Denne real-time RT-PCR ved hjælp af dsDNA interkalerende farvestof er egnet til at diagnosticere lyssavirus infektioner. Metoden begynder med RNA ekstraheret fra rabies mistanke ante-mortem eller post mortem prøver, detaljer Master Mix forberedelse, RNA tilføjelse, opsætning af realtid maskine og korrekt fortolkning af resultater.
Molekylære assays er hurtige, følsomme og specifikke, og er blevet centrale for diagnosticering af rabies. PCR-baserede assays er blevet udnyttet i årtier til at bekræfte rabies diagnosticering, men er først for nylig blevet accepteret af OIE (Verdensorganisationen for Dyresundhed) som en primær metode til påvisning af rabies infektion. Real-time RT-PCR assays leverer realtidsdata og er lukkede rørsystemer, hvilket minimerer risikoen for kontaminering under opsætningen. DNA interkalating vha real-time RT-PCR assays kræver ikke dyre sonder, minimering af omkostningerne pr prøve, og når primere er designet i bevaret regioner, analyser, der er specifikke på tværs af virus slænger snarere end specifikke for blot én virus arter er mulige. Her beskriver vi en pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay, der registrerer Lyssavira på tværs af lyssavirus slægten, herunder de mest divergerende vira ikov, WCBV og llebv. I forbindelse med analysen af dissociations kurven er denne analyse følsom og specifik med den fordel at detektere alle lyssavirus arter. Analysen er blevet vedtaget i mange diagnostiske laboratorier med kvalitetssikrede miljøer, muliggør robust, hurtig, følsom diagnose af dyr og menneskelige rabiestilfælde.
Diagnosticering af rabies ved hjælp af molekylære metoder blev godkendt af OIE i 20181, idet det anerkendte fordelene ved disse teknikker i forbindelse med bekræftelse af rabiestilfælde, især i situationer, hvor prøverne er suboptimale, eller til ante-mortem-diagnosticering da der ikke er noget krav om levende virus eller friske prøver. PCR-assays for Lyssavira kræver en omvendt transkription (RT), før PCR kan påbegyndes, da genomet er RNA. RT-PCR assays, der detekterer 3 ‘ proksimale region af genomet betragtes som den mest følsomme, som transkriptionelle gradienter forekomme under lyssavirus replikation. Almindeligt anvendte RT-PCR assays kan opdeles bredt i to kategorier, end-point (eller gel-baserede) og realtid. Begge tilgange er følsomme og specifikke; realtids analysen har imidlertid nogle ekstra fordele, såsom opnåelse af resultater i realtid og udføres i et helt lukket rørsystem, hvorved potentialet for operatør kontaminering mindskes. Der er to vigtigste tilgange til at opdage lyssavirus-specifikke amplikoner opnået ved hjælp af real-time assays. Den første bruger hydrolyse sonder (såsom taqman sonder), som indeholder en fluoroforet og en QUENCHER. Når sonden binder sig til målområdet under amplificeringen, resulterer polymerasens exonucleaseaktivitet i dissociation af fluoroforet og QUENCHER, hvilket gør det muligt at måle den resulterende fluorescens. Den anden bruger et DNA-interkalerende farvestof (fluorchrom som SYBR Green), der binder sig til dobbeltstrenget DNA under forstærkning. De bundne fluorchromes udsender fluorescens, som detekteres ved hver cyklus, hvilket gør det muligt at registrere og kvantificere produktet i realtid. På grund af den ikke-specifikke karakter af binding til nogen dsDNA, foretages en dissociation kurve analyse for at bekræfte specificiteten af reaktionen. Real-time rt-pcrs er hurtige på grund af de små amplikonen størrelser, typisk mindre end 200 BP i længden; men at identificere egnede regioner til at designe primere og sonder i bevaret regioner, kan vise sig udfordrende, derfor fjerne kravet om en sonde er en klar fordel.
En række realtids-rt-pcrs er designet til specifikt at afsløre individuelle stammer eller nedstamningens af rabv2 og også til at detektere Lyssavira på tværs af slægten3,4,5,6, 7,8,9. Alle assays vil have en detektionsgrænse afhængig af hvordan bevaret primer (og om nødvendigt sonde) sekvenser er på tværs af slægten. Faktisk kan nye eller nye virusstammer gøre de meget specifikke sonde-baserede assays ineffektive. Valget af realtids detektering (Dye vs. Probe) vil afhænge af den tilsigtede anvendelse. For et laboratorium, der fører tilsyn med lokalt fremskaffede hjerne materialer og forventer et stort antal negative prøver, er brugen af det billigere interkalerende farvestof et fornuftigt valg. Den SYBR grønne tilgang ville også være optimal, når der udføres scanning overvågning, hvor tilstedeværelsen af nye eller divergerende Lyssavira ville forblive uopdaget af mere begrænsede sonde-baserede assays.
Alle medlemmer af slægten lyssavirus forårsager sygdommen rabies, som er dødelig, når symptomerne vises. Langt de fleste mennesker og dyr rabiestilfælde skyldes rabiesvirus (RABV), den dominerende reservoir, som er den indenlandske hund10. Flagermus er vigtige vært reservoirer for Lyssavira og alle, men to lyssavirus arter karakteriseret er blevet identificeret direkte i flagermus — Ikoma lyssavirus (IKOV) og Mokola virus (MOKV) — og af disse to, IKOV er blevet spekuleret til at have en bat vært reservoir 11. ud over de 16 anerkendte lyssavirus arter12, der er to Lyssavira, der for nylig er blevet beskrevet: Taiwan bat lyssavirus (twblv)13 og kotalahti bat lyssavirus (kblv)14. Lyssavira kan være genetisk opdelt i tre phylogroups, med de fleste Lyssavira, herunder RABV, tilhører phylogroup I. Men, de mest divergerende Lyssavira tilhører phylogroup III og er usandsynligt, at blive opdaget af RT-PCRs designet til at målrette RABV eller phylogroup I virus sekvenser.
Analysen beskrevet her udnytter real-time primer pair JW12-N165, først beskrevet i 20053. Primere var designet til at være pan-lyssavirus, omend den oprindelige ansøgning var som en TaqMan assay med sonder til at differentiere lyssavirus arter. Efterfølgende bekræftelse af, at primer pair var pan-lyssavirus i specificitet blev opnået ved hjælp af en 2-trins SYBR real-time assay på alle lyssavirus arter til rådighed, herunder WCBV15. Primer pair er beskrevet her i en en-trins RT-PCR real-time assay udnytte en grafit fluorochrome, valideret ved hjælp af repræsentanter fra alle 16 anerkendte lyssavirus arter. Denne et-trins real-time assay er en hurtig, følsom, lyssavirus-specifik analyse og viser, at robustheden af primer sæt til at identificere selv meget divergerende lyssavirus arter.
Pan-lyssavirus realtid RT-PCR assay beskrevet er en lukket-tube, One-Step assay, der registrerer Lyssavira på tværs af alle tre phylogroups. Analysen er blevet valideret for både dyre-og human rabies diagnose, herunder post mortem-hjernevæv (optimalt hjernestammen), og ante-mortem-prøver såsom hudbiopsi, serielt indsamlede spyt eller cerebral spinalvæske (CSF). Primere anvendt i denne analyse blev først designet og udnyttet til en sonde-baseret analyse til at skelne mellem RABV, EBLV-1 og EBLV-23, som er blevet anvendt i mange OIE rabies laboratorier og udfører konsekvent i eurl præstationsordninger. Efterfølgende er “Pan-lyssavirus”-karakteren af disse primere blevet bekræftet ved hjælp af en 2-trins real-time assay15. Den analyse, der er beskrevet her, har udnyttet primere til yderligere at optimere RT-PCR i en et-trins SYBR-analyse, der muliggør et lukket rør, hurtigt system. Desuden har uddannelse i rabies-endemiske lande, der anvender denne analyse, bekræftet egnethed til at gennemføre i ethvert laboratorium med grundlæggende PV-og kvalitetssystemer for at reducere krydskontaminering og spor prøver, faciliteter til opbevaring af reagenserne og en realtids maskine med SYBR detektion. Analysen er ekstremt robust og har 100% korrelation med fedt, med forbedret følsomhed for nedbrudte prøver3. En af de vigtigste fordele for en DNA-interkalerende farvestofbaseret assay i forhold til en sonde baseret analyse er de relative omkostninger. En yderligere fordel er, at analysen kun udnytter to primere, derfor er der mindre risiko for mislykket detektion på grund af sekvens divergens, som har været en svaghed i tidligere offentliggjorte sonde-baserede assays. Faktisk er repræsentanter for alle lyssavirus arter (bortset fra TWBLV og KBLV) detekteret ved hjælp af denne analyse, og Sekvensanalyse af TWBLV og KBLV på tværs af primer sites afslører ingen signifikant divergens tyder på, at de også vil blive opdaget ved hjælp af denne metode. Rækken af detektionsgrænse observeret på tværs af de analyserede vira, kan anses for at være på grund af to hovedfaktorer. Den første er, at RNA blev isoleret fra klinisk hjernemateriale, derfor er mængden af genom kopier i hver ufortyndet prøve ikke direkte sammenlignelig. RNA blev ‘ normaliseret ‘ ved at justere det totale RNA til 1 μg/μL; andelen af virusgenom RNA i prøven vil dog variere. Den anden er mangfoldigheden af lyssavirus sekvenser, på trods af primer sites er placeret i bevaret regioner, der forbliver positioner af variation. Derfor er det ikke overraskende, at størstedelen af Lyssavira med lavere følsomhed for analysen er phylogroup II og III vira. Analysen af dissociations kurven er en væsentlig parameter, der minimerer et falsk positivt resultat, som ellers kunne opstå på grund af dannelsen af primer-dimere eller forstærkning af en ikke-specifik region i værts genomet. I virkeligheden er dette en sjælden begivenhed, og dissociations kurven analyse svarer til at køre en agrose gel til at visualisere korrekt størrelse konventionelle RT-PCR amplicons. Rækken af acceptable Tm -værdier er blevet tilvejebragt (77-80 °c) baseret på de data, der er indsamlet i vores laboratorium. Det anbefales kraftigt, at de enkelte laboratorier samler in-House data for at sikre, at sortimentet kan overføres og ændres i overensstemmelse hermed. Fortolkningen af resultaterne fra både forstærknings-og dissociations plottet sammen med de positive og negative kontroller og ß-actin-resultaterne muliggør robuste og reproducerbare diagnostiske resultater.
Uden for rammerne af denne protokol er RNA udvinding metode, der anvendes til opnåelse af høj kvalitet RNA. Alle RNA analyseret i denne protokol blev udarbejdet ved hjælp af TRIzol; Men, der er mange egnede guanidium-baserede ekstraktioner RNA ekstraktions protokoller tilgængelige, herunder kolonne og perle-baserede ekstraktions kits. Håndtering af lyssavirus positive (eller formodede positive) prøver skal være inden for de licenserede bioindeslutnings faciliteter, der er godkendt i landet. Det totale RNA-ekstraherede stof er imidlertid ikke-infektiøs og håndteres derfor i laboratorier med lav indeslutning. Afhængigt af den anvendte ekstraktionsmetode skal kravet om kvantificering og fortynding af RNA vurderes. For phenol-baserede ekstraktioner, herunder TRIzol, er dette trin påkrævet og forhindrer hæmning af analysen i at forurere gDNA; dog kræver kolonne-og perle baserede ekstraktioner (især dem med en DNA-udtynding) ikke fortynding før testning.
I hele protokollen er det vigtigt, at pleje og flid bruges til at forhindre krydskontaminering og nøjagtig tilsætning af prøve til de korrekte brønde. Et regneark med reagens beregninger og plade layout kan downloades som en supplerende fil. God laboratoriepraksis, herunder rene arbejdsflader, regelmæssige ændringer af handsker, brug af barriere spidser og forskellige rum/UV-kabinetter for at adskille hvert trin vil minimere risikoen for kontaminering. For at sikre, at testen klarer sig med de forventede parametre, skal der inkluderes positive og negative kontroller, og alle testprøver køres i to eksemplarer (eller tre eksemplarer).
Inkludering af kontrol er et væsentligt element i enhver PCR, især for diagnostik. Positiv kontrol RNA blev fremstillet af CVS (Challenge virus standard) inficerede musehjerner i partier og valideret og kalibreret for at sikre konsistens mellem batcher. Kontrol-RNA blev kvantificeret og fortyndet til 1 μg/μL. RNA, for hvilket der blev opnået et positivt resultat i en seriel fortynding ned til mindst 10-4 (svarende til 100 PG/μl), blev anset for egnet til formålet. Den positive kontrol RNA blev opbevaret ved-80 °C i 10-1 aliquoter. Når det er nødvendigt, blev en alikvot fortyndet 1:100 til at forsyne en arbejds bestand med 1 ng/μL og opbevaret ved-80 °C i 5 μL engangs-aliquoter. Det fortyndede positive kontrol RNA blev brugt til at repræsentere positive prøver på lavt niveau og til at sikre, at enhver reduktion i analysens følsomhed blev påvist. Der blev holdt et» kontrolkort «for hver kontrol for at overvåge Ct -værdierne og identificere tendenserne (tabel 5). Tabel 5 viste god Inter-Run sammenlignelighed for CVS positive Control Sample Ct og tm værdier på tværs af flere dage og operatører, hvilket giver vished for, at analysen er robust og reproducerbar. Resultater, der afviger fra disse målinger, bør undersøges, og prøve prøverne gentages om nødvendigt. Molekylær kvalitet vand blev inkluderet i hver kørsel som en NTC at bekræfte reagenserne var fri for kontaminering med lyssavirus RNA og bekræfte en negativ prøve. For at sikre RNA-ekstraktions effekten blev ß-actin desuden testet sammen med testprøverne i et separat rør. Lyssavirus positive Control RNA blev også anvendt til ß-actin positive Control. Andre endogene gener eller heterologe interne kontrolsystemer kan udnyttes. Brugen af disse kontroller sikrede, at alle trin blev analyseret under de samme betingelser som testprøverne. Lejlighedsvis, hvis prøven var meget forringet eller ikke indeholder tilstrækkelig vært RNA (såsom spyt eller CSF), kan den endogene gen PCR mislykkes. I dette tilfælde, hvor lyssavirus real-time RT-PCR resultat var positiv, bekræftelse på en uafhængig RNA-ekstraktion-at udelukke kontaminering under RNA ekstraktion på den oprindelige test eller ved en sekundær test (enten molekyle, såsom konventionel RT-PCR) eller fedt. Anvendelse af tabel 4 under analyse af en diagnostisk prøve sikrede den korrekte fortolkning.
Uanset den molekylære analyse, der anvendes til at bekræfte rabies infektion, opfølgende undersøgelser ved hjælp af sanger sekventering at bestemme lyssavirus arter og klassiske teknikker i virologi såsom fedt eller virusisolation bør også foretages for at give mulighed for yderligere viruskarakterisering og støtteanmeldelsen af positive tilfælde til OIE og WHO.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at takke Miss Emma Wise og Miss Megan Golding for at hjælpe med at færdiggøre eksperimenterne. Udviklingen af denne protokol blev finansielt støttet af det britiske ministerium for miljø, fødevarer og landdistrikter (defra), den skotske regering og den walisiske regering ved tilskud [SV3500 og SE0431] og af det europæiske virus Archive Global (EVAg) projekt, der har modtaget støtte fra eu’s Horisont 2020-forsknings-og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale nr. 653316.
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |