzol制备;然而,有许多合适的基于钠的提取RNA提取方案,包括柱基和基于珠的提取试剂盒。处理莱沙病毒阳性(或疑似阳性)样品必须在国家批准的许可生物控制设施内处理。然而,提取的总RNA是非传染性的,因此在低密封实验室中处理。根据所使用的提取方法,需要评估定量和稀释RNA的要求。对于基于苯酚的萃取物,包括TRIzol,此步骤是必需的,并防止抑制检测物污染gDNA;然而,基于柱和珠的萃取(尤其是那些DNA耗尽阶段)在测试前不需要稀释。
在整个协议中,必须小心谨慎,防止交叉污染,并将样品准确添加到正确的油井中。带有试剂计算和板布局的电子表格可作为补充文件下载。良好的实验室实践,包括清洁工作表面、定期更换手套、使用屏障提示和不同的房间/紫外线柜来分离每个阶段,将污染的可能性降至最低。为了确保测试使用预期参数执行,必须包括正负控制,并且所有测试样本以重复(或三元)形式运行。
包含控制是任何 PCR 的基本功能,尤其是对于诊断。阳性控制RNA是从CVS(挑战病毒标准)感染的小鼠大脑分批制备的,并经过验证和校准,以确保批次之间的一致性。对照RNA被量化并稀释至1μg/μL.RNA,在串行稀释中获得阳性结果,至少达到10-4(等于100 pg/μL)被认为是适合目的的。正对照RNA在-80°C以10-1等分储存。必要时,将等分稀释1:100,以1纳克/μL提供工作库存,并在-80°C下储存在5μL一次性等量中。稀释的阳性控制RNA用于表示低水平阳性样品,并确保检测出检测出任何灵敏度降低。为每个控件保留一张”控制卡”,以监控 Ct值并识别趋势(表 5)。表 5显示了 CVS 正对照样本 Ct和 Tm值在多日内和运算符的良好运行间可比性,从而保证测定是可靠且可重现的。应调查偏离这些测量的结果,并在必要时重复测试样品。分子级水作为NTC包含在每次运行中,以确认试剂没有赖沙病毒RNA的污染,并确认阴性样本。此外,为了确保RNA提取的有效性,在单独的管中与测试样品一起测试β-actin。莱沙病毒阳性控制RNA也用于β-actin阳性控制。其他内源性基因或异源性内部控制系统也可用于利用。使用这些控件可确保在与测试样本相同的条件下分析所有步骤。有时,如果样品严重降解或没有足够的宿主RNA(如唾液或CSF),内源基因PCR可能会失败。在这种情况下,当莱沙病毒实时RT-PCR结果为阳性时,确认独立RNA提取 – 在原始测试或二次测试(分子,如常规RT-PCR)上排除RNA提取过程中的污染,或 FAT。在分析诊断样本时使用表 4可确保正确的解释。
无论用于确认狂犬病感染的分子测定,后续调查使用Sanger测序来确定莱沙病毒物种和经典技术在病毒学,如FAT或病毒分离也应进行允许进一步病毒特征化,并支持将阳性病例通知世界世界和免疫卫生组织。
The authors have nothing to disclose.
作者们感谢艾玛·怀斯小姐和梅根·戈尔丁小姐协助完成实验。该协议的制定得到了英国环境、食品和农村事务部(Defra)、苏格兰政府和威尔士政府的资助,赠款[SV3500和SE0431]以及欧洲病毒档案馆全球(EVAg)项目根据第653316号赠款协议,从欧洲联盟的Horizon 2020研究和创新方案获得资金。
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |