Denna realtids RT-PCR som använder dsDNA interkalerande Dye är lämplig för att diagnostisera lyssavirus infektioner. Metoden börjar med RNA som utvinns ur rabies misstänkta före slakt eller post-mortem prover, med uppgifter Master Mix förberedelse, RNA tillägg, inställning av realtids maskin och korrekt tolkning av resultat.
Molekylära analyser är snabba, känsliga och specifika, och har blivit centrala för diagnostisering av rabies. PCR-baserade analyser har använts i årtionden för att bekräfta rabiesdiagnosen, men har nyligen godkänts av OIE (World Organisation for Animal Health) som en primär metod för att upptäcka rabies infektion. RT-PCR-analyser i realtid ger realtidsdata och är slutna rörsystem som minimerar risken för kontaminering under installationen. DNA interkalerande fluorokromkonjugerat Real-Time RT-PCR-analyser kräver inte dyra sonder, minimera kostnaden per prov, och när primers är utformade i bevarade regioner, analyser som är specifika för virus släkten snarare än specifika för bara ett virus arter är möjliga. Här beskriver vi en pan-lyssavirus SYBR Real-Time RT-PCR-analys som detekterar lyssaviruses över lyssavirus släkte, inklusive de mest avvikande VIRUSEN Ikov, WCBV och llebv. I samband med dissociationskursanalys är denna analys känslig och specifik, med fördelen att upptäcka alla lyssavirus-arter. Analysen har antagits i många diagnostiska laboratorier med kvalitetssäkrade miljöer, vilket möjliggör robust, snabb, känslig diagnos av djur-och Human rabies fall.
Diagnos av rabies med molekylära metoder godkändes av OIE i 20181, erkänner fördelarna med dessa tekniker för att bekräfta rabies fall, särskilt i situationer när proverna är suboptimala, eller för ante-mortem diagnos, eftersom det inte finns något krav på levande virus eller färska prover. PCR-analyser för lyssaviruses kräver omvänd Transkription (RT) innan PCR kan påbörjas eftersom genomet är RNA. RT-PCR-analyser som detekterar 3 ‘ proximala regionen av genomet anses vara de känsligaste, eftersom transkriptionella gradienter inträffar under lyssavirus-replikering. Vanliga RT-PCR-analyser kan delas i stort sett i två kategorier, slutpunkt (eller gel-baserad) och i realtid. Båda metoderna är känsliga och specifika. emellertid, realtids analysen har några ytterligare fördelar såsom att få resultat i “realtid” och utförs i ett helt slutet rörsystem, vilket minskar risken för operatörs förorening. Det finns två huvudsakliga metoder för att detektera lyssavirus-specifika amplikonerna som erhållits med hjälp av realtidsanalyser. Den första använder hydrolys sonder (t. ex. TaqMan sonder) som innehåller en fluorophore och en quencher. När sonden binder till målregionen under amplifiering, resulterar exonukleasaktiviteten i polymerasen i dissociation av fluorophore och quencher, vilket gör att den resulterande fluorescensen kan mätas. Den andra använder ett DNA-interkalating färgämne (fluorokrom såsom SYBR grön) som binder till dubbla strandsatta DNA under amplifiering. De bundna fluorokromer avger fluorescens som upptäcks vid varje cykel, vilket möjliggör detektering och kvantifiering av produkten i realtid. På grund av den icke-specifika karaktären av bindning till någon dsDNA, en dissociationskurva analys görs för att bekräfta specificiteten av reaktionen. Real tid RT-PCRS är snabba på grund av de små amplikon storlekar, vanligtvis mindre än 200 BP i längd; men att identifiera lämpliga regioner för att designa primers och sonder i bevarade regioner, kan vara utmanande, därför att ta bort kravet på en sond är en klar fördel.
Ett antal realtids RT-PCRS har utformats för att specifikt upptäcka enskilda stammar eller linjer av rabv2 och även för att upptäcka lyssaviruses i släktet3,4,5,6, 7,8,9. Alla analyser kommer att ha en gräns för detektion beroende på hur bevaras primer (och om nödvändigt, sonden) sekvenser är över släktet. Faktum är att framväxande eller nya virusstammar kan göra den mycket specifika sond-baserade analyser ineffektiva. Valet av realtidsdetektering (Dye kontra sond) kommer att bero på den avsedda applikationen. För ett laboratorium som utför övervakning på lokalt inköpta hjärn material och förväntar sig ett stort antal negativa prover, är användningen av de billigare interkalerande färgämne ett förnuftigt val. Den SYBR Green tillvägagångssätt skulle också vara optimalt när de utför scanning övervakning där närvaron av nya eller avvikande lyssaviruses skulle förbli oupptäckt av mer begränsade sond-baserade analyser.
Alla medlemmar i släktet lyssavirus orsakar sjukdomen rabies, vilket är dödligt när symtomen uppträder. De allra flesta av människor och djur rabies fall beror på rabiesvirus (RABV), den dominerande reservoar som är den inhemska hunden10. Fladdermöss är viktiga värd reservoarer för lyssaviruses och alla utom två lyssavirus arter kännetecknas har identifierats direkt i fladdermöss-Ikoma lyssavirus (IKOV) och Mokola virus (MOKV)-och av dessa två har IKOV spekulerats för att ha en bat värd reservoar 11. Förutom de 16 erkända lyssavirus-arterna12finns det två lyssaviruses som nyligen har beskrivits: Taiwan bat lyssavirus (twblv)13 och kotalahti bat lyssavirus (kblv)14. Lyssaviruses kan vara genetiskt uppdelad i tre phylogroups, med majoriteten av lyssaviruses, inklusive RABV, som tillhör phylogroup I. Men de mest avvikande lyssaviruses tillhör phylogroup III och är osannolikt att upptäckas av RT-PCRs avsedda att rikta RABV eller phylogroup I virus sekvenser.
Analysen beskrivs här utnyttjar realtid primer par JW12-N165, som först beskrivs i 20053. Primers utformades för att vara Pan-lyssavirus även om den ursprungliga ansökan var som en TaqMan analys med sonder för att skilja lyssavirus arter. Efterföljande bekräftelse på att primerparet var Pan-lyssavirus i specificitet uppnåddes med hjälp av en 2-stegs SYBR realtidsanalys på alla lyssavirus arter tillgängliga inklusive WCBV15. Primer-paret beskrivs här i en One-Step RT-PCR realtidsanalys som utnyttjar en interkalerande fluorochrome, validerade med representanter från alla 16 erkända lyssavirus arter. Den här realtids analysen i ett steg är en snabb, känslig, lyssavirus-specifik analys och visar att primerens robusthet är inställd på att identifiera även mycket avvikande lyssavirus-arter.
Pan-lyssavirus Real-Time RT-PCR-analysen beskrivs är ett slutet rör, en-stegs analys som detekterar lyssaviruses över alla tre phylogroups. Analysen har validerats för både djur-och Human rabies diagnos, inklusive post-mortem hjärnvävnad (optimalt hjärnstammen), och ante-mortem prover såsom hudbiopsi, seriellt insamlade saliv, eller cerebral spinal Fluid (CSF). Primers utnyttjas i denna analys först utformades och utnyttjas för en sond-baserade analys för att skilja mellan RABV, EBLV-1 och EBLV-23, som har använts i många OIE rabies laboratorier och utför konsekvent i EURL kompetens system. Därefter “Pan-lyssavirus” arten av dessa primers har bekräftats med hjälp av en 2-stegs realtidsanalys15. Analysen som beskrivs här har utnyttjat primers att ytterligare optimera RT-PCR i ett steg SYBR-analys möjliggör en sluten slang, snabb system. Vidare, utbildning i rabies endemiska länder som använder denna analys har bekräftat lämplighet att genomföra i alla laboratorier med grundläggande personlig skyddsutrustning och kvalitetssystem för att minska korskontaminering och spår prov, anläggningar för att lagra reagenser och en realtid maskin med SYBR-detektering. Analysen är extremt robust och har 100% korrelation med FETTET, med förbättrad känslighet för nedbrutet prover3. En av de främsta fördelarna för en DNA interkalerande Dye baserad analys i jämförelse med en sond baserad analys är den relativa kostnaden. En ytterligare fördel är att analysen endast använder två primers, därför finns det mindre risk för misslyckad upptäckt på grund av sekvens divergens, vilket har varit en svaghet i tidigare publicerade sond-baserade analyser. Faktum är att representanter för alla lyssavirus arter (bortsett från TWBLV och KBLV) upptäcks med hjälp av denna analys, och sekvensanalys av TWBLV och KBLV över primer platser avslöjar inga betydande skillnader starkt tyder på att de kommer också att upptäckas med hjälp av Denna metod. Intervallet av detektionsgränsen observeras över de virus som analyseras, kan anses bero på två huvudsakliga faktorer. Den första är att RNA isolerades från kliniskt hjärn material, därför är mängden arvsmassa i varje outspädd prov inte direkt jämförbar. RNA var “normaliserade” genom att justera det totala RNA till 1 μg/μL; emellertid, andelen av viral arvsmassa RNA inom det urvalet kommer att variera. Den andra är mångfalden av lyssavirus sekvenser, trots att primer platser som ligger i bevarade regioner, finns det fortfarande positioner av variation. Därför är det inte förvånande att majoriteten av lyssaviruses med lägre känslighet för analysen är phylogroup II och III virus. Dissociationskurvan är en viktig parameter som minimerar ett falskt positivt resultat som annars kan uppstå på grund av bildandet av primer-dimerer eller förstärkning av en icke-specifik region i värdens arvsmassa. I verkligheten, detta är en sällsynt händelse och dissociation kurvan analys motsvarar att köra en aguppstod gel för att visualisera korrekt storlek konventionella RT-PCR amplicons. Utbudet av godtagbara Tm -värden har tillhandahållits (77-80 ° c), baserat på de data som samlats in i vårt laboratorium. Det rekommenderas starkt att enskilda laboratorier sammanställer in-House-data för att säkerställa att sortimentet kan överföras och ändras i enlighet med detta. Tolkningen av resultaten från både amplifiering och dissociation tomter, tillsammans med positiva och negativa kontroller och ß-Actin resultat, möjliggör robusta och reproducerbara diagnostiska resultat.
Utanför tillämpningsområdet för detta protokoll är RNA extraktionsmetod som används för att få hög kvalitet RNA. Alla RNA analyseras i detta protokoll var beredd med TRIzol; emellertid, det finns många lämpliga guanidium-baserade extraktioner RNA utvinning protokoll tillgängliga, inklusive kolumn och pärla-baserade extraktion kit. Hantering av lyssavirus positiva (eller misstänkta positiva) prover måste finnas inom licenserade anläggningar för bio inneslutning som godkänts inom landet. Det totala RNA som utvinns är dock icke-infektiöst och hanteras därför inom låg behållar laboratorier. Beroende på vilken extraktionsmetod som används skulle kravet att kvantifiera och späda RNA behöva bedömas. För fenolbaserade extraktioner, inklusive TRIzol, krävs detta steg och förhindrar hämning av analysen från att förorda gDNA. emellertid, kolonn och pärlbaserade extraktioner (särskilt de med en DNA-utarmning skede) inte kräver utspädning före provningen.
I hela protokollet är det viktigt att omsorg och aktsamhet används för att förhindra korskontaminering och korrekt tillsats av prov till rätt brunnar. Ett kalkylblad med reagensberäkningar och plattlayout kan hämtas som en kompletterande fil. God laboratoriesed, inklusive rena arbetsytor, regelbundna förändringar av handskar, användning av barriär spetsar och olika rum/UV-skåp för att separera varje steg kommer att minimera risken för kontaminering. För att säkerställa att testet utförs med förväntade parametrar, måste positiva och negativa kontroller inkluderas och alla testprover körs i två exemplar (eller tre exemplar).
Införandet av kontroller är ett viktigt inslag i alla PCR, särskilt för diagnostik. Positiv kontroll RNA utarbetades från CVS (Challenge virus standard) infekterade mus hjärnor i omgångar och validerade och kalibrerade för att säkerställa överensstämmelse mellan partier. KONTROLLRNA kvantifierades och späddes till 1 μg/μL. RNA för vilket ett positivt resultat erhölls i en seriell utspädning ner till minst 10-4 (motsvarande 100 PG/μl) ansågs lämplig för ändamålet. Det positiva KONTROLLRNA lagrades vid-80 ° c i 10-1- portioner. Vid behov späddes en alikvot till 1:100 för att ge en arbets lager på 1 ng/μL och lagras vid-80 ° c i 5 μL engångsportioner. Det utspädda positiva kontroll-RNA användes för att representera lågnivå positiva prover och för att säkerställa att någon minskning av känsligheten hos analysen upptäcktes. Ett kontrollkort hölls för varje kontroll för att övervaka Ct -värdena och identifiera trender (tabell 5). Tabell 5 visade god Inter-Run jämförbarhet för CVS-positiva kontrollprov Ct och tm värden över flera dagar och operatörer, vilket ger en försäkran om att analysen är robust och reproducerbar. Resultat som avviker från dessa mätningar bör undersökas och prover upprepas vid behov. Vatten av molekylär kvalitet ingick i varje körning som en NTC för att bekräfta att reagenser var fria från kontaminering med lyssavirus RNA och bekräfta ett negativt prov. För att säkerställa RNA-extraktionseffekten testades ß-Actin tillsammans med testproverna i ett separat rör. Lyssavirus positiva KONTROLLRNA användes också för den positiva kontrollen ß-Actin. Andra endogena gener eller heterologa internkontrollsystem kan utnyttjas. Användningen av dessa kontroller säkerställde att alla steg analyserades under samma förhållanden som testproverna. Ibland, om provet var kraftigt försämrad eller inte innehöll tillräckligt värdrna (såsom saliv eller CSF), kan den endogena genen PCR misslyckas. I detta fall, där lyssavirus realtids RT-PCR-resultat var positivt, bekräftelse på en oberoende RNA-extraktion-för att utesluta kontaminering under RNA-extraktion på det ursprungliga provet eller genom ett sekundärt test (antingen molekylärt, t. ex. konventionell RT-PCR) , eller fett. Användning av tabell 4 vid analys av ett diagnostiskt prov säkerställde en korrekt tolkning.
Oberoende av den molekylära analys som används för att bekräfta rabiesinfektion, bör även uppföljningsundersökningar med hjälp av sanger-sekvensering för bestämning av lyssavirus-arten och klassisk teknik i virologi, såsom fett-eller virusisolering, göras för att möjliggöra ytterligare virus karakterisering och stödja anmälan av positiva fall till OIE och WHO.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Miss Emma Wise och Miss Megan Golding för hjälp med att slutföra experimenten. Utvecklingen av detta protokoll stöddes finansiellt av det brittiska departementet för miljö, livsmedel och landsbygdsfrågor (DEFRA), Skottlands regering och walesiska regeringen genom bidrag [SV3500, och SE0431] och av European virus Archive global (EVAg) projekt som har erhållit finansiering från Europeiska unionens Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram enligt bidragsöverenskommelsen nr 653316.
Art Barrier pipette tips (various sizes) | Thermofisher | various | |
Centrifuge | Beckman | Allegra 21R | Rotor capable of holding 96 well plates required. Step 3.8. |
Centrifuge (mico) | Sigma | ||
Finnpipettes (to dispense 0.5-1000 µL) | Thermofisher | various | |
iTaq Universal SYBR Green One-Step RT-PCR kit | Bio-Rad | 172-5150 | Equivalent kits can be used if validated |
MX3000P or MX3005P real-tme PCR system | Stratagene | N/A | Eqivalent machines can be used if validated |
MicroAmp reaction plate base | Any suitable | Used to hold tube strip and plates securely. | |
Optically clear flat clear strips (8) | ABgene | AB-0866 | |
Perfect fit frame (if using tube strips) | Stratagene | N/A | Specific to machine |
Primers: for primer details see Table 2. | Ordered at 0.05 µmole scale HPLC purified. | ||
Thermo-Fast 96 well plares, non skirted | ABgene | AB-600 | |
Thermo-Fast strips (8) Thermo-tubes | ABgene | AB-0452 | |
Vortex machine / Whirlimixer | Fisons Scientific equipment | SGP-202-010J | |
Unless stated, alternative equipment can be used |