Summary
诊断碎片过滤, 实现到 MZmine, 是一种优雅的, 采集后的方法, 筛选 LC-MMSMS 数据集的整个类别的已知和未知的天然产品。此工具搜索 msms 光谱, 以查找分析师定义为诊断整个类别化合物的产品离子和中性损耗。
Abstract
天然产物通常作为结构相似化合物的混合物而生物合成, 而不是单一的化合物。由于其共同的结构特点, 同一类别中的许多化合物经历了类似的 mmsms 碎裂, 并具有几个相同的产品离子和/或中性损失。诊断碎片过滤 (DFF) 的目的是通过筛选包含类特定产品离子和中性损耗的 mmsms 光谱的非目标 LC-MMS-MS 数据集, 有效地检测复杂提取物中给定类的所有化合物。该方法基于在开源 MZmine 平台内实现的 DFF 模块, 该模块要求在高分辨率质谱仪 (如四极 Orbitrap 或四极飞行时间质量) 上通过依赖数据的采集来分析样本提取物分析仪。这种方法的主要局限性是, 分析师必须首先定义哪些产品离子和/或中性损失是特定于目标类别的天然产品。DFF 允许随后在复杂的样品中发现所有相关的天然产品, 包括新的化合物。在这项工作中, 我们证明了 DFF 的有效性, 通过筛选提取物的铜绿小细胞石, 一个突出的有害藻类绽放导致蓝藻, 产生微囊藻。
Introduction
串联质谱 (mssms) 是一种广泛使用的质谱方法, 它涉及通过应用活化能 (如碰撞诱导离解 (cid)1) 来分离前体离子并诱导碎裂。离子碎片与其分子结构密切相关的方式。天然产物通常作为结构相似化合物的混合物进行生物合成, 而不是作为一种独特的化学物质2。因此, 属于同一生物合成类别的结构相关化合物通常具有关键的 mmsms 碎裂特性, 包括共享产品离子和/或中性损失。能够筛选复杂的样品中含有类特定产品离子和中性损耗的化合物, 这是检测整个类别化合物的有力策略, 有可能导致发现新的天然产品3,4 个,5,6. 几十年来, 在低分辨率仪器上进行中性损耗扫描和前体离子扫描等质谱方法使具有相同中性损耗的离子或产物离子被检测出来。但是, 在执行实验之前, 需要定义特定的离子或跃迁。由于高分辨率质谱仪在研究实验室中越来越流行, 复杂样品现在通常使用非目标采集 (DDA) 方法进行筛选。与传统的中性损耗和前驱离子扫描相比, 通过采集后分析7可以识别结构上相关的化合物。在这项工作中, 我们展示了一种我们开发的策略, 称为诊断碎片过滤 (dff)5,6, 一种直接和用户友好的方法来检测复杂矩阵中的整个类别的化合物。此 DFF 模块已实现到开源 MZmine 2 平台中, 并可通过下载 MZmine 2.38 或较新版本获得。DFF 允许用户有效地筛选 DDA 数据集的 msms 光谱, 其中包含产品离子和/或中性损耗, 可诊断为整个类别的化合物。DFF 的限制是典型的产物离子, 一类化合物的中性损耗必须由分析师定义。
例如, 在确定的60多个不同的富莫尼辛霉菌毒素中 ,每个都有一个三甲菌侧链, 产生一个m/z157.0142 (c6h5o5-) 产品离子[M-H]-离子4的碎裂。因此, 通过筛选包含突出的 msz157.0142 产品离子的 DDA 数据集中的所有 M/Z 光谱, 可以使用 DFF 检测样品中的所有假定富莫尼辛。同样, 通过筛选含有 79 9.9574 da (SO3) 3 的诊断中性损耗的 msms 光谱的 dda 数据集, 可以检测到硫化化合物。该方法也已成功地应用于检测新的循环肽5和含有色氨酸或苯基丙氨酸残留物6的天然产物。
为了证明 DFF 的有效性及其在 MZmine 平台10中的易用性, 我们将此方法应用于微囊藻毒素 (mc) 的分析;由淡水蓝藻 11、12、13产生的超过240种与结构有关的毒素。
最常见的报告氰基毒素是 Mc, 其中最常研究的是 MC-LR (亮氨酸 [L]/精氨酸 [R]) 同源物 (图 1)。Mc 是单环细胞非核糖体七肽, 由多个蓝藻属 (包括微囊藻、阿纳巴纳、诺斯托克和普兰克托特里克斯12,13) 进行生物合成。Mc 由5个常见残基和两个由 l-氨基酸占据的可变位置组成.几乎所有的 Mc 都有一个典型的β-氨基酸 3-氨基-9-甲氧基-2, 6, 8-三甲基-10-4, 6-二烯酸 (Ada) 残留在位置5 11。 Mcs 的 msms 碎裂途径得到了充分的描述14,15;ada 残渣负责突出的 m/z 产品离子, m/z 135.0803+ (c9h 11o +) 以及其他产品离子, 包括m/z 163.1114 + (c11h15) O+) (图 2)。使用这些诊断离子可以对存在的所有微囊藻进行非靶向 dda 数据集, 证明微囊藻毒素存在添加残留。
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Protocol
1. 非目标液相色谱 (LC)-ms变数据集的制备
注: DFF 可以使用针对目标类分析物优化的任何高分辨率质谱仪和分析方法执行。在轨道说唱质谱仪上的 mc 优化 LC-MSMS 条件列在材料表中。
-
下载 MZmine 2(http://mzmine.github.io/)
注: 示例数据 cpcc300. 原始数据可在 https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0 找到。- 在 "原始数据方法" 下拉菜单下, 选择 "原始数据导入" 选项。
- 选择要分析的数据文件。可以导入单个或多个文件。
- (可选)如果 MZmine 不支持供应商数据格式, 请使用 Proproowizard16生成质心. mzml 数据文件。
- 选择"峰值拾取" 筛选器以应用供应商提供的中心计算算法。
2. 导入的 DDA 文件的诊断碎片过滤
- 使用光标, 在主 MZmine 屏幕的原始数据文件列中选择并突出显示数据文件。
- 在 "可视化"下拉菜单下, 选择 "诊断碎片筛选"选项。
- 在出现的 DFF 对话框中 (图 3), 输入以下选项:
- 保留时间–使用自动范围或定义保留时间范围 (以分钟为单位), 当目标类分析物将旋转时。
- 前体m/z -使用auto 范围或定义目标类分析物的m/z范围, 包括在适当的情况下使用多个带电化合物的可能性。
- 姆贝兹公差–输入 ms分析仪可实现的 msms 质量精度;0.01 m/z 或 3.0 ppm 适用于 Orbitrap 平台。如果只调查诊断产品离子, 请将0.0 输入到诊断中性损耗值 (da)选项中。相反, 如果只调查诊断中性损耗, 则将 0.0输入诊断产品离子 (m/z)选项。
-
诊断产品离子 (mc/z) –输入类特定产品离子. 用逗号分隔多个产品离子。
注: 输入多个产品离子将可视化包含所有列出的产品离子的光谱。 -
诊断中性损失值 (da) –输入类特定的中性损耗。用逗号分隔多个中性损失。
注: 输入多个中性损耗将可视化包含所有列出的中性损耗的光谱。输入诊断产品离子和中性损耗将可视化满足所有标准的光谱。 - 最小诊断离子强度 (% 基峰) –作为 msms 光谱基峰的百分比, 定义要考虑的诊断产品离子和/或中性损耗的最小强度。
- 峰值列表输出文件–选择路径和文件名以输出结果。
- 单击"确定"按钮开始 dff 分析。成功完成上述步骤后, 将显示 DFF 绘图
注: 将生成两个. csv 数据文件。{Peaklist 输出文件}. csv 包含扫描的前体m/z、扫描编号和保留时间。这可用于现有的 MZmine 模块, 包括原始数据方法 > 峰值检测 ≫ 有针对性的峰值检测, 以生成符合规定的 dff 标准的前体提取的离子色谱图。{Peaklist 输出文件} _ data. csv 包含前体m/z、产品离子m/z和保留时间, 以允许在 M/Z 之外生成 dff 地块。
3. DFF 用于微囊藻毒素分析的示例
-
样品制备
- 消毒250毫升 Erlenmeyer 瓶含有30毫升的无菌 MA 培养基17或其他蓝藻生长介质 (BG-11), 并配有泡沫塞子.
- 在无菌条件下, 将蓝藻培养的接种灭菌培养基培养到大约 5x105细胞 ml-1.用血细胞仪监测细胞密度。在本例中,在27°c 时, 用凉爽的白色荧光灯 (30μem-2-1 ) 使用12小时的暗色状态: 12小时黑暗状态, 在27°c 时生长铜绿假单胞菌 m 光自体。每天旋转一次细胞。
- 使用直径 47 mm 的 gfc·玻璃超细纤维滤纸进行真空过滤, 在26天后将细胞从培养基中分离出来。
- 在14毫升试管中的采集细胞中加入3毫升的80% 甲醇(aq) 。
- 涡旋, 随后超声对含有蓝藻细胞的试管, 每个试管30秒。将试管存放在-20°c 1小时, 将试管送回室温, 使样品解冻15分钟。
- 重复步骤3.1.5 另外两次, 以有效裂解细胞。
- 通过 0.22μm PTFE 注射器过滤器过滤产生的蓝藻细胞提取物。
- 在30°c 的温度下使用温和的氮气流的干式萃取物。将萃取物储存在-20°c 干燥, 直至 LC-MSMS 分析。
- 在分析之前, 用琥珀色高效液相色谱小瓶中将干燥的残留物与500μl 的90% 甲醇(aq)和涡流重新构建为30秒。
- 采用高分辨率质谱仪上的 DDA 采集方法对蓝藻提取物进行分析。
注: 此处使用的用于 MC 分析的优化 LC-MS 条件列在材料表中。 - 按照步骤1.1 和1.2 准备 DDA 数据文件并导入到 MZmine 中。
- 选择数据文件并按照步骤 2.1-2.2 启动 DFF 模块。
- 对于 MC 分析, 请在 DFF 模块中使用以下设置 (图 3)。
- 保留时间–输入2.00至6.00分钟的范围。
- 前体M/z– 输入m/z范围为430.00 至 1200.00。
- 姆贝兹公差–应用m/z公差 0.01 m/z 或3.0 ppm。
- 诊断产品离子 (m/z) –输入 13.0803, 163.1114 作为诊断产品离子
- 诊断中性损失值 (da) –输入0.0,以定义没有使用诊断中性损耗。
- 最小诊断离子强度 (% 基峰) –使用15.00作为最小强度阈值
- 峰值列表输出文件–将输出文件定义为假定 _ mc. csv。
- 单击"确定"按钮开始 dff 分析。成功完成上述步骤后, 将显示 DFF 绘图 (图 4)
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Representative Results
图 4显示了在分析铜绿假单胞菌 ccc300 后生成的 dff 图。该图的x轴是满足定义的 dff 标准的前体离子的m/z,而y轴显示 mcs m/z 光谱中所有产物离子的m/z 。对于此分析, MC 检测的标准包括440-1200 范围内的前体离子, 保留时间在2.00–6.00 分钟之间。最重要的是, 这些 M/Z 光谱包含超过规定的15% 基峰强度阈值的 m/z135.0803 和 163.1114 (±3 ppm)。在此条件下, 在 LC-MSMS dda 分析过程中, 共获得了 4116 mmsms 光谱。其中, 26个光谱符合 DFF 标准, 在铜绿铜绿m ccc300 提取物中检测到。然而, 在同一化合物上可以获得多个 msms 光谱, 特别是对于高强度离子。在该提取物中, 只发现了18个独特的前体m/z z.最小离子 (m/z497.2746 , [M+2H]2 +) 是 [m + h] + 前体ms93.5389的双电荷补体, 事实上的 ff 也检测到了这一点.根据先前发表的关于这种铜绿假单胞菌菌株 18的研究, 检测到的主要 mc 可以自信地分配为 mc-lr 和 [d-asp3] mc-lr。对其余假定 Mc 的质谱进行研究后发现, 两个是其他检测到的 Mc 的13c 同位素 (m/z995389 , 1025.5343), 另一个是m/z 993.5389 的加合物和 mcs。在剩下的12个假定的 Mc 中, 4个对应于已知的 Mc 的质量, 8个是以前未报告的化合物 (补充档案)。表 S1)。
图 1: MC-LR 的化学结构。Ada 残留物在很大一部分已知的 Mc 中很常见, 在135.0803和 163.1114 m/zis 时产生诊断产品离子。其他含有二甲基 ada 和乙酰二甲基-ada 残留量的 MC 变种在第5位是已知的, 不会产生相同的产品离子。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: MC-LR 的 msms 光谱。在轨道说唱质谱仪上获得的 mmsms 光谱显示了从ada 残渣中提取的突出产物离子。还从ada 残基中提取了 163.1114 m/z163.1114 处的附加产品离子, 从而提高了 dff 分析的选择性。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: MZmine 中的 DFF 对话框.输入了对目标化合物类进行诊断的产物离子和中性损耗。保留时间和前体离子过滤器可用于提高分析的选择性。最小诊断离子强度是指诊断产物离子的阈值强度和必须达到的中性损耗, 才能使光谱满足 DFF 标准。降低此值可能会导致假阳性命中。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:铜绿假单胞菌细胞提取物mc 分析的 dff 图。对铜绿假单胞菌 cpcc300 提取物的 dff 分析发现, 26 种光谱符合定义的 dff 标准, 包括18个独特的m/z值。右键单击绘图允许用户 "缩小" 域和/或范围轴。在m/497.2746处检测到一个双带电前体离子, 并在 [m + h]+ 995389 对应于未知的 mc。菌株 CPCC300 产生的两个已知 Mc 是 [D-Asp3] MC-LR 和 MC-LR 18。总共有8个假定的 MCs 与已知的 MCs 不对应, 4个 mcs 对应于多个同源物的 m" ", 3个被发现是其他 mc 的同位素加合物 (补充档案)。表 S1)。 此处显示的 DFF 图是在 excel 中从执行 DFF 模块时自动生成的"假定 _ Mc _ data. csv"中手动生成的。请点击这里查看此图的较大版本.
补充文件。铜绿假单胞菌提取物 LC-MSMS 分析的优化条件.请点击此处下载此文件.
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Discussion
DFF 是一种直接和快速的检测整类化合物的策略, 尤其适用于天然产品化合物的发现。DFF 最重要的方面是为目标类化合物定义特定的 msms 碎片化标准。在这个具有代表性的例子中, DFF 被用来检测铜绿假单胞菌提取物中存在的所有含有 mcs 的 Ada 残留物。虽然绝大多数的 Mc 含有阿达残留物, 但这一位置的其他残留物已经知道, 特别是脱甲基和乙酰二甲基-阿达变种 19.不会使用规定的标准检测到任何含有这些残留物的 Mc。但是, 由于 DFF 是一种采集后的方法, 因此可以使用此处概述的简单分步协议轻松地在同一数据集上对其他诊断片段进行调查。这也允许分析师通过假设的修改检测化合物, 从而改变诊断产品离子和中性损失。
加管和源内片段也可能符合 DFF 标准, 并被错误地解释为唯一的分析物。当提取物中存在的其他化合物表现出相同的产物离子和/或中性损失时, 可能会出现假阳性。在这两种情况下, 这可以通过使用额外的产品离子和增加方法选择性的中性损耗来缓解。
尽管前体离子可能满足分析师定义的所有 DFF 标准, 并代表目标类中的化合物, 但它们的绝对特性仍将是假定的。使用 Schymanski (2014年) 提出的识别置信度, 使用此 mmsms 方法检测到的 Mc 在通过精确质量和同位素分配前体离子的明确分子公式时具有 "3级" 识别置信度配置文件 20。 在本例中, 8个假定的 Mc 具有对应于多个等压 Mc11的质量。通过将保留时间和 msms 光谱与真实标准进行比较, 或经 nmr 等光谱方法验证, 可以实现绝对的同一性。不符合目标类别的任何已知成员的大量化合物, 如这里检测到的8个假定 Mc, 是发现新自然产品的有形目标。
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Disclosures
作者们没有什么可以透露的
Acknowledgments
提交人感谢 He进roscon (加拿大水文文化中心、滑铁卢大学) 提供了所研究的蓝藻养殖, 并感谢 Sahsan Abusharkh (Carleton 大学) 的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyanobacteria | |||
| Microcystis aeruginosaCPCC300 | CANADIAN PHYCOLOGICAL CULTURE CENTRE | CPCC300 | https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/ |
| Software | |||
| Proteowizard (software) | software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | |
| Mzmine 2 | software | http://mzmine.github.io/ | |
| LC-MS | |||
| Q-Exactive Orbitrap | Thermo | - | Equipped with HESI ionization source |
| 1290 UHPLC | Agilent | Equipped with binary pump, autosampler, column compartment | |
| C18 column | Agilent | 959757-902 | Eclipse Plus C18 RRHD column (2.1 × 100 mm, 1.8 μm) |
| Solvents | |||
| Optima LC-MS grade Methanol | Fisher | A456-4 | |
| OptimaLC-MS grade Acetonitrile | Fisher | A955-4 | |
| OptimaLC-MS grade Water | Fisher | W6-4 | |
| LC-MS grade Formic Acid | Fisher | A11710X1-AMP | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Centrifuge Sorvall Micro 21 | Thermo Scientific | 75-772-436 | |
| Other | |||
| Amber HPLC vials 2 mL/caps | Agilent | 5182-0716/5182-0717 | |
| 0.2-μm PTFE syringe filters | Pall Corp. | 4521 | |
| Whatman 47mm GF/A glass microfiber filters | Sigma-Aldrich | WHA1820047 | |
| Media | |||
| MA media (pH 8.6) ( quantity / L) | Watanabe, M. F. & Oishi, S. Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions. Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985). | ||
| Ca(NO3)·4H2O, 50 mg | Sigma-Aldrich | C2786 | |
| KNO3, 100 mg | Sigma-Aldrich | P8291 | |
| NaNO3, 50 mg | Sigma-Aldrich | S5022 | |
| Na2SO4, 40 mg | Sigma-Aldrich | S5640 | |
| MgCl2·6H20, 50 mg | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium glycerophosphate, 100 mg | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| H3BO3, 20 mg | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bicine, 500 mg | Sigma-Aldrich | RES1151B-B7 | |
| P(IV) metal solution, 5 mL | |||
| Bring the following to 1 L with ddH2O | |||
| NaEDTA·2HO | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| FeCl3 ·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| MnCl2·4H2O | Baker | 2540 | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| Na2MoO4·2H2O | Baker | 3764 | |
| Cyanobacteria BG-11 50X Freshwater Solution | Sigma-Aldrich | C3061-500mL |
References
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