यह वास्तविक समय आरटी-पीसीआर dsDNA intercalating डाई का उपयोग lyssavirus संक्रमण का निदान करने के लिए उपयुक्त है। विधि रेबीज संदिग्ध पूर्व-मर्चन या पोस्टमार्टम नमूनों से निकाले गए आरएनए के साथ शुरू होता है, मास्टर मिश्रण तैयारी, आरएनए इसके अलावा, वास्तविक समय मशीन की स्थापना और परिणामों की सही व्याख्या का विवरण।
आण्विक परख तेजी से कर रहे हैं, संवेदनशील और विशिष्ट, और रेबीज के निदान के लिए केंद्रीय बन गए हैं. पीसीआर आधारित परख का उपयोग रेबीज निदान की पुष्टि करने के लिए दशकों से किया गया है, लेकिन हाल ही में रेबीज संक्रमण का पता लगाने के लिए प्राथमिक विधि के रूप में ओआईई (विश्व संगठन फॉर एनिमल हेल्थ) द्वारा स्वीकार किया गया है। वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख वास्तविक समय डेटा प्रदान करते हैं, और बंद कर रहे हैं ट्यूब सिस्टम, सेटअप के दौरान संदूषण के जोखिम को कम से कम. डीएनए intercalating फ्लोरोक्रोम वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख महंगी जांच की आवश्यकता नहीं है, प्रति नमूना लागत को कम करने, और जब प्राइमर संरक्षित क्षेत्रों में डिजाइन किए हैं, assays कि वायरस वंश भर में विशिष्ट हैं बजाय सिर्फ एक वायरस के लिए विशिष्ट प्रजातियों संभव हैं. यहाँ हम एक पैन-lysavirus SYBR वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख है कि Lyssavirus जीनस भर में lyssaviruses का पता लगाता है का वर्णन, सबसे अलग वायरस IKOV, WCBV और LLEBV सहित. वियोजन वक्र विश्लेषण के साथ संयोजन के रूप में, इस परख संवेदनशील और विशिष्ट है, सभी lyssavirus प्रजातियों का पता लगाने के लाभ के साथ. परख गुणवत्ता आश्वासन वातावरण के साथ कई नैदानिक प्रयोगशालाओं में अपनाया गया है, मजबूत सक्षम, तेजी से, पशु और मानव रेबीज मामलों के संवेदनशील निदान.
आणविक पद्धतियों का उपयोग कर रेबीज का निदान 20181में OIE द्वारा स्वीकार किया गया था , रेबीज मामलों की पुष्टि में इन तकनीकों के लाभों को पहचानने, विशेष रूप से स्थितियों में जब नमूने उप इष्टतम हैं, या पूर्व-मर्चन निदान के लिए, के रूप में वहाँ लाइव वायरस या ताजा नमूने के लिए कोई आवश्यकता नहीं है. lyssaviruses के लिए पीसीआर assays एक रिवर्स प्रतिलेखन की आवश्यकता (आरटी) से पहले पीसीआर शुरू कर सकते हैं के रूप में जीनोम आरएनए है. आरटी-पीसीआर परख कि जीनोम के 3′ समीपस्थ क्षेत्र का पता लगाने सबसे संवेदनशील माना जाता है, के रूप में ट्रांसक्रिप्शनल gradients lysavirus प्रतिकृति के दौरान होते हैं. आम तौर पर इस्तेमाल किया आरटी-पीसीआर assays मोटे तौर पर दो श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है, अंत बिंदु (या जेल आधारित) और वास्तविक समय. दोनों दृष्टिकोण संवेदनशील और विशिष्ट होते हैं; हालांकि, वास्तविक समय परख ‘वास्तविक समय’ में परिणाम प्राप्त करने और एक पूरी तरह से बंद ट्यूब प्रणाली में प्रदर्शन किया जा रहा है, जिससे ऑपरेटर संदूषण के लिए क्षमता को कम करने के रूप में कुछ अतिरिक्त लाभ है. वास्तविक समय परख का उपयोग कर प्राप्त lyssavirus-विशिष्ट amplicons का पता लगाने के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण हैं. पहले hydrolysis जांच का इस्तेमाल करता है (जैसे TakMan जांच के रूप में) कि एक फ्लोरोफोर और एक कतार होते हैं. जब जांच प्रवर्धन के दौरान लक्ष्य क्षेत्र के लिए बांधता है, बहुलक के exonuclease गतिविधि fluorophore और क्वेन्चर के विघटन में परिणाम, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट मापा जा करने के लिए सक्षम करने. दूसरा एक डीएनए intercalating डाई का इस्तेमाल करता है (इस तरह के SYBR ग्रीन के रूप में fluorochrome) कि प्रवर्धन के दौरान फंसे डीएनए डबल करने के लिए बांध. बाध्य फ्लोरोक्रोम्स फ्लोरोक्रोम्स का उत्सर्जन करते हैं जो प्रत्येक चक्र में पाया जाता है, जिससे उत्पाद का वास्तविक समय का पता लगाने और परिमाणीकरण की अनुमति मिल जाती है। किसी भी dsDNA के लिए बाध्यकारी की गैर-विशिष्ट प्रकृति के कारण, प्रतिक्रिया की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए एक वियोजन वक्र विश्लेषण किया जाता है। वास्तविक समय आरटी-पीसीआर छोटे amplicon आकार के कारण तेजी से कर रहे हैं, आम तौर पर लंबाई में कम से कम 200 बीपी; हालांकि, संरक्षित क्षेत्रों में प्राइमर और जांच डिजाइन करने के लिए उपयुक्त क्षेत्रों की पहचान करना चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है, इसलिए जांच की आवश्यकता को दूर करना एक विशिष्ट लाभ है।
वास्तविक समय आरटी-पीसीआर की एक संख्या विशेष रूप से व्यक्तिगत उपभेदों या RABV2 के वंश का पता लगाने के लिए और भी जीनस3,4,5,6भर में lysaviruses का पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया है, 7,8,9. सभी परख कैसे प्राइमर संरक्षित पर निर्भर का पता लगाने की एक सीमा होगी (और यदि आवश्यक हो, जांच) दृश्यों जीनस भर में हैं. वास्तव में, उभरते या उपन्यास वायरस उपभेदों अत्यधिक विशिष्ट जांच आधारित परख अप्रभावी प्रदान कर सकते हैं. वास्तविक समय का पता लगाने (डीई बनाम जांच) की पसंद का इरादा आवेदन पर निर्भर करेगा. स्थानीय रूप से sourced मस्तिष्क सामग्री पर निगरानी का आयोजन एक प्रयोगशाला के लिए और नकारात्मक नमूनों की उच्च संख्या की उम्मीद, सस्ता intercalating डाई का उपयोग एक समझदार विकल्प है. SYBR ग्रीन दृष्टिकोण भी इष्टतम होगा जब स्कैनिंग निगरानी का आयोजन जहां उपन्यास या भिन्न lysaviruses की उपस्थिति अधिक प्रतिबंधित जांच आधारित परख द्वारा पता नहीं चल रहेगा.
जीनस लिसावायरस के सभी सदस्य रोग रेबीज का कारण बनते हैं, जो लक्षण दिखाई देने के बाद घातक होता है। मानव और पशु रेबीज के अधिकांश मामले रेबीज वायरस (आरएबीवी) के कारण होते हैं, जिसके लिए प्रमुख जलाशय घरेलू कुत्ता10है . चमगादड़ lyssaviruses के लिए महत्वपूर्ण मेजबान जलाशय हैं और सभी लेकिन दो lyssavirus प्रजातियों विशेषता चमगादड़ में सीधे पहचान की गई है – Ikoma lyssavirus (IKOV) और मोकोला वायरस (MOKV) – और इन दोनों में से, IKOV एक बल्ले मेजबान जलाशय है अनुमान लगाया गया है 11. 16 मान्यता प्राप्त lyssavirus प्रजातियों12के अलावा , वहाँ दो lyssaviruses है कि हाल ही में वर्णित किया गया है: ताइवान बैट lysavirus (TWBLV)13 और Kotalahti बल्ले lysavirus (KBLV)14. Lyssaviruses आनुवंशिक रूप से तीन phylgroups में विभाजित किया जा सकता है, lysaviruses के बहुमत के साथ, RABV सहित, phylogroup I से संबंधित. हालांकि, सबसे अलग lyssaviruses phylogroup III के हैं और RABV या phylogroup मैं वायरस दृश्यों को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन आरटी पीसीआर द्वारा पता लगाया जा करने की संभावना नहीं है।
यहाँ वर्णित परख वास्तविक समय प्राइमर जोड़ी JW12-N165, पहली बार 20053में वर्णित का इस्तेमाल करता है. प्राइमर को पैन-lysavirus होने के लिए डिजाइन किया गया था, हालांकि मूल आवेदन lysavirus प्रजातियों में अंतर करने के लिए जांच के साथ एक TakMan परख के रूप में किया गया था। बाद में पुष्टि है कि प्राइमर जोड़ी विशिष्टता में पैन-lysavirus था WCBV15सहित उपलब्ध सभी lyssavirus प्रजातियों पर एक 2 कदम SYBR वास्तविक समय परख का उपयोग प्राप्त किया गया था. प्राइमर जोड़ी यहाँ एक एक कदम आरटी-पीसीआर वास्तविक समय परख एक intercalating फ्लोरोक्रोम का उपयोग में वर्णित है, सभी 16 मान्यता प्राप्त lyssavirus प्रजातियों से प्रतिनिधियों का उपयोग मान्य. यह एक कदम वास्तविक समय परख एक तेजी से, संवेदनशील, lysavirus विशेष परख है और दर्शाता है कि प्राइमर की मजबूती भी अत्यधिक भिन्न lysavirus प्रजातियों की पहचान करने के लिए सेट.
पैन-lysavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परख वर्णित एक बंद ट्यूब, एक कदम परख जो सभी तीन phylogroups भर में lysaviruses का पता लगाता है. परख दोनों पशु और मानव रेबीज निदान के लिए मान्य किया गया है, पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतक सहित (ऑप्टिमली brainstem), और इस तरह की त्वचा बायोप्सी के रूप में पूर्व-मर्तबा नमूने, क्रमिक रूप से एकत्र लार, या मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ (सीएसएफ). इस परख में उपयोग किए गए प्राइमर को पहले आरएबीवी, ईबीएलवी-1 और ईबीएलवी-23के बीच अंतर करने के लिए जांच-आधारित परख के लिए डिजाइन और उपयोग किया गया था, जिसका उपयोग कई ओआईई रेबीज प्रयोगशालाओं में किया गया है और EURL प्रवीणता योजनाओं में लगातार प्रदर्शन करता है। बाद में इन प्राइमर के ‘पैन-lysavirus’ प्रकृति एक 2 कदम वास्तविक समय परख15का उपयोग कर की पुष्टि की गई है. यहाँ वर्णित परख आगे एक बंद ट्यूब, तेजी से प्रणाली को सक्षम करने के लिए एक एक कदम SYBR परख में आरटी-पीसीआर अनुकूलन करने के लिए प्राइमर का उपयोग किया गया है। इसके अलावा, रेबीज स्थानिकमारी वाले देशों में प्रशिक्षण इस परख का उपयोग कर पार संदूषण को कम करने और नमूने का पता लगाने के लिए बुनियादी PPE और गुणवत्ता प्रणालियों के साथ किसी भी प्रयोगशाला में लागू करने के लिए उपयुक्तता की पुष्टि की है, अभिकर्मकों और एक वास्तविक समय स्टोर करने के लिए सुविधाओं SYBR का पता लगाने के साथ मशीन. परख अत्यंत मजबूत है और वसा के साथ 100% संबंध है, विघटित नमूनों के लिए बेहतर संवेदनशीलता के साथ3. एक डीएनए intercalating डाई आधारित परख के लिए मुख्य लाभ में से एक एक जांच आधारित परख की तुलना में रिश्तेदार लागत है. एक अतिरिक्त लाभ यह है कि परख केवल दो प्राइमर का इस्तेमाल करता है, इसलिए अनुक्रम विचलन के कारण असफल पता लगाने का कम जोखिम होता है, जो पहले प्रकाशित जांच-आधारित परख में कमजोरी रही है। वास्तव में, सभी lysavirus प्रजातियों के प्रतिनिधियों (TWBLV और KBLV के अलावा) इस परख का उपयोग कर पता चला रहे हैं, और प्राइमर साइटों भर में TWBLV और KBLV के अनुक्रम विश्लेषण कोई महत्वपूर्ण विचलन दृढ़ता से सुझाव है कि वे भी सुझाव है कि वे भी का उपयोग कर का पता लगाया जाएगा पता चला है इस विधि. विश्लेषण वायरस भर में मनाया पता लगाने की सीमा की सीमा, दो मुख्य कारकों के कारण माना जा सकता है. पहला यह है कि आरएनए नैदानिक मस्तिष्क सामग्री से अलग किया गया था, इसलिए प्रत्येक undiluted नमूने में जीनोम प्रतियां की मात्रा सीधे तुलनीय नहीं है. आरएनए को कुल आरएनए को 1 ग्राम/जेडएल में समायोजित करके सामान्यीकृत किया गया था; हालांकि, उस नमूने के भीतर वायरल जीनोम आरएनए का अनुपात अलग-अलग होगा। दूसरा है lysavirus दृश्यों की विविधता, प्राइमर साइटों संरक्षित क्षेत्रों में स्थित होने के बावजूद, वहाँ भिन्नता की स्थिति बनी हुई है. इसलिए, यह आश्चर्य की बात नहीं है कि परख के लिए कम संवेदनशीलता के साथ lyssaviruses के बहुमत phylgroup द्वितीय और तृतीय वायरस हैं. वियोजन वक्र विश्लेषण एक आवश्यक पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करता है, एक झूठी सकारात्मक परिणाम है जो अन्यथा प्राइमर dimers के गठन के कारण हो सकता है, या मेजबान जीनोम में एक गैर विशिष्ट क्षेत्र के प्रवर्धन को कम. वास्तव में, यह एक दुर्लभ घटना है और वियोजन वक्र विश्लेषण सही ढंग से आकार पारंपरिक आरटी-पीसीआर amplicons कल्पना करने के लिए एक agarose जेल चलाने के लिए बराबर है। हमारी प्रयोगशाला में एकत्रित आंकड़ों के आधार पर स्वीकार्य टीएम मूल्यों की श्रेणी (77-80 डिग्री सेल्सियस) प्रदान की गई है। यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि अलग-अलग प्रयोगशालाओं में घर में डेटा collate सुनिश्चित करने के लिए सीमा transferrable है और तदनुसार संशोधन. प्रवर्धन और वियोजन दोनों भूखंडों से परिणामों की व्याख्या, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण और जेड-एक्टिन परिणामों के साथ, मजबूत और पुन: उत्पादनीय नैदानिक परिणामों को सक्षम बनाता है।
इस प्रोटोकॉल के दायरे के बाहर उच्च गुणवत्ता आरएनए प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता आरएनए निष्कर्षण विधि है। सभी आरएनए इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण TRIzol का उपयोग कर तैयार किया गया था; हालांकि, कॉलम और मनका-आधारित निष्कर्षण किट सहित कई उपयुक्त ग्वानिडियम-आधारित निष्कर्षण आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं। lyssavirus सकारात्मक (या संदिग्ध सकारात्मक) नमूनों की हैंडलिंग लाइसेंस प्राप्त biocontainment सुविधाओं के भीतर देश के भीतर मंजूरी दे दी होनी चाहिए. हालांकि, निकाले गए कुल आरएनए गैर संक्रामक है, इसलिए कम रोकथाम प्रयोगशालाओं के भीतर संभाला. उपयोग की जाने वाली निष्कर्षण विधि के आधार पर आरएनए की मात्रा निर्धारित करने और उसे कम करने की आवश्यकता का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी। फीनॉल-आधारित निष्कर्षणों के लिए, TRIzol सहित, इस कदम की आवश्यकता है और gDNA contaminating से परख के निषेध को रोकता है; हालांकि, स्तंभ और मनका आधारित extractions (विशेष रूप से एक डीएनए कमी चरण के साथ उन) परीक्षण से पहले कमजोर पड़ने की आवश्यकता नहीं है.
प्रोटोकॉल के दौरान, यह आवश्यक है कि देखभाल और परिश्रम को पार संदूषण और सही कुओं के लिए नमूने का सही इसके अलावा को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है. अभिकर्मक गणना और प्लेट लेआउट के साथ एक स्प्रेडशीट एक पूरक फ़ाइल के रूप में डाउनलोड के लिए उपलब्ध है. अच्छा प्रयोगशाला अभ्यास, स्वच्छ काम सतहों सहित, दस्ताने के नियमित परिवर्तन, बाधा युक्तियाँ और विभिन्न कमरों / यह सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण अपेक्षित पैरामीटर के साथ प्रदर्शन कर रहा है, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल किया जाना चाहिए और सभी परीक्षण नमूने डुप्लिकेट (या trilicate) में चलाते हैं।
नियंत्रण का समावेश किसी भी पीसीआर की एक अनिवार्य विशेषता है, विशेष रूप से निदान के लिए। सकारात्मक नियंत्रण आरएनए CVS (चुनौती वायरस मानक) बैचों में संक्रमित माउस दिमाग से तैयार किया गया था और मान्य और बैचों के बीच स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए calibrated. नियंत्रण आरएनए को परिमाणित किया गया था और उसे 1 ग्राम/जेडएल तक पतला किया गया था जिसके लिए एक क्रमिक कमजोर पड़ने में कम से कम 10-4 (100 pg/$L के बराबर) में एक सकारात्मक परिणाम प्राप्त किया गया था, उद्देश्य के लिए उपयुक्त माना गया था। सकारात्मक नियंत्रण आरएनए को 10-1 एलिकोट्स में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। जब आवश्यक हो, एक alicot पतला किया गया था 1:100 पर एक काम कर स्टॉक प्रदान करने के लिए 1 ng/$L और पर संग्रहीत -80 डिग्री सेल्सियस में 5 डिग्री एल एकल उपयोग alicuots. पतला सकारात्मक नियंत्रण आरएनए कम स्तर सकारात्मक नमूने का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और यह सुनिश्चित करने के लिए कि परख की संवेदनशीलता में किसी भी कमी का पता चला था. Ct मानों की निगरानी करने और प्रवृत्तियों की पहचान करने के लिए प्रत्येक नियंत्रण के लिए एक ‘नियंत्रण कार्ड’ रखा गया था (तालिका 5)। तालिका 5 कई दिनों और ऑपरेटरों भर में CVS सकारात्मक नियंत्रण नमूना सीटी और टीएम मूल्यों के लिए अच्छा अंतर रन तुलनीयता का प्रदर्शन किया, आश्वासन है कि परख मजबूत और reproduible है प्रदान करते हैं. परिणाम है कि इन माप से विचलित जांच की जानी चाहिए और यदि आवश्यक हो तो दोहराया नमूने परीक्षण. आणविक ग्रेड पानी एक NTC के रूप में हर रन में शामिल किया गया था पुष्टि करने के लिए अभिकर्मकों lysavirus आरएनए के साथ संदूषण से मुक्त थे और एक नकारात्मक नमूना की पुष्टि करें. इसके अलावा, आरएनए निष्कर्षण प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए, एक अलग ट्यूब में परीक्षण के नमूनों के साथ-साथ जेड-एक्टिन का परीक्षण किया गया था। lyssavirus सकारात्मक नियंत्रण आरएनए भी जेड-actin सकारात्मक नियंत्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था. अन्य अंतर्जात जीन या विषमतापूर्ण आंतरिक नियंत्रण प्रणालियों का उपयोग किया जा सकता है। इन नियंत्रणों के उपयोग ने यह सुनिश्चित किया कि सभी चरणों का परीक्षण नमूनों के समान ही परिस्थितियों में विश्लेषण किया गया। कभी कभी, अगर नमूना अत्यधिक अपमानित किया गया था या पर्याप्त मेजबान आरएनए शामिल नहीं था (जैसे लार या सीएसएफ के रूप में), अंतर्जात जीन पीसीआर विफल कर सकते हैं. इस उदाहरण में, जहां lyssavirus वास्तविक समय आरटी-पीसीआर परिणाम सकारात्मक था, एक स्वतंत्र आरएनए निष्कर्षण पर पुष्टि – मूल परीक्षण पर या एक माध्यमिक परीक्षण द्वारा आरएनए निष्कर्षण के दौरान संदूषण से इनकार करने के लिए (या तो आणविक, जैसे पारंपरिक आरटी-पीसीआर) , या FAT. नैदानिक नमूने के विश्लेषण के दौरान तालिका 4 का उपयोग सही व्याख्या सुनिश्चित करता है।
रेबीज संक्रमण की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया आणविक परख के बावजूद, इस तरह के वसा या वायरस अलगाव के रूप में virology में lysavirus प्रजातियों और शास्त्रीय तकनीकों का निर्धारण करने के लिए Sanger अनुक्रमण का उपयोग कर जांच का पालन भी करने के लिए अनुमति देने के लिए किया जाना चाहिए आगे वायरस की विशेषता और OIE और डब्ल्यूएचओ के लिए सकारात्मक मामलों की अधिसूचना का समर्थन करते हैं.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों प्रयोगों को पूरा करने में सहायता के लिए मिस एम्मा वाइज और मिस मेगन गोल्डिंग शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए आर्थिक रूप से पर्यावरण, खाद्य और ग्रामीण मामलों के लिए ब्रिटेन विभाग (Defra), स्कॉटिश सरकार और वेल्श सरकार द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था [SV3500, और SE0431] और यूरोपीय वायरस पुरालेख वैश्विक (EVAg) परियोजना है कि है अनुदान समझौते के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त नहीं 653316.
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |