Summary
El filtrado de fragmentación de diagnóstico, implementado en MZmine, es un enfoque elegante de postadquisición para la pantalla de datasets LC-MS/MS para clases enteras de productos naturales conocidos y desconocidos. Esta herramienta busca espectros MS/MS para los iones de producto y/o pérdidas neutrales que el analista ha definido como diagnóstico para toda la clase de compuestos.
Abstract
Los productos naturales son a menudo biosintetizados como mezclas de compuestos estructuralmente similares, en lugar de un solo compuesto. Debido a sus características estructurales comunes, muchos compuestos dentro de la misma clase se someten a una fragmentación MS/MS similar y tienen varios iones de producto idénticos y/o pérdidas neutrales. El propósito del filtrado de fragmentación de diagnóstico (DFF) es detectar eficientemente todos los compuestos de una clase dada en un extracto complejo mediante el cribado de datasets LC-MS/MS no dirigidos para espectros MS/MS que contengan iones de productos específicos de la clase y/o pérdidas neutrales. Este método se basa en un módulo DFF implementado dentro de la plataforma MZmine de código abierto que requiere que los extractos de muestra sean analizados mediante la adquisición dependiente de los datos en un espectrómetro de masas de alta resolución, como Orbitrap cuadrupolo o masa de tiempo de vuelo cuadrupolo Analizadores. La principal limitación de este enfoque es que el analista primero debe definir qué iones de producto y/o pérdidas neutrales son específicos para la clase específica de productos naturales. DFF permite el descubrimiento posterior de todos los productos naturales relacionados dentro de una muestra compleja, incluyendo nuevos compuestos. En este trabajo, demostramos la efectividad de la DFF mediante el cribado de extractos de Microcystis aeruginosa, una prominente floración de algas dañina que causa cianobacterias, para la producción de microcistina.
Introduction
LA espectrometría de masas en tándem (MS/MS) es un método de espectrometría de masas ampliamente utilizado que implica aislar un ion precursor e inducir la fragmentación mediante la aplicación de energía de activación como la disociación inducida por colisión (CID)1. La forma en que un fragmento de iones está íntimamente ligado a su estructura molecular. Los productos naturales son a menudo biosintetizados como mezclas de compuestos estructuralmente similares en lugar de como un único químico único2. Como tal, compuestos estructuralmente relacionados que son parte de la misma clase biosintética a menudo comparten características de fragmentación de MS/MS clave, incluyendo iones de productos compartidos y/o pérdidas neutrales. La capacidad de detectar muestras complejas para compuestos que poseen iones de productos específicos de la clase y/o pérdidas neutrales es una estrategia poderosa para la detección de clases enteras de compuestos, lo que podría llevar al descubrimiento de nuevos productos naturales3, 4 , 5 , 6. durante décadas, los métodos de espectrometría de masas como el escaneo de pérdida neutra y el escaneo de iones precursor realizado en instrumentos de baja resolución han permitido la detección de iones con la misma pérdida neutra o iones de producto. Sin embargo, los iones o transiciones específicos debían definirse antes de realizar los experimentos. Como los espectrómetros de masas de alta resolución se han vuelto más populares en los laboratorios de investigación, las muestras complejas ahora se examinan comúnmente utilizando métodos de adquisición dependientes de datos (DDA) no dirigidos. En contraste con la pérdida neutra tradicional y el escaneo de iones precursores, los compuestos estructuralmente relacionados pueden identificarse mediante el análisis posterior a la adquisición7. En este trabajo, demostramos una estrategia que hemos desarrollado denominado filtrado de fragmentación de diagnóstico (DFF)5,6, un enfoque sencillo y fácil de usar para detectar clases enteras de compuestos dentro de matrices complejas. Este módulo DFF se ha implementado en la plataforma de código abierto MZmine 2 y está disponible descargando MZmine 2,38 o versiones más recientes. DFF permite a los usuarios de pantalla eficientemente los datasets de DDA para espectros MS/MS que contienen iones del producto y/o pérdidas neutrales que son diagnósticos para clases enteras de compuestos. Una limitación de DFF son los iones de producto característicos y/o las pérdidas neutrales para una clase de compuestos deben ser definidos por el analista.
Por ejemplo, cada una de las más de 60 micotoxinas fumonisina diferentes identificadas como8,9 poseen una cadena lateral tricarballylic, que genera un ion m/z 157,0142 (C6H5O5-) deproducto al fragmentación de la [M-H]- ion4. Por lo tanto, todas las fumonisinas putativas en una muestra pueden detectarse utilizando DFF mediante la detección de todos los espectros MS/MS dentro de un DataSet de DDA que contienen el ion de producto m/z 157,0142 prominente. Del mismo modo, los compuestos sulfados pueden detectarse mediante la detección de datasets DDA para espectros MS/MS que contengan una pérdida diagnóstica neutra de 79,9574 da (SO3)3. Este enfoque también se ha aplicado con éxito para la detección de nuevos péptidos cíclicos5 y productos naturales que contienen residuos de triptófano o fenilalanina6.
Para demostrar la efectividad de dff y su facilidad de uso dentro de la plataforma mzmine10, hemos aplicado este enfoque al análisis de microcistinas (MCS); una clase de más de 240 toxinas relacionadas estructuralmente producidas por las cianobacterias de agua dulce11,12,13.
Las cicotoxinas más comúnmente reportadas son MCS, con el congénere MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) más frecuentemente estudiado (figura 1). Los MCs son heptapéptidos monocíclicos no ribosómicos, biosintetizados por múltiples géneros de cianobacterias incluyendo Microcystis, Anabaena, Nostoc, y Planktothrix12,13. Los MCs se componen de cinco residuos comunes y dos posiciones variables ocupadas por los aminoácidos L. Casi todos los MCs poseen un residuo característico de β-Amino ácido 3-amino-9-metoxi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-ácido dienoico (ADDA) en la posición 511. Las vías de fragmentación de MS/MS de MCS se describen bien14,15; el residuo de ADDA es responsable del producto prominente de MS/MS, m/z 135,0803+ (c9h11O+), así como otros iones de producto incluyendo m/z 163,1114+ (c11h15 O+) (figura 2). Los datasets de DDA no dirigidos de extractos celulares de Microcystis aeruginosa pueden ser examinados para todas las microcistinas presentes utilizando estos iones diagnósticos, ya que las microcistinas tienen un residuo de ADDA.
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Protocol
1. preparación de los datasets de cromatografía líquida no objetivo (LC)-MS/MS
Nota: DFF se puede realizar utilizando cualquier espectrómetro de masas de alta resolución y un método analítico optimizado para una clase objetivo de analitos. Las condiciones de LC-MS/MS optimizadas para MC en el espectrómetro de masas Orbitrap se enumeran en la tabla de materiales.
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Descargar MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
Nota: los datos de ejemplo CPCC300. Raw se pueden encontrar en https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.- En el menú desplegable métodos de datos sin procesar , seleccione la opción de importación de datos sin procesar .
- Elija los archivos de datos que se analizarán. Se pueden importar archivos únicos o múltiples.
- Opcional Si el formato de datos del proveedor no es compatible con MZmine, utilice Proteowizard16 para generar archivos de datos centroided. mzml.
- Elija el filtro de picking pico para aplicar el algoritmo de centroiding suministrado por el proveedor.
2. filtrado de fragmentación de diagnóstico de archivos DDA importados
- Con el cursor, seleccione y resalte el archivo de datos en la columna archivos de datos sin procesar de la pantalla principal de mzmine.
- En el menú desplegable visualización , seleccione la opción de filtrado de fragmentación de diagnóstico .
- En el cuadro de diálogo DFF que aparece (figura 3), introduzca las siguientes opciones:
- Tiempo de retención: Utilice el rango automático o defina la gama de tiempos de retención en minutos cuando la clase de analitos objetivo se elute.
- Precursor m/z -utilice el rango automático o defina el rango m/z de la clase objetivo de analitos, incluyendo la posibilidad de múltiples compuestos cargados cuando sea apropiado.
- m/z tolerancia – Introduzca la precisión de masa MS/MS alcanzable del MSinstrument; 0,01 m/z o 3,0 ppm es apropiado para una plataforma Orbitrap. Si solo se investigarán los iones de diagnóstico del producto, introduzca 0,0 en la opción de valor de pérdida neutra de diagnóstico (da) . Por el contrario, si solo se investigarán las pérdidas de diagnóstico neutro, introduzca 0,0 en la opción de iones de producto de diagnóstico (m/z) .
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Iones de diagnóstico del producto (m/z) – Introduzca el (los) ion (s) del producto específico de la clase m/z. Separe los iones de varios productos con una coma.
Nota: al introducir varios iones de producto, se visualizarán espectros que contienen todos los iones de producto enumerados. -
Valor de pérdida neutra de diagnóstico (da) : Introduzca la pérdida neutra específica de clase (es). Separe las pérdidas neutrales múltiples con una coma.
Nota: al introducir múltiples pérdidas neutrales se visualizarán espectros que contienen todas las pérdidas neutrales enumeradas. Al introducir tanto los iones de diagnóstico como las pérdidas de neutros, se visualizarán espectros que satisfacen todos los criterios. - Intensidad mínima de iones de diagnóstico (% de pico de base) – como% del pico base de los espectros MS/MS, defina la intensidad mínima para los iones de diagnóstico de producto y/o las pérdidas neutrales que deben tenerse en cuenta.
- Archivo de salida peaklist : Seleccione una ruta y un nombre de archivo para generar los resultados.
- Haga clic en el botón Aceptar para iniciar el análisis de DFF. Una gráfica de DFF aparecerá al completar con éxito los pasos anteriores
Nota: se generarán dos archivos de datos. csv. {El archivo de salida de peaklist}. csv contiene el precursor m/z, los números de escaneo y los tiempos de retención de los escaneos. Esto se puede utilizar en los módulos existentes de MZmine, incluidos los métodos de datos sin procesar > detección de Picos > detección de picos específicos para generar cromatogramas de precursores de iones extraídos que cumplían los criterios de DFF definidos. {Archivo de salida peaklist} _ Data. csv contiene el precursor m/z, ion de producto m/z y tiempos de retención para permitir la generación de parcelas DFF fuera de mzmine.
3. ejemplo de uso de DFF para el análisis de microcistin
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Preparación de muestras
- Esterilizar 250 mL matraces erlenmeyer que contengan 30 mL de media MA estéril17 u otros medios de crecimiento de cianobacterias (BG-11) equipados con un tapón de espuma.
- Inocular medios de crecimiento esterilizados con un cultivo de cianobacterias a aproximadamente 5 × 105 células ml-1 bajo condiciones asépticas. Supervise la densidad de las células con un hemociómetro. En este ejemplo, crezca la cepa M. aeruginosa CPCC300 photoautotrógicamente a 27 ° c, iluminada con luz fluorescente blanca fría (30 μE M-2 s-1) usando una luz de 12 h: régimen oscuro de 12 h. Remolino las células una vez al día.
- Separe las células del medio de cultivo después de 26 días mediante filtración al vacío utilizando papeles de filtro de microfibra GF/C de 47 mm de diámetro.
- Añadir 3 mL de metanol al 80% (AQ) a las células cosechadas en un tubo (s) de ensayo de 14 ml.
- Vortex y posteriormente Sonicar el (los) tubo (s) de ensayo que contiene células de cianobacterias durante 30 s cada una. Conservar los tubos de ensayo a-20 ° c durante 1 h. devuelva el tubo de ensayo a temperatura ambiente y permita que la muestra (s) se descongele durante 15 min.
- Repita el paso 3.1.5 dos veces más para obtener eficazmente las celdas.
- Filtrar los extractos de células de cianobacterias resultantes a través de un filtro (s) de jeringa de PTFE de 0,22 μm.
- Extracto seco (s) con un evaporador a una temperatura de 30 ° c utilizando un flujo suave de gas nitrógeno. Conservar el extracto seco a-20 ° c hasta el análisis LC-MS/MS.
- Reconstituir el residuo seco con 500 μL de 90% de metanol (AQ) y vórtice durante 30 s en un vial de HPLC ámbar antes del análisis.
- Analizar el extracto de cianobacterias utilizando un método de adquisición de DDA en un espectrómetro de masas de alta resolución.
Nota: las condiciones de LC-MS optimizadas para el análisis MC utilizados aquí se enumeran en la tabla de materiales. - Prepare los archivos de datos del DDA e impórtelos en MZmine siguiendo los pasos 1,1 y 1,2.
- Seleccione los los datafiles e inicie los módulos DFF siguiendo los pasos 2.1-2.2.
- Para el análisis MC, utilice las configuraciones siguientes dentro del módulo DFF (figura 3).
- Tiempo de retención : Introduzca el rango de 2,00 a 6,00 min.
- Precursor m/z – entrada m/z rango de 430,00 a 1200,00.
- m/z tolerancia – aplicar tolerancia m/z de 0,01 m/z o 3,0 ppm.
- Iones de diagnóstico de producto (m/z) – entrada m/z de 135,0803, 163,1114 como los iones de producto de diagnóstico
- Valor de pérdida de diagnóstico neutro (da) : entrada 0,0 para definir que no se están utilizando pérdidas de diagnóstico neutro.
- Intensidad mínima de iones de diagnóstico (% de pico base) – Utilice 15,00 como umbral de intensidad mínima
- Archivo de salida peaklist : defina el archivo de salida como putative_MCs. csv.
- Haga clic en el botón Aceptar para iniciar el análisis de DFF. Una gráfica de DFF (figura 4) aparecerá al completar correctamente los pasos anteriores
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Representative Results
La gráfica DFF generada tras el análisis de M. aeruginosa CPCC300 se muestra en la figura 4. El eje xde esta gráfica es el m/z de los iones precursores que satisfacen los criterios definidos de DFF, mientras que el eje ymuestra el m/z de todos los iones de producto dentro de los espectros de MCS MS/MS. Para este análisis, los criterios para la detección de MC incluyeron iones precursores dentro del rango m/z de 440-1200, tiempos de retención entre 2,00 – 6.00 min. Lo que es más importante, estos espectros MS/MS contienen m/z 135,0803 y 163,1114 (± 3 ppm) por encima del umbral de intensidad de basepeak del 15% definido. En estas condiciones, se adquirieron un total de 4116 espectros MS/MS durante el análisis de LC-MS/MS DDA. De ellos, 26 espectros satisfechos con los criterios de la DFF se detectaron en el extracto de M. aeruginosa CPCC300. Sin embargo, se pueden adquirir múltiples espectros MS/MS en el mismo compuesto, particularmente para iones de mayor intensidad. En este extracto, sólo 18 precursor único m/z fueron encontrados. El ion más pequeño (m/z 497,2746, [m + 2H]2 +) es el complemento doblemente cargado del [m + H]+ precursor m/z 993,5389, que también fue detectado por DFF. Sobre la base de estudios previamente publicados sobre esta cepa M. aeruginosa 18, los principales MCS detectados se pueden asignar con seguridad como MC-LR y [D-ASP3] MC-LR. La investigación de los espectros de masas de los MCs putativos restantes reveló que dos eran 13isótopos C de otros MCS detectados (m/z 993,5389, 1025,5343) y otro era un ADUCTO de y MC de m/z 993,5389. De los 12 MCs putativos restantes, cuatro correspondían a las masas de MCs conocidos, y ocho eran compuestos previamente no reportados (archivo suplementario. Tabla S1).
Figura 1: estructura química de MC-LR. El residuo de ADDA es común en una gran proporción de MCs conocidos y produce iones de diagnóstico de producto en m/z 135,0803 y 163,1114. Se conocen otras variantes de MC que contienen un residuo de dimethyl-Adda y acetildemetil-Adda en la posición 5 y no producirían los mismos iones de producto. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: espectros MS/MS de MC-LR. Los espectros MS/MS adquiridos en un espectrómetro de masas Orbitrap mostrando el producto prominente ion en m/z 135,0803 derivado del residuo de ADDA. Un producto adicional ion en m/z 163,1114 también se deriva del residuo de Adda y aumenta la selectividad del análisis de DFF. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: cuadro de diálogo DFF dentro de MZmine. Los iones del producto y/o las pérdidas neutrales que son diagnósticos para la clase de compuestos objetivo son inputted. El tiempo de retención y los filtros de iones precursores se pueden utilizar para aumentar la selectividad del análisis. La intensidad mínima de iones diagnósticos hace referencia a la intensidad de umbral de los iones de producto de diagnóstico y a las pérdidas neutrales que deben lograrse para que los espectros satisfagan los criterios de DFF. La reducción de este valor puede dar lugar a impactos falsos positivos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: gráfica DFF para análisis MC de extracto celular M. aeruginosa. El análisis DFF del extracto de M. aeruginosa CPCC300 encontró 26 espectros que cumplieron con los criterios DFF definidos, que comprenden 18 valores M/z únicos. Hacer clic con el botón derecho en la gráfica permite al usuario "Alejar" el dominio y/o los ejes de rango. Se detectó un ion precursor doblemente cargado en m/z 497,2746 y correspondido a un MC desconocido en [m + H]+ 993,5389. Los dos MCs conocidos producidos por la cepa CPCC300 son [D-ASP3] MC-LR y MC-LR 18. En total, ocho MCs putativos no correspondían a la m/z de MCS conocidos, cuatro MCS correspondían a la m/z de múltiples congéneres y tres fueron encontrados para ser isótopos/aductos de otros MCS (archivo suplementario. Tabla S1). La gráfica DFF mostrada aquí se generó manualmente en Excel desde el "putative_MCs_data. csv" que se realizó automáticamente al ejecutar el módulo DFF. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplementario. Condiciones optimizadas para el análisis de LC-MS/MS de extractos de M. aeruginosa. Por favor haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La DFF es una estrategia rápida y directa para detectar clases enteras de compuestos, especialmente relevantes para el descubrimiento compuesto de productos naturales. El aspecto más importante de DFF es definir los criterios específicos de fragmentación de MS/MS para la clase de compuestos específica. En este ejemplo representativo, DFF se usó para detectar todos los residuos de Adda que contienen MCs presentes en un extracto celular de M. aeruginosa . Aunque la gran mayoría de los MCs contienen un residuo de Adda, se han conocido otros residuos en esta posición, en particular las variantes de demetilo y acetildemetilo-Adda19. Cualquier MCs con estos residuos no se detectaría utilizando los criterios definidos. Sin embargo, dado que DFF es un enfoque posterior a la adquisición, los fragmentos de diagnóstico adicionales se pueden investigar fácilmente en el mismo conjunto de datos mediante el Protocolo simple paso a paso que se describe aquí. Esto también permite al analista detectar compuestos con modificaciones hipotéticas que alterarían los iones de diagnóstico del producto y/o la pérdida neutra.
Los aductos y los fragmentos en origen también pueden cumplir los criterios de DFF y ser interpretados incorrectamente como analitos únicos. Los falsos positivos pueden surgir cuando otros compuestos presentes en el extracto exhiben los mismos iones del producto y/o pérdidas neutrales. En ambos casos, esto puede aliviarse mediante el uso de iones de producto adicionales y pérdidas neutrales que aumentan la selectividad del método.
Aunque los iones precursores pueden cumplir todos los criterios de DFF definidos por el analista y representar compuestos dentro de la clase objetivo, su identidad absoluta seguirá siendo putativa. Utilizando los niveles de confianza de identificación, propuestos por SCHYMANSKI (2014), los MCs detectados utilizando este enfoque de MS/MS tienen una confianza de identificación de ' nivel 3 ' cuando la fórmula molecular inequívoca del ion precursor puede ser asignada por masa precisa y el isótopo Perfil20. En este ejemplo, ocho MCs putativos tenían masas que correspondían a múltiples, MCs11isobáricos. La identidad absoluta se habría logrado ya sea comparando el tiempo de retención y los espectros de MS/MS con un estándar auténtico o confirmados por NMR y otros métodos espectroscópicos después de la purificación. Los compuestos putativos que no corresponden a masas de ningún miembro conocido de la clase objetivo, como los ocho MCs putativos detectados aquí, representan objetivos tangibles para descubrir nuevos productos naturales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar
Acknowledgments
Los autores agradecen a Heather Roshon (centro de cultura phycological canadiense, Universidad de Waterloo por proporcionar la cultura de las cianobacterias estudiadas y Sawsan Abusharkh (Universidad de Carleton) para la asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | - | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
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