Summary
Filtragem de fragmentação de diagnóstico, implementada em MZmine, é uma abordagem elegante, pós-aquisição para tela LC-MS/MS conjuntos de dados para classes inteiras de produtos naturais conhecidos e desconhecidos. Esta ferramenta procura espectros MS/MS para íons de produto e/ou perdas neutras que o analista definiu como sendo diagnóstico para toda a classe de compostos.
Abstract
Os produtos naturais são frequentemente biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de um único composto. Devido a suas características estruturais comuns, muitos compostos dentro da mesma classe sofrem a fragmentação similar de MS/MS e têm diversos íons idênticos do produto e/ou perdas neutras. O objetivo da filtragem de fragmentação diagnóstica (DFF) é detectar eficientemente todos os compostos de uma determinada classe em um extrato complexo, selecionando conjuntos de dados não direcionados de LC-MS/MS para espectros MS/MS que contenham íons de produto específicos de classe e/ou perdas neutras. Este método é baseado em um módulo DFF implementado dentro da plataforma MZmine de código aberto que requer extratos de amostra ser analisado por aquisição dependente de dados em um espectrómetro de massa de alta resolução, como Quadrupole Orbitrap ou Quadrupole massa de tempo de vôo Analisadores. A principal limitação desta abordagem é que o analista deve primeiro definir quais íons de produto e/ou perdas neutras são específicos para a classe alvo de produtos naturais. DFF permite a descoberta subseqüente de todos os produtos naturais relacionados dentro de uma amostra complexa, incluindo novos compostos. Neste trabalho, demonstramos a eficácia do DFF através da triagem de extratos de Microcystis aeruginosa, uma flor de algas nocivas proeminente causando cianobactérias, para a produção de microcistinas.
Introduction
A espectrometria de massas em tandem (MS/MS) é um método de espectrometria de massas amplamente utilizado que envolve isolar um íon precursor e induzir a fragmentação via aplicação da energia de ativação, como a dissociação induzida por colisão (CID)1. A forma como os fragmentos de íons estão intimamente ligados à sua estrutura molecular. Os produtos naturais são muitas vezes biossintetizados como misturas de compostos estruturalmente semelhantes, em vez de como um único produto químico único2. Como tal, compostos estruturalmente relacionados que fazem parte da mesma classe biossintética muitas vezes compartilham características-chave de fragmentação MS/MS, incluindo íons de produtos compartilhados e/ou perdas neutras. A capacidade de amostras complexas de tela para compostos que possuem íons de produto de classe específica e/ou perdas neutras é uma estratégia poderosa para detectar classes inteiras de compostos, potencialmente levando à descoberta de novos produtos naturais3, 4. º , 5. º , 6. por décadas, os métodos de espectrometria de massa, como a digitalização de perda neutra e a digitalização de íons precursores realizados em instrumentos de baixa resolução permitiram a detecção de íons com a mesma perda neutra ou íons de produto. No entanto, os íons ou transições específicas precisavam ser definidos antes da realização dos experimentos. Como espectrómetros de massa de alta resolução tornaram-se mais populares em laboratórios de pesquisa, amostras complexas são agora comumente rastreadas usando métodos de aquisição (DDA) não direcionados e dependentes de dados. Em contraste com a perda neutra tradicional e a varredura do íon do precursor, os compostos estruturalmente relacionados podem ser identificados pela análise do borne-aquisição7. Neste trabalho, demonstramos uma estratégia que desenvolvemos denominado filtragem de fragmentação diagnóstica (dff)5,6, uma abordagem direta e fácil de usar para detectar classes inteiras de compostos dentro de matrizes complexas. Este módulo DFF foi implementado na plataforma de código aberto, MZmine 2 e disponível baixando MZmine 2,38 ou lançamentos mais recentes. DFF permite aos usuários a tela eficientemente conjuntos de dados DDA para MS/MS espectros que contêm íons do produto (s) e/ou perda neutra (es) que são diagnósticos para classes inteiras de compostos. Uma limitação de DFF é íons do produto característico e/ou as perdas neutras para uma classe de compostos devem ser definidas pelo analista.
Por exemplo, cada uma das mais de 60 micotoxinas fumonisicas diferentes identificadas8,9possuem uma cadeia lateral tricarballylic, que gera um íon de produto m/z 157, 142 (C6H5O5-) após fragmentação do [M-H]- Ion4. Portanto, todas as fumonisinas putativas em uma amostra podem ser detectadas usando DFF por meio da triagem de todos os espectros MS/MS dentro de um conjunto de dados DDA que contenham o íon de produto m/z 157, 142 proeminente. Da mesma forma, os compostos sulados podem ser detectados pela triagem de conjuntos de dados DDA para espectros MS/MS que contêm uma perda neutra diagnóstica de 79,9574 da (SO3)3. Esta abordagem também foi aplicada com sucesso para a detecção de novos peptídeos cíclicos5 e produtos naturais que contêm resíduos de triptofano ou fenilalanina6.
Para demonstrar a efetividade do DFF e sua facilidade de uso dentro da plataforma MZmine10, aplicamos essa abordagem à análise de microcistinas (MCS); uma classe de mais de 240 toxinas estruturalmente relacionadas produzidas por cianobactérias de água doce11,12,13.
As cianotoxinas mais comumente relatadas são MCs, com o congéner MC-LR (leucina [L]/arginina [R]) mais freqüentemente estudado (Figura 1). MCs são heptapeptides não-ribossômicos monocílicos, biossintetizados por múltiplos gêneros de cianobactérias, incluindo Microcystis, Anabaena, no, e Planktothrix12,13. Os MCs são compostos por cinco resíduos comuns e duas posições variáveis ocupadas por aminoácidos L. Quase todos os MCs possuem um resíduo característico do ácido β-aminoácido 3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienoico (Adda) na posição 511. As vias de fragmentação MS/MS do MCS são bem descritas14,15; o resíduo de Adda é responsável para o íon proeminente do produto de MS/MS, m/z 135, 803+ (c9H11O+) assim como outros íons do produto que incluem m/z 163,1114+ (C11H15 O+) (Figura 2). Conjuntos de dados de DDA não direcionados de extratos celulares de Microcystis aeruginosa podem ser rastreados para todas as microcistinas presentes usando esses íons diagnósticos, dado que as microcistinas têm um resíduo de Adda.
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Protocol
1. preparação de cromatografia líquida não direcionada (LC)-conjuntos de dados MS/MS
Nota: DFF pode ser realizado usando qualquer espectrómetro de massa de alta resolução e método analítico otimizado para uma classe alvo de analitos. MC otimizado LC-MS/MS condições no Espectrómetro de massa Orbitrap estão listados na tabela de materiais.
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Transferindo MZmine 2 (http://mzmine.github.io/)
Nota: os dados de exemplo CPCC300. Raw podem ser encontrados em https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0.- No menu suspenso métodos de dados brutos , selecione a opção de importação de dados brutos .
- Escolha o arquivo (s) de dados a ser analisado. Arquivos simples ou múltiplos podem ser importados.
- Opcional Se o formato de dados do fornecedor não for suportado pelo MZmine, use o Proteowizard16 para gerar arquivos de dados centrados. mzml.
- Escolha o filtro de picking de pico para aplicar o algoritmo de centriding fornecido pelo fornecedor.
2. filtragem de fragmentação diagnóstica de arquivos DDA importados
- Usando o cursor, selecione e realce o arquivo de dados na coluna arquivos de dados brutos da tela mzmine principal.
- No menu suspenso Visualização , selecione a opção de filtragem de fragmentação de diagnóstico .
- Na caixa de diálogo DFF que aparece (Figura 3), insira as seguintes opções:
- Tempo de retenção – use o intervalo automático ou defina o intervalo de tempos de retenção em minutos quando a classe de analitos de destino elute.
- Precursor m/z -use auto Range ou defina a faixa m/z da classe de analisadores segmentadas, incluindo a possibilidade de vários compostos carregados quando apropriado.
- m/z tolerância – Insira a precisão de massa MS/MS realizável do MSinstrument; 0, 1 m/z ou 3,0 ppm é apropriado para uma plataforma Orbitrap. Se somente os íons diagnósticos do produto serão investigados, entrada 0,0 na opção diagnóstica do valor da perda neutra (da) . Inversamente, se somente as perdas neutras diagnósticas serão investigadas, entrada 0,0 na opção diagnóstica dos íons do produto (m/z) .
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Íons de produto de diagnóstico (m/z) – entrada do produto específico de classe Ion (s) m/z. Separe vários íons de produto com uma vírgula.
Nota: inserir vários íons de produto visualizará espectros que contenham todos os íons de produtos listados. -
Valor de perda neutra diagnóstica (da) – Introduza a classe de perda neutra específica (es). Separe múltiplas perdas neutras com uma vírgula.
Nota: a Incolocação de múltiplas perdas neutras visualizará espectros que contenham todas as perdas neutras listadas. A incolocação de íons de produtos diagnósticos e perdas de neutros visualizará espectros que satisfaçam todos os critérios. - Intensidade mínima do íon diagnóstico (% pico base) – como% do pico de base dos espectros MS/MS, definir a intensidade mínima para os íons do produto de diagnóstico e/ou perdas neutras a serem consideradas.
- Arquivo de saída Peaklist – selecione um caminho e um nome de arquivo para gerar os resultados.
- Clique no botão OK para iniciar a análise DFF. Um gráfico DFF aparecerá ao concluir com êxito as etapas acima
Observação: dois arquivos de dados. csv serão gerados. {Arquivo de saída Peaklist}. csv contém o precursor m/z, números de digitalização e tempos de retenção das varreduras. Isso pode ser usado em módulos MZmine existentes, incluindo métodos de dados brutos > detecção de pico > detecção de pico direcionada para gerar cromatogramas de íons extraídos de precursores que PREENCHERAM os critérios dff definidos. {Arquivo de saída do Peaklist} _ Data. csv contém o precursor m/z, o íon do produto m/z e os tempos de retenção para permitir a geração de plotagens dff fora do mzmine.
3. exemplo de uso de DFF para análise de microcistina
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Preparação da amostra
- Esterilizar 250 mL de frascos de Erlenmeyer contendo 30 mL de meio de MA estéril17 ou outros meios de crescimento de cianobactérias (BG-11) equipados com uma rolha de espuma.
- Inoculate meios de crescimento esterilizados com uma cultura de cianobactérias para aproximadamente 5 × 105 células ml-1 condições assépticas. Monitore a densidade da pilha com um Hemocytometer. Neste exemplo, cresça a estirpe de M. aeruginosa CPCC300 fotoautotrophically em 27 ° c, iluminado com luz fluorescente branca fresca (30 μe M-2 s-1) usando uma luz de 12 h: regime escuro de 12 h. Gire as células uma vez por dia.
- Separe as células do meio de cultura após 26 dias por filtração a vácuo usando 47 mm de diâmetro GF/C vidro filtro de microfibra papéis.
- Adicionar 3 mL de 80% de metanol (AQ) a células colhidas em 14 ml de tubo (s) de ensaio.
- Vortex e, subsequentemente, proceda o tubo (s) de teste contendo células de cianobactérias para 30 s cada. Conservar os tubos de ensaio a-20 ° c durante 1 h. devolver o tubo de ensaio à temperatura ambiente e permitir que a amostra (s) descongele durante 15 min.
- Repita o passo 3.1.5 duas vezes adicionais para efetivamente lyse as células.
- Filtre o extrato (s) de células de cianobactérias resultantes através de um filtro (s) de seringa de PTFE de 0,22 μm.
- Extrato seco (s) com um evaporador a uma temperatura de 30 ° c usando um fluxo suave de gás nitrogênio. Armazene o extrato seco a-20 ° c até a análise LC-MS/MS.
- Reconstituir o resíduo seco com 500 μL de 90% de metanol (AQ) e vórtice por 30 s num frasco de HPLC âmbar antes da análise.
- Analise o extrato de cianobactérias usando um método de aquisição DDA em um espectrómetro de massa de alta resolução.
Nota: as condições otimizadas de LC-MS para a análise de MC usadas aqui são alistadas na tabela de materiais. - Prepare os DataFile (s) DDA e importe para MZmine seguindo as etapas 1,1 e 1,2.
- Selecione os DataFiles e inicie os módulos DFF seguindo as etapas 2.1-2.2.
- Para a análise de MC, use as seguintes configurações dentro do módulo DFF (Figura 3).
- Tempo de retenção – Insira o intervalo de 2, 0 a 6, 0 min.
- Precursor m/z – entrada m/z intervalo de 430, 0 a 1200, 0.
- m/z tolerância – aplique a tolerância m/z de 0, 1 m/z ou 3,0 ppm.
- Íons diagnósticos do produto (m/z) -entrada m/z de 135, 803, 163,1114 como os íons diagnósticos do produto
- Valor de perda de diagnóstico neutro (da) – entrada 0,0 para definir que não há perdas de diagnóstico neutro estão sendo usados.
- Intensidade mínima do íon diagnóstico (% pico base) – use 15, 0 como o limiar de intensidade mínima
- Arquivo de saída Peaklist – defina o arquivo de saída como putative_MCs. csv.
- Clique no botão OK para iniciar a análise DFF. Um gráfico DFF (Figura 4) aparecerá após concluir com êxito as etapas acima
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Representative Results
A parcela de DFF gerada após a análise de M. aeruginosa CPCC300 é mostrada na Figura 4. O eixo xdeste gráfico é o m/z dos íons precursores que satisfizeram os critérios definidos do dff, enquanto o eixo ymostra o m/z de todos os íons do produto dentro dos espectros MS/MS do MCS. Para esta análise, os critérios para detecção de MC incluíram íons precursores dentro da faixa de m/z de 440-1200, tempos de retenção entre 2,00 – 6,00 min. Mais importante ainda, estes espectros MS/MS contêm m/z 135, 803 e 163,1114 (± 3 ppm) acima do limiar de intensidade basepeak de 15% definido. Nessas condições, um total de 4116 espectros MS/MS foram adquiridos durante a análise da LC-MS/MS DDA. Desses, 26 espectros satisfeitos com os critérios de DFF foram detectados no extrato de M. aeruginosa CPCC300. No entanto, vários espectros MS/MS podem ser adquiridos no mesmo composto, especialmente para íons de maior intensidade. Neste extrato, apenas 18 precursor único m/z foram encontrados. O íon o menor (m/z 497,2746, [m + 2h]2 +) é o complemento duplamente carregado do [m + H]+ precursor m/z 993,5389, que foi detectado igualmente por DFF. Com base em estudos publicados anteriormente nesta cepa18de M. aeruginosa , os principais MCS detectados podem ser CONFIANTEMENTE atribuídos como MC-LR e [D-ASP3] MC-LR. Investigar os espectros maciços dos MCS putativos restantes revelou que dois eram isótopos de 13C de outros MCs detectados (m/z 993,5389, 1025,5343) e outro era um aduto de e MC de m/z 993,5389. Dos 12 MCs putativos remanescentes, quatro correspondiam às massas de MCs conhecidas, e oito eram compostos previamente não relatados (arquivo suplementar. Tabela S1).
Figura 1: estrutura química do MC-LR. O resíduo de Adda é comum em uma grande proporção de MCs conhecidos e produz íons de produto de diagnóstico em m/z 135, 803 e 163,1114. Outras variantes MC que contêm um resíduo de dimetil-Adda e acetildemethyl-Adda na posição 5 são conhecidas e não produziriam os mesmos íons de produto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: espectros MS/MS de MC-LR. Espectros de MS/MS adquiridos em um espectrómetro de massa de Orbitrap que mostra o íon proeminente do produto em m/z 135, 803 derivado do resíduo de Adda. Um íon adicional do produto em m/z 163,1114 é derivado igualmente do resíduo de Adda e aumenta a seletividade da análise de DFF. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: caixa de diálogo DFF dentro MZmine. Os íons do produto e/ou as perdas neutras que são diagnósticos para a classe alvejada dos compostos são introduzidos. O tempo de retenção e os filtros de íons precursor podem ser usados para aumentar a seletividade da análise. A intensidade diagnóstica mínima do íon refere a intensidade do limiar dos íons diagnósticos do produto e das perdas neutras que devem ser conseguidas para que os espectros satisfaçam os critérios de DFF. A redução desse valor pode resultar em acertos falsos positivos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: parcela de DFF para análise de MC do extrato celular de M. aeruginosa. A análise de dff do extrato de m. aeruginosa CPCC300 encontrou 26 espectros que preencheram os critérios definidos do dff, compreendendo 18 valores únicos de m/z . Clicar com o botão direito do mouse no gráfico permite que o usuário "zoom out" os eixos de domínio e/ou intervalo. Um íon precursor duplamente carregado foi detectado em m/z 497,2746 e correspondeu a um MC desconhecido em [m + H]+ 993,5389. Os dois MCs conhecidos produzidos pela estirpe CPCC300 são [D-ASP3] MC-LR e MC-LR 18. No total, oito MCs putativos não correspondiam ao m/z de MCs conhecidos, quatro MCS correspondiam ao m/z de múltiplos congêismos e três foram encontrados como isótopos/adutos de outros MCS (arquivo suplementar. Tabela S1). O gráfico DFF mostrado aqui foi gerado manualmente no Excel a partir do "putative_MCs_data. csv" que foi feito automaticamente após a execução do módulo DFF. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar. Condições otimizadas para a análise de LC-MS/MS de extratos de M. aeruginosa. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
DFF é uma estratégia direta e rápida para a detecção de classes inteiras de compostos, especialmente relevantes para a descoberta de compostos de produtos naturais. O aspecto mais importante do DFF é definir os critérios específicos de fragmentação MS/MS para a classe de compostos de destino. Neste exemplo representativo, o DFF foi utilizado para detectar todos os resíduos de Adda contendo MCs presentes em extrato celular M. aeruginosa . Embora a grande maioria dos MCs contenha um resíduo de Adda, outros resíduos nesta posição foram conhecidos, notavelmente variantes de demetil e acetildemethyl-Adda19. Qualquer MCs com esses resíduos não seria detectado usando os critérios definidos. No entanto, como o DFF é uma abordagem pós-aquisição, fragmentos de diagnóstico adicionais podem ser facilmente investigados no mesmo conjunto de dados usando o protocolo simples passo a passo descrito aqui. Isso também permite que o analista detecte compostos com modificações hipotéticas que alterariam os íons do produto de diagnóstico e/ou perda neutra.
Adutos e fragmentos na fonte também podem atender aos critérios DFF e ser interpretados incorretamente como analitos únicos. Falsos positivos podem surgir quando outros compostos presentes no extrato exibem os mesmos íons de produto e/ou perdas neutras. Em ambos os casos, isso pode ser aliviado usando íons de produto adicionais e perdas neutras que aumentam a seletividade do método.
Embora os íons precursores possam atender a todos os critérios de DFF definidos pelo analista e representar compostos dentro da classe alvo, sua identidade absoluta ainda será putativa. Usando os níveis de confiança da identificação, propor por Schymanski (2014), os MCs detectados usando esta aproximação de MS/MS têm uma confiança da identificação do "nível 3" quando a fórmula molecular inequívoca do íon do precursor pode ser atribuída pela massa exata e pelo isótopo o perfil20. Neste exemplo, oito MCs putativos apresentavam massas que correspondiam a múltiplos MCs Isobáricos11. A identidade absoluta teria sido alcançada por qualquer comparação entre o tempo de retenção e os espectros MS/MS com um padrão autêntico ou confirmado por RMN e outros métodos espectroscópicos após a purificação. Os compostos putativos que não correspondem a massas de membros conhecidos da classe alvo, como os oito MCs putativos detectados aqui, representam alvos tangíveis para descobrir novos produtos naturais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar
Acknowledgments
Os autores agradecem Heather Roshon (centro de cultura phycological canadense, Universidade de Waterloo para fornecer a cultura do cianobactérias estudada e sawsan abusharkh (Universidade de Carleton) para a assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | - | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
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