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Biochemistry

न्यूनतम पृष्ठभूमि स्कैटिंग के साथ मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक ऑल-इन-वन नमूना धारक

Published: July 6, 2019 doi: 10.3791/59722
Automatic Translation
1, 2, 1
1Macromolecular Crystallography (HZB-MX), Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Department Sample Environment, Helmholtz-Zentrum Berlin

Summary

एक उपयुक्त हैंडलिंग प्रोटोकॉल के साथ मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक उपन्यास नमूना धारक प्रस्तुत किया जाता है। प्रणाली क्रिस्टल विकास, क्रिस्टल भिगोने और दोनों पर situ विवर्तन डेटा संग्रह में किसी भी क्रिस्टल हेरफेर या बढ़ते की आवश्यकता के बिना परिवेश और क्रायोजेनिक तापमान की अनुमति देता है।

Abstract

मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी (एमएक्स) जैविक मैक्रो अणुओं के उच्च-रिज़ॉल्यूशन तीन आयामी ज्ञान प्राप्त करने के लिए सबसे प्रमुख तरीका है। विधि के लिए एक पूर्वावश्यकता यह है कि उच्च क्रमित क्रिस्टलीय नमूना का अध्ययन करने के लिए स्थूल अणु से उगाए जाने की आवश्यकता होती है, जिसे तब विवर्तन प्रयोग के लिए तैयार करने की आवश्यकता होती है। इस तैयारी की प्रक्रिया आम तौर पर समाधान से क्रिस्टल को हटाने शामिल है, जिसमें यह हो गया था, लिगेंड समाधान या क्रायो-सुरक्षित समाधान में क्रिस्टल के भिगोने और फिर प्रयोग के लिए उपयुक्त एक माउंट पर क्रिस्टल immobilizing. इस प्रक्रिया के लिए एक गंभीर समस्या यह है कि मैक्रोआण्विक क्रिस्टल अक्सर यंत्रवत् अस्थिर और बल्कि नाजुक होते हैं। नतीजतन, इस तरह के नाजुक क्रिस्टल की हैंडलिंग आसानी से एक संरचना निर्धारण प्रयास में एक बाधा बन सकता है। ऐसे नाजुक क्रिस्टलों पर लागू किया गया कोई भी यांत्रिक बल अणुओं की नियमित पैकिंग को परेशान कर सकता है और क्रिस्टल ोंके विवर्तन की शक्ति का नुकसान हो सकता है। यहाँ, हम एक उपन्यास सभी में एक नमूना धारक है, जो क्रिस्टल की हैंडलिंग चरणों को कम करने के लिए विकसित किया गया है और इसलिए संरचना निर्धारण प्रयोग की सफलता की दर को अधिकतम करने के लिए प्रस्तुत करते हैं. नमूना धारक आमतौर पर इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप कवर पर्चियों की जगह क्रिस्टल बूंदों की स्थापना का समर्थन करता है। इसके अलावा, यह क्रिस्टल गुहा के किसी भी उद्घाटन के बिना और क्रिस्टल हैंडलिंग के बिना लिगन्ड भिगोने, क्रायो-संरक्षण और जटिल गठन जैसे इन-प्लेस क्रिस्टल मैनीपुलेशन की अनुमति देता है। अंत में, नमूना धारक दोनों, परिवेश और क्रायोजेनिक तापमान पर situ एक्स-रे विवर्तन डेटा के संग्रह को सक्षम करने के लिए डिजाइन किया गया है। इस नमूना धारक का उपयोग करके, क्रिस्टलीकरण से विवर्तन डेटा संग्रह करने के लिए अपने रास्ते पर क्रिस्टल को नुकसान करने की संभावना काफी कम कर रहे हैं के बाद से प्रत्यक्ष क्रिस्टल हैंडलिंग अब आवश्यक है.

Introduction

जैविक स्थूल अणुओं की त्रि-आयामी संरचना का ज्ञान सभी बुनियादी जैविक, जैव रासायनिक और जैव-चिकित्सा अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण आधारशिला है। यह भी इस तरह के अनुसंधान के कुछ translational पहलुओं तक फैली हुई है, उदाहरण के लिए दवा की खोज के रूप में. परमाणु संकल्प एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी पर इस तरह के तीन आयामी जानकारी प्राप्त करने के लिए सभी तरीकों में सबसे शक्तिशाली और सबसे प्रमुख एक के रूप में तथ्य यह है कि सभी उपलब्ध संरचनात्मक जानकारी का 90% एक्स-रे द्वारा योगदान दिया है द्वारा सबूत है क्रिस्टलोग्राफी1| एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी की प्रमुख पूर्वावश्यकता, जो एक ही समय में इसकी प्रमुख सीमा है, यह है कि विवर्तन-गुणवत्ता क्रिस्टलों का उत्पादन करना होता है और विवर्तन प्रयोग के लिए तैयार किया जाता है। यह चरण अभी भी विधि की प्रमुख बाधाओं में से एक है।

ऐतिहासिक रूप से, प्रोटीन क्रिस्टल से विवर्तन डेटा परिवेश के तापमान पर एकत्र किए गए थे। व्यक्तिगत क्रिस्टल ध्यान से डेटा संग्रह से पहले कांच या क्वार्ट्ज केशिकाओं में स्थानांतरित कर रहे थे, माँ शराब केशिकाओं में जोड़ा गया था ताकि क्रिस्टल बाहर सूख नहीं होगा और केशिकाओं2,3सील कर दिया गया 4. 1980 के दशक के बाद से, यह अधिक से अधिक स्पष्ट हो गया है कि एक्स विकिरण के ionizing गुणों और मैक्रोआण्विक क्रिस्टल के आसन्न विकिरण संवेदनशीलता के कारण, परिवेश के तापमान पर डेटा संग्रह विधि पर गंभीर सीमाओं बन गया. परिणामस्वरूप, मैक्रोआण्विक क्रिस्टलों को 100 ज्ञ तक ठंडा करके तथा इतने कम तापमान5,6पर विवर्तन डेटा एकत्र करने के लिए विकिरण क्षति के प्रभावों को कम करने के लिए दृष्टिकोण विकसित किए गए। कम तापमान पर काम करने के लिए, गर्मी हस्तांतरण की कम दर के कारण केशिकाओं में नमूनों का बढ़ते अव्यावहारिक हो गया। इसके बावजूद, कम तापमान विवर्तन कार्य7,8, के लिए विशेष रूप से काउंटर-डिफ्यूजन क्रिस्टलीकरण प्रयोगों से केशिकाओं का उपयोग करने के लिए भी चल रहे प्रयास चल रहे हैं, लेकिन, इसके बावजूद, यह मानक बन गया स्थूल अणुक क्रिस्टलोग्राफी में एक पतली वायर्ड लूप9,10के अंदर मां शराब की पतली फिल्म द्वारा धारित स्थूल आण्विक क्रिस्टलों को माउंट करने के लिए दृष्टिकोण . हालांकि सुधार की एक संख्या (जैसे, लिथोग्राफिक छोरों और इसी तरह की संरचनाओं की शुरूआत11)इस पाश आधारित बढ़ते करने के लिए समय के साथ किया गया है, बुनियादी सिद्धांतों है कि 1990 के दशक के शुरू में विकसित किए गए थे आज भी उपयोग में हैं. यह सुरक्षित रूप से कहा जा सकता है कि स्थूल आण्विक क्रिस्टलों पर अधिकांश विवर्तन डेटा संग्रह आजकल अभी भी इस दृष्टिकोण 5 पर निर्भर करते हैं .

समय के साथ, वहाँ कुछ दिलचस्प नए घटनाक्रम और पाश आधारित बढ़ते विधि के संशोधन थे, लेकिन इन दृष्टिकोण अभी तक व्यापक रूप से समुदाय में अपनाया नहीं गया है. एक क्रिस्टल का तथाकथित लूप-कम माउंटिंग है, जिसे निम्न पृष्ठभूमि प्रकीर्णन12,13,14प्राप्त करने के लिए विकसित किया गया था। एक और एक क्रिस्टलीय नमूने लपेटो करने के लिए और उन्हें बाहर सुखाने से बचाने के लिए ग्राफीन म्यान का उपयोग है। ग्राफीन अपनी बहुत कम एक्स-रे प्रकीर्णन पृष्ठभूमि15के कारण इस संबंध में एक अच्छी तरह से अनुकूल सामग्री है।

हाल ही में, नमूना mounts के क्षेत्र में विकास मुख्य रूप से इस तरह के उदाहरण के लिए के रूप में एक से अधिक नमूना17पकड़ कर सकते हैं, जो नमूना थ्रूपुट16 बढ़ाने के उद्देश्य से या mounts डिजाइन करने के उद्देश्य से mounts के मानकीकरण पर ध्यान केंद्रित किया गया सिलिकॉन फ्रेम पर पैटर्न वाली झिल्ली, जो ज्यादातर सीरियल क्रिस्टलोग्राफी18,19,20,21,22के क्षेत्र में सैकड़ों छोटे क्रिस्टल धारण करने में सक्षम हैं .

अब तक चर्चा नमूना बढ़ते तरीकों के सभी अभी भी मैनुअल हस्तक्षेप के कुछ डिग्री की आवश्यकता है, जिसका अर्थ है कि नमूने के लिए यांत्रिक क्षति के कारण का एक अंतर्निहित खतरा है. इसलिए, नमूना वातावरण को इंजीनियरिंग द्वारा नए दृष्टिकोणों की मांग की जा रही है ताकि क्रिस्टल के विवर्तन डेटा को उनके विकास वातावरण में एकत्र किया जा सके। ऐसी ही एक विधि को सिटू या प्लेट-स्क्रीनिंग23,24 में कहा जाता है और इसे विश्व भर में25विभिन्न सिंक्रोट्रॉन स्रोतों पर मैक्रोआण्विक क्रिस्टलोग्राफी बीमलाइन्स की संख्या में पहले से ही कार्यान्वित किया जा चुका है . हालांकि, इस विधि का उपयोग क्रिस्टल प्लेट के ज्यामितीय मापदंडों और साधन के नमूना बिंदु के आसपास उपलब्ध स्थान द्वारा सीमित है।

अभी तक एक और दृष्टिकोण तथाकथित CrystalDirect प्रणाली26में महसूस किया है. यहाँ, पूरे क्रिस्टलीकरण बूँदें स्वचालित रूप से काटा जाता है. पन्नी जिस पर क्रिस्टल उगाया गया है कस्टम काट रहे हैं एक लेजर का उपयोग कर और सीधे नमूना धारक के रूप में इस्तेमाल किया27.

यहाँ वर्णित काम में, उद्देश्य एक नमूना धारक है, जो एक उपयोगकर्ता इसे छूने के बिना डेटा संग्रह डिवाइस के लिए अपने विकास कक्ष से क्रिस्टलीय नमूना स्थानांतरित करने की अनुमति होगी विकसित करने के लिए किया गया था और जो उपयोगकर्ता आसानी से नमूना हेरफेर करने के लिए सक्षम होगा. चूंकि मैक्रोआण्विक क्रिस्टलोग्राफी के क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं अभी भी बड़े स्क्रीनिंग अभियानों में पहचान की शर्तों को संशोधित करके क्रिस्टल विकास के अनुकूलन के लिए 24 अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्रारूप का उपयोग कर रहे हैं, नए नमूना धारक के लिए डिजाइन किया गया था इस स्वरूप के साथ संगत. निम्नलिखित में, नए नमूना धारक के डिजाइन का वर्णन किया जाएगा और हैंडलिंग और situ डेटा संग्रह और लिगन्ड भिगोने के लिए नमूना धारक के प्रदर्शन का प्रदर्शन किया जाएगा. अंत में, इस नए नमूना धारक की उपयुक्तता के साथ-साथ विभिन्न कार्य चरणों के लिए इसकी सीमाओं पर चर्चा की जाएगी।

Protocol

चेतावनी: सभी बाद के काम के लिए, यह बहुत महत्वपूर्ण है कि पीले रंग की पॉलीमाइड पन्नी को असुरक्षित उंगलियों से नहीं छुआ जाना चाहिए, नमूना धारक को संभावित संदूषण के कारण। इसके अलावा, संरक्षित सम्प्स के उपयोग की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।

1. नमूना धारक

  1. नमूना धारक के तीन प्रकार में से एक का प्रयोग करें.
    नोट: नए विकसित नमूना धारक के तीन अलग अलग संस्करणों चित्र 1में दिखाए जाते हैं। वे सब के सब एक काले प्लास्टिक का समर्थन संरचना, बाहर पर एक airtight सीओसी पन्नी और अंदर पर एक microporous संरचित polyimide पन्नी होते हैं. प्रकार 1 (चित्र 1A) में एक निश्चित बाहरी प्लास्टिक की अंगूठी होती है, जबकि प्रकार 2 और 3 (चित्र 1B,1C) के लिए बाहरी वलय को स्वचालित नमूना स्थानांतरण प्रणालियों में उपयोग के लिए निर्दिष्ट संबंधित विराम बिंदुओं पर यांत्रिक रूप से तोड़ा जा सकता है (लाल देखें ) चित्र 1Bमें तीर ). नमूना धारकों के डिजाइन पीले polyimide पन्नी पर कई क्रिस्टलीकरण बूँदें की स्थापना की अनुमति देता है. यह क्रिस्टलीकरण प्रयोग की निगरानी से समझौता नहीं करता है, क्योंकि सामग्री दृश्य प्रकाश के लिए अत्यधिक पारदर्शी है। 21 मीटर मोटी polyimide पन्नी भी 5 डिग्री मीटर pores, जो बाद में भिगोने से सरल क्रिस्टल हेरफेर की अनुमति देता है सुविधाएँ. चूँकि एक्स-रे का संचरण स्थूल आण्विक क्रिस्टलविज्ञान में सामान्यतः प्रयुक्त विवर्तन डेटा संग्रह ऊर्जा पर 1ण्0 के निकट होता है, अतः विवर्तन प्रयोग में विवर्तन में विवर्तन में पन्नी का योगदान नगण्य28होता है।

2. क्रिस्टलीकरण बूँदें स्थापना

  1. एक नम लिंट मुक्त कपड़े का उपयोग कर एक स्वच्छ और धूल मुक्त सतह बनाएँ। अपने बॉक्स से एक नमूना धारक ले लो और धीरे यह जगह, पीले पन्नी का सामना करना पड़, साफ सतह पर नुकसान या पीछे सीओसी पन्नी के अवांछित पंचर से बचने के लिए।
  2. यह आमतौर पर इस्तेमाल किया कवर स्लाइड पर किया जाएगा के रूप में पीले पन्नी पर 2 डिग्री सेल्सियस की एक अधिकतम सिफारिश की मात्रा के साथ क्रिस्टलीकरण बूँदें सेट करें। एक पिपेट का उपयोग कर पन्नी के किसी भी टूटना या भेदी से बचने के लिए धीरे बूंदों प्लेस रखें। प्रकार 1 ( चित्र2क) के नमूना धारक पर तीन बूंदों तक रखा जा सकता है, जबकि प्रकार 2 और 3 के नमूना धारकों पर अनुशंसित अधिकतम (चित्र 2ब्) होते हैं ।
  3. नमूना धारक को पलटें और इसे 24-वेल लिनब्रो शैली की प्लेट के पूर्व-ग्रीज़्ड गुहा पर रखें। नमूना धारक की स्थिति (चित्र 1Aमें लाल तीर देखें) का उपयोग करने के लिए यह अपनी इष्टतम स्थिति के लिए मार्गदर्शन.
  4. अवांछित वाष्पीकरण से बचने के लिए नमूना धारक की सही स्थिति सुनिश्चित करें (चित्र 2क)

3. क्रिस्टल विकास का अवलोकन

  1. ध्रुवणकर्ताओं के साथ या उसके बिना, संचरण प्रकाश सूक्ष्मदर्शी के नीचे क्रिस्टलीकरण प्लेट को रखकर प्रयोग की किसी भी गड़बड़ी के बिना क्रिस्टल वृद्धि की निगरानी कीजिए (चित्र4)।
  2. एसबीएस पदचिह्न प्लेटों पर उपयोग के लिए डिजाइन किए गए थे, जो प्रकार 3 (चित्र 1C)के छोटे 18 मिमी नमूना धारकों का उपयोग करते समय, एक और अधिक स्वचालित तरीके से क्रिस्टल विकास की निगरानी करने के लिए एसबीएस-फुटप्रिंट प्लेटों को संभालने में सक्षम एक इमेजिंग रोबोट का उपयोग करें।

4. क्रिस्टल हेरफेर

नोट: यह एक संचरण प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सभी बाद के चरणों को पूरा करने के लिए सिफारिश की है।

  1. क्रायो-सुरक्षा
    1. एक ठीक कैनुला का उपयोग करके बाहरी सीओसी पन्नी को धीरे से छेद करें। सुनिश्चित करें कि भीतरी पीले पन्नी अछूता रहता है। पंचर उस बूंद के ठीक बगल में होना चाहिए जिसे हेरफेर किया जाना है (चित्र 3क,3 सी) .
    2. एक ठीक कागज बाती का प्रयोग करें और यह poked छेद में डालें. ध्यान से बाती आगे धक्का जब तक यह पीले polyimide पन्नी छू. छिद्रित पन्नी के संपर्क में बाती रखें। बाती दूर सभी अतिरिक्त समाधान चूसना होगा. पूर्ण द्रव निष्कासन के लिए आवश्यक समय समाधानों की चिपचिपापन तथा मातृ-शराब संघटन पर निर्भर करता है (चित्र 3ख) ।
    3. सभी तरल दूर चूसा है के बाद, धीरे कागज बाती वापस ले लो. ड्रॉप की स्थिति याद रखें, क्योंकि यह माँ शराब को हटाने के बाद दिखाई नहीं हो सकता है.
    4. क्रायो-प्रोफेंट समाधान, अधिकतम की एक छोटी मात्रा को लागू करने के लिए एक मानक पिपेट लें। 3 $L, एक ही छेद के माध्यम से एक extruded टिप (उदा., एक जेल लोडिंग टिप) का उपयोग कर. एक बार तरल वितरित किया जाता है, टिप वापस ले. पीले पन्नी की रंध्रता पन्नी के पार प्रसार के लिए अनुमति देता है। अपने क्रिस्टल के क्रायो-सुरक्षा प्राप्त करने के लिए समय अत्यधिक नियोजित समाधान और उसके घटकों पर निर्भर करता है।
    5. स्वयं-उपचार COC पन्नी को रीसील करने के लिए, धीरे से छेद पर लगभग 1 s के लिए एक संरक्षित उंगली रखें और इसे पंचर के पार स्लाइड करें। ऊंचा तापमान के साथ संयोजन में मामूली दबाव पंचर की रीसील को बढ़ावा देगा, जो बहुत बड़ी नहीं हैं।
  2. लिगन्ड भिगोने

    नोट: अतिरिक्त माँ शराब लिगेंड भिगोने से पहले हटाया जा सकता है. ऐसा करने के लिए, 4.1.1 से 4.1.3 में वर्णित चरणों का पालन करें.
    1. एक प्रतिक्रिया ट्यूब में वांछित एकाग्रता में माँ शराब में लिगन्ड भंग.
    2. अघुलनशील कणों को हटाने के लिए 12,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए समाधान स्पिन। यदि आवश्यक हो तो तापमान-नियंत्रित अपकेंद्रण का उपयोग करें।
    3. धीरे से अधिकतम की एक मात्रा जगह है. 3 लिगन्ड का एल जिसमें सीओसी पन्नी और पॉलीमिडे फिल्म के बीच के अंतराल में एक लंबे, एक्सट्रूड पाइप्ट टिप का उपयोग किया जाता है। टिप वापस लें.
    4. आत्म-उपचार COC पन्नी reseal करने के लिए, धीरे के बारे में 1 s के लिए छेद पर एक संरक्षित उंगली जगह है और यह पंचर भर में स्लाइड (भी 4.1.5 देखें).
    5. मेब्रेन में प्रसार की अनुमति देने के लिए प्रयोग को कुछ समय के लिए इन्क्यूबेट करें। भिगोने का समय अत्यधिक विसरण विलयन तथा उसकेघटकों 29की चिपचिपापन पर निर्भर करता है .
    6. 4.2.1 से 4.2.5 कई बार करने के लिए कदम दोहराएँ बाद में विभिन्न ligands लेना.

5. परिवेश के तापमान पर situ विवर्तन डेटा संग्रह में

नोट: विलायक प्रकीर्णन को कम करने के लिए, डेटा संग्रह से पहले अतिरिक्त समाधान निकालें।

  1. पूर्व स्थापित स्थितियों30के साथ एक स्थिर आर्द्रता नियंत्रित बीमलाइन वातावरण सुनिश्चित करें।
  2. संदंश का उपयोग करते हुए निर्दिष्ट बिंदु पर पारदर्शी COC पन्नी को धीरे से उठाएं और इसे छील लें जैसे कि कोई दही कप से ढक्कन निकाल देगा ( चित्र 6ख) .
  3. धीरे से अपनी गुहा से नमूना धारक उठा और यह एक पूर्व तैयार चुंबकीय नमूना धारक आधार में तुरंत डालें. इस चरण के लिए कोई गोंद आवश्यक नहीं है (चित्र 6ख)
  4. आधार के भीतर नमूना धारक की सही स्थिति सुनिश्चित करने के लिए कोमल दबाव लागू करें।
  5. एक बीमलाइन गोनियोमीटर पर नमूना धारक माउंट और धारक की सही स्थिति सुनिश्चित करते हैं। गोनिओमीटर ज्यामिति के आधार पर नमूना धारक को विवर्तन प्रयोग के दौरान किसी भी छाया के कारण के बिना 160 डिग्री तक घुमाया जा सकता है।
  6. एक कागज की बाती का प्रयोग करें और धीरे से अतिरिक्त माँ शराब को दूर करने के लिए पीठ से पीले polyimide पन्नी को छूने. कृपया ध्यान दें, कि उस स्तर पर लिगन्ड भिगोने या क्रायो संरक्षण बस के रूप में अच्छी तरह से किया जा सकता है. नमूना अब केंद्र और विवर्तन डेटा संग्रह के लिए तैयार है.
  7. हटाने योग्य बाहरी अंगूठी के साथ एक नमूना धारक का उपयोग करते समय, बाहरी अंगूठी पर पकड़ द्वारा कोमल दबाव लागू होते हैं और निर्दिष्ट ब्रेक अंक पर इसे तोड़ने (चित्र 6C)। नमूना अब केंद्र और विवर्तन डेटा संग्रह के लिए तैयार है.

6. क्रायोजेनिक तापमान पर स्थिति विवर्तन डेटा संग्रह में

नोट: यह कदम 4.1.1 प्रदर्शन करके नमूने से अवशिष्ट माँ शराब को दूर करने के लिए सिफारिश की है. 4.1.3 करने के लिए. विलायक प्रकीर्णन को कम करने के लिए अगले चरणों के साथ जारी रखने से पहले। अधिकांश नमूनों को पूर्व क्रायो-संरक्षण31के बिना तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित किया जा सकता है। यदि क्रायो-सुरक्षा की आवश्यकता है, तो चरण 4.1.1 देखें। 4.1.5 करने के लिए.

  1. बलच्स का उपयोग करके निर्दिष्ट बिंदु पर सीओसी पन्नी को धीरे से उठाकर छील लें (चरण 5-1-2) (चित्र6क) देखें।
  2. गुहा से नमूना धारक ले लो और यह एक चुंबकीय नमूना धारक आधार पर माउंट. सही और तंग फिटिंग सुनिश्चित करने के लिए कोमल दबाव लागू किया जा सकता है (चरण 5.1.5 देखें, चित्र 6ख)।
    नोट: सममित रूप से व्यवस्थित नामित ब्रेक अंक कोमल दबाव लागू करके नमूना धारक की बाहरी अंगूठी को सरल हटाने के लिए अनुमति देते हैं (चरण 5.1.8., चित्र 6Cदेखें)। अब, नमूना धारक तैयार है और तरल नाइट्रोजन में डूब जा सकता है. नमूना धारक प्रकार 2 और 3 की ज्यामिति (चित्र 1B,1C) मानक स्पाइन नमूना शीशियों में उनके हस्तांतरण की अनुमति देता है , जिसका उपयोग रोबोट सहायता प्राप्त नमूना बढ़ते के लिए किया जा सकता है (चित्र 6D) ।

Representative Results

नमूना धारक प्रकार 1 इतना है कि यह एक 24 अच्छी तरह से Linbro शैली प्लेट की एक अच्छी तरह से फिट बैठता है डिजाइन किया गया है. प्रत्येक व्यक्ति नमूना धारक में बाह्य रिम के दोनों ओर स्थिति यथापा होते हैं ताकि कुएं के रिम पर इष्टतम स्थिति सुनिश्चित की जा सके (चित्र 1क, चित्र 2क) . अधिकतम आयतन 2 र्ल् प्रत्येक की तीन अलग-अलग क्रिस्टलन बूँदें पीत बहुमाइड पन्नी पर रखी जा सकती हैं (चित्र 2ठ)। प्रकार 2 और 3 के नमूना धारकों के लिए, यह अधिकतम मात्रा 2 डिग्री सेल्सियस प्रत्येक की दो बूंदों की एक अधिकतम सेट करने के लिए सिफारिश की है. 24 नमूना धारकों को एक 24-वेल लिनब्रो प्लेट पर लगाया जा सकता है (चित्र 3डी)।

नमूना धारक प्रकार 1 का उपयोग कर एक 24 अच्छी तरह से Linbro प्लेट पर एक क्रिस्टलीकरण प्रयोग स्थापित किया गया था. मुर्गी अंडे सफेद lysozyme समाधान के 1 $L (15 mg/mL) के साथ मिलाया गया था 1 $L माँ-शराब जिसमें 50 एमएम NaAc पीएच 4.7, 500 एमएम NaCl और 25% (w/v) PEG-6000 नमूना धारक पर पीले polyimide पन्नी पर (तालिका 1) . यह ड्रॉप 293 ज्ञ पर बराबर थी जबकि 5 घंटे के बाद माता-माता-माता के 500 डिग्री सेल्सियस तथा आकार के क्रिस्टल 40-50 उम पाए गए थे (चित्र 4) । क्रिस्टल वृद्धि को संचरण प्रकाश सूक्ष्मदर्शी (चित्र 4) के साथ या बिना पोलेकर का उपयोग करके देखा जा सकता है। उच्च पारदर्शिता फिल्मों का सबसे अच्छा अवलोकन और दोनों, एक पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोप या एक स्वचालित क्रिस्टल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर क्रिस्टल बढ़ती स्थितियों की निगरानी सुनिश्चित करते हैं। यूवी प्रकाश का उपयोग कर क्रिस्टल विकास अवलोकन का परीक्षण नहीं किया गया था।

क्रिस्टल के चारों ओर से माँ शराब को हटाने के बाद, मुर्गी अंडे सफेद lysozyme क्रिस्टल के साथ एक नमूना धारक क्रिस्टलीकरण प्लेट से लिया गया था और एक आर्द्रता नियंत्रित airstream में H$ B-MX बीमलाइन 14.332पर रखा गया था. डिफ्रान्कर डेटा परिवेशी तापमान पर 1 डिग्री-वृद्धि में एकत्र किया गया था, जिसमें 13.8 केवी ऊर्जा पर 150 डिग्री सेल्सियस बीम का उपयोग किया गया था जिसमें 4 x 10 फोटॉन/s और प्रति प्रतिबिंब 5 s का जोखिम समय था। चित्र 5में एक विशिष्ट विवर्तन प्रतिबिंब दर्शाया गया है। विवर्तन प्रतिबिंब पर कोई उन्नत पृष्ठभूमि प्रकीर्णन का पता नहीं लगाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त प्रायोगिक विवरण और संबद्ध आंकड़े प्रक्रमण आँकड़े तालिका 2में सूचीबद्ध हैं।

Figure 1
चित्र 1 : नए नमूना धारकों के Schematic दृश्य. नमूना धारकों एक काले प्लास्टिक का समर्थन है, जो एक अक्रिस्टलीय चक्रीय olefin copolymer (COC) पन्नी के साथ बाहरी पक्ष पर कवर किया जाता है से मिलकर बनता है. यह पन्नी (नीले रंग में रंग) अत्यधिक पारदर्शी और आत्म चिकित्सा है. यह भी प्रयोग की गैस जकड़न सुनिश्चित करता है. भीतरी पन्नी (पीले रंग में रंग) जैव-इनर्ट पॉलीमिडी से बना है, जो एक्स-रे के लिए अत्यधिक पारदर्शी है। इस पन्नी पर, क्रिस्टलीकरण बूँदें रखा जा सकता है. नमूना धारक के बाहरी रिम में लाल तीर (पैनल ए)द्वारा इंगित दो पोजीशनिंग एड्स होते हैं, जो क्रिस्टलीकरण प्लेट के व्यक्तिगत पूर्व-ग्रीस्ड गुहा पर नमूना धारक की सटीक नियुक्ति की अनुमति देता है। (ए) एक निश्चित बाहरी समर्थन अंगूठी के साथ 22 मिमी व्यास के साथ नमूना धारक (प्रकार 1)। (बी) नमूना धारक (प्रकार 2) हटाने योग्य बाहरी समर्थन अंगूठी के साथ 22 मिमी व्यास के साथ। (सी) नमूना धारक (प्रकार 3) हटाने योग्य बाहरी समर्थन अंगूठी के साथ 18 मिमी व्यास के साथ। बाद के दो उन्हें एक उच्च throughput फैशन में स्वचालित नमूना बढ़ते रोबोट के साथ का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया है SPINE मानक का उपयोग कर. नामित विराम बिंदु पैनल खमें लाल तीरों द्वारा हाइलाइट किए जाते हैं . पैनल सी में काला तीर स्थिति मार्कर को इंगित करता है। पीले पन्नी की बाहरी परिधि पर फैला पिन उत्पादन प्रक्रिया के दौरान polyimide पन्नी संरेखित करने के लिए आवश्यक हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : नमूना धारक एक 24-वेल Linbro प्लेट पर उसी तरह इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में आमतौर पर इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप कवर फिसल जाता है. यह गुहा airtight जवानों. पोजिशनिंग एड्स गुहा पर नमूना धारक की सही स्थिति सुनिश्चित करते हैं (पैनल एमें लाल तीर )। तीन अलग-अलग बूंदों तक एक प्रकार 1 नमूना धारक (पैनल बी) पर रखा जा सकता है, जबकि एक प्रकार 2 या 3 नमूना धारक पर रखा बूंदों की सिफारिश की अधिकतम संख्या दो है. प्रत्येक ड्रॉप के लिए अधिकतम अनुशंसित मात्रा 2 $L है, कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : 24 प्रकार 1 नमूना धारकों एक 24 अच्छी तरह से थाली पर फिट. नमूना धारकों को 24-वेल प्लेट पर दो ओरिएंटेशन में रखा जा सकता है जैसा कि संकेत दिया गया है (पैनल डी)। एक कैनुला का उपयोग क्रिस्टलीकरण ड्रॉप (पैनल ए और सी) से अतिरिक्त शराब को हटाने के लिए एक कागज की बाती का उपयोग करके वापस सीओसी पन्नी को छेदने के लिए किया जाता है । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : मुर्गी अंडे सफेद lysozyme क्रिस्टल की छवि एक polarizer के साथ सुसज्जित एक संचरण माइक्रोस्कोप के माध्यम से मनाया. व्यक्तिगत क्रिस्टल आसानी से वेग प्रोटीन समाधान से भेदभाव कर रहे हैं. इस छवि में क्रिस्टल 40 डिग्री x 50 उ के औसत आकार के हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें। 

Figure 5
चित्र 5 : नमूना धारक पर उगाई जाने वाली लाइसोजाइम क्रिस्टल की एक विशिष्ट एक्स-रे विवर्तन छवि। एक्स-रे के संपर्क में आने से पहले सभी अतिरिक्त मां शराब क्रिस्टल के चारों ओर से हटा दिया गया था। इलेक्ट्रॉन भंडारण वलय BESY II32 पर परिवेशी ताप पर 97.5% सापेक्ष आर्द्रता के साथ आर्द्रता नियंत्रित नमूना वातावरण का उपयोग करते हुए विपरिवर्तन आंकड़े एकत्र किए गए थे। नमूना धारकों के कारण कोई ऊंचा पृष्ठभूमि नहीं देखी जा सकती है। छवि में डैश्ड रेखाएँ रिज़ॉल्यूशन रिंग्स इंगित करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : नमूना धारक विवर्तन डाटा संग्रहण के लिए तैयार किया जाता है । सबसे पहले, सीओसी फिल्म धीरे एक forceps का उपयोग करके उठाया और फिर बंद खुली (पैनल ए)। बाद में, नमूना धारक गुहा से हटा दिया जाता है और एक चुंबकीय आधार के केंद्रीय छेद में डाला जब तक मार्कर (पैनल बी) द्वारा संकेत दिया जाता है। केंद्रीय भाग पर पकड़ कर, कोमल दबाव सममित रूप से व्यवस्थित नामित ब्रेक अंक (पैनल सी)का उपयोग कर केंद्रीय भाग को मुक्त करने के लिए बाहरी अंगूठी के लिए लागू किया जाता है। हटाने के बाद, नमूना धारक तरल नाइट्रोजन में डूब गया और मानक स्पाइन शीशियों में स्थानांतरित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, pucks में, वे synchron साइटों जहां स्वचालित नमूना बढ़ रोबोट उन्हें नियमित रूप से नमूने (पैनल डी) के रूप में पहचान करने के लिए ले जाया जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

क्रिस्टलीकरण विवरण
विधि हैंगिंग ड्रॉप, वाष्प प्रसार विधि
प्लेट प्रकार सुपरक्लियर प्लेट्स
तापमान (कश्मीर) 293
प्रोटीन एकाग्रता (मिलीग्राम एमएल-1) 15
जलाशय समाधान की संरचना 50 एमएम NaAc पीएच 4.7, 500 एम एन सीएल, 25 % (w/
वॉल्यूम और ड्रॉप का अनुपात 2 $L कुल, 1:1 अनुपात (प्रोटीन: माँ शराब
जलाशय की मात्रा 500 $L
इनक्यूबेशन समय 12 घंटे

तालिका 1: वर्णित क्रिस्टलीकरण प्रयोग का प्रायोगिक विवरण.

डेटा संग्रह और संसाधन
तरंगदैर्ध्य 0.89429
तापमान (कश्मीर) 293
वेक्षक Rayonix MX225 सीसीडी
क्रिस्टल-डिटेक्टर दूरी (मिमी) १२०
प्रति छवि घुमाव श्रेणी ($) 0.5
कुल रोटेशन रेंज ($) १२०
एक्सपोजर समय प्रति छवि (ओं) 5
अंतरिक्ष समूह पी 43212
इकाई-सेल पैरामीटर ($) a $ 79.01, b ] 79.01, c ] 37.95
मोसासिटी (जेड) 0.07
रिज़ॉल्यूशन श्रेणी ($) 39.50 - 1.35 (1.37 - 1.35)
प्रतिबिंबों की कुल संख्या 191940 (8932)
अद्वितीय प्रतिबिंबों की संख्या 27020 (1292)
पूर्णता (%) 99.88 (99.20)
बहुलता 7.1 (6.9)
मतलब मैं / 15.0 (1.9)
आरमीस35 (%) 6.3 (107.0)
आरपिम36 (%) 2.4 (40.4)
सीसी1/  99.9 (68.5)
इसा38 16.1
विल्सन बी-कारक ($2) 17.0

तालिका 2: Diffraction डेटा संग्रह और प्रसंस्करण आँकड़े.

Discussion

क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए उपयुक्तता. नए नमूना धारकों मानक फांसी ड्रॉप क्रिस्टलीकरण प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या तो 24-अच्छी तरह Linbro प्रकार प्लेटें (प्रकार 1 और 2), या 24 अच्छी तरह से एसबीएस पदचिह्न प्लेटें जिसमें प्रत्येक अच्छी तरह से 18 मिमी का एक व्यास है का उपयोग कर (प्रकार 3). वे मानक माइक्रोस्कोप कवर पर्चियों के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है. अक्रिस्टलीय सीओसी पन्नी प्रणाली की वायु-जलता सुनिश्चित करती है। क्रिस्टलीकरण प्रयोग की निगरानी एक संचरण प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर संभव है, क्योंकि उच्च स्पष्टता पन्नी के उपयोग की. हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, कोई अन्य नमूना धारकों के लिए मौजूद 24 अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेटें, जो क्रिस्टल हेरफेर या विवर्तन प्रयोगों की अनुमति होगी, यंत्रवत् ड्रॉप से क्रिस्टल को हटाने के बिना, जिसमें यह हो जाता है. यह विशेष महत्व का है, के बाद से क्षेत्र में कई शोधकर्ताओं अभी भी क्रिस्टल अनुकूलन के लिए ऐसी प्लेटों पर भरोसा करते हैं, तथ्य यह है कि बड़ी बूंद मात्रा 96 अच्छी तरह से बैठे ड्रॉप प्लेटों की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है के कारण. इन बड़ी बूंद मात्रा के साथ, बड़ा क्रिस्टल प्राप्त किया जा सकता है.

क्रिस्टल हेरफेर के लिए उपयुक्तता| बाहरी सीओसी पन्नी के आत्म-उपचार गुणों और आंतरिक पीले पॉलीमाइड पन्नी की सूक्ष्म संरचना के कारण, क्रिस्टल पर्यावरण सुलभ है और क्रिस्टल को यंत्रवत् रूप से अन्य कंटेनरों में स्थानांतरित किए बिना हेरफेर किया जा सकता है। यह नमूना धारकों बहुत सुविधाजनक बनाता है. केवल अन्य प्रणाली हम जानते हैं, जो क्रिस्टल के लिए इस अप्रत्यक्ष और कोमल उपयोग की अनुमति देता है, CrystalDirect प्रणाली26है. हालांकि, CrystalDirect कम लचीला है के बाद से विशेष 96 अच्छी तरह से क्रिस्टलीकरण प्लेटों का इस्तेमाल किया जाना है. पन्नी, जिस पर क्रिस्टल बढ़ रहे हैं, वही है जो क्रिस्टलीकरण प्रयोग को सील करता है और यह स्वयं को चंगा नहीं करता है। इसका मतलब यह है कि एक एपर्चर है कि ligand या क्रिस्टल के लिए क्रायो-सुरक्षित वितरण के लिए लेजर ablation द्वारा पन्नी में छेदा गया है खुला रहेगा, तरल वाष्पीकरण के लिए मौका बढ़ रही है. यह हमारे डिजाइन के विपरीत है, जहां क्रिस्टल सीधे पर्यावरण को उजागर नहीं किया जाएगा, भले ही सीओसी पन्नी कई बार छेदा जाता है।

परिवेश के तापमान पर स्थिति विवर्तन प्रयोगों के लिए उपयुक्तता। नमूना धारक एक सीधे आगे तरीके से क्रिस्टलीकरण प्लेट से हटाया जा सकता है, एक चुंबकीय आधार पर अटक गया और एक बीमलाइन गोनियोमीटर पर डाल दिया. कमरे के तापमान पर विवर्तन प्रयोग के लिए, नमूने को परिभाषित आर्द्रता33की वायु धारा में रखने की सलाह दी जाती है। क्रिस्टल के आसपास माँ शराब क्रम में पृष्ठभूमि प्रकीर्णन को कम करने के लिए goniometer पर नमूना धारक डालने से पहले हटाया जा सकता है. इस तरह के एक सेट अप घंटे के लिए स्थिर है.

100 K पर प्रचालन और भंडारण के लिए प्रयुक्त सामग्री की उपयुक्तता। न तो नमूना धारक के उत्पादन के लिए प्रयुक्त सामग्री और न ही पॉलीमिडफिल्म उन्हें कम तापमान34तक ठंडा करके प्रतिकूल रूप से प्रभावित होती है . इसलिए, कम तापमान पर नमूना धारक के साथ काम करना (उदा., 100 K) गंभीर समस्या नहीं पैदा करता है।

100 K पर सीटू विवर्तन प्रयोगों के लिए उपयुक्तता| एक नाइट्रोजन धारा में 100 K पर डेटा संग्रह के लिए, नमूना धारक पिछले पैरा ग्राफ में के रूप में क्रिस्टलीकरण प्लेट से हटादिया जा करने की जरूरत है, एक चुंबकीय आधार पर अटक गया और एक beamline goniometer पर 100 K पर एक गैसीय नाइट्रोजन धारा में डाल दिया. यदि वांछित, नमूना भी cryo-सुरक्षित हो सकता है, हालांकि यह संभावना है कि नग्न नमूनों के लिए यह ज्यादातर मामलों में आवश्यक नहीं हो सकताहै 31. 100 K पर प्रयोगों के लिए, नमूना धारकों प्रकार 2 और 3 बेहतर अनुकूल हैं क्योंकि बाहरी प्लास्टिक की अंगूठी हटाया जा सकता है. इसलिए, वे छोटे आकार के होते हैं और इसलिए टुकड़े करने के लिए कम प्रवण होना चाहिए। हालांकि, यहां तक कि प्रकार 1 का एक नमूना धारक इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रयोगात्मक हच में एक बहुत अधिक नमी और धारक के एक ठीक से गठबंधन क्रायो-प्रणाली टुकड़े को देखते हुए वास्तव में एक समस्या नहीं है।

सीमाएं. नमूना धारक की ज्यामिति 160 डिग्री की कुल रोटेशन रेंज पर रोटेशन विधि द्वारा unobstructed विवर्तन डेटा संग्रह की अनुमति देता है। यह पर्याप्त है ताकि अधिकांश क्रिस्टल प्रणालियों के लिए पूर्ण विवर्तन डेटा सेट प्राप्त किए जा सकें। मामलों में जहां यह संभव नहीं है, क्रिस्टल से अधिक से डेटा एक साथ विलय करने की आवश्यकता है। जब क्रिस्टल एक साथ बड़े हो रहे हैं, यह घटना एक्स-रे बीम के आकार को समायोजित करने के लिए इतना है कि व्यक्तिगत क्रिस्टल के केवल भागों को उजागर कर रहे हैं संभव हो सकता है। चरम मामलों में, एक MeshAndCollect दृष्टिकोण35के समान एक डेटा संग्रह रणनीति का सहारा लेने की आवश्यकता हो सकती है. सारांश में, जबकि वहाँ कुछ सीमाओं नमूना धारकों के साथ जुड़े रहे हैं, इन ज्यादातर मामलों में दूर किया जा सकता है. बेशक, यह हमेशा संभव है कि स्थितियों का सामना कर रहे हैं, जिसमें इस में से कोई भी संभव है. ऐसे मामलों में, एक अन्य क्रिस्टल बढ़ते तरीकों का सहारा लेने की आवश्यकता हो सकती है.

हमने स्थूल अणुक क्रिस्टलविज्ञान के लिए एक नवीन प्रकार के नमूना धारक का वर्णन किया है और हमने विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए नमूना धारकों की उपयुक्तता का प्रदर्शन किया है। प्रोटीन क्रिस्टल, साथ ही नमूना धारकों के अद्वितीय गुणों के सरल और reproduible हैंडलिंग को ध्यान में रखते हुए, हम इन नमूना धारकों मैक्रोआण्विक के लिए नमूना धारकों के शस्त्रागार के लिए एक मूल्यवान इसके अतिरिक्त साबित होगा कि विश्वास करते हैं क्रि.

Disclosures

रिपोर्ट नमूना धारक के बारे में पेटेंट आवेदन निम्नलिखित पंजीकरण संख्या और जर्मन पेटेंट और ट्रेडमार्क कार्यालय के साथ पंजीकरण की तारीख के साथ Helmholtz-जेन्ट्रम बर्लिन द्वारा दायर किया गया है: डे 10 2018 129 125.6, पंजीकरण की तारीख नवम्बर 20 वें, 2018; डे 10 2018 125 129.7,पंजीकरण की तारीख 11 अक्टूबर , 2018; डे 10 2017 129 761.8, पंजीकरण की तारीख दिसम्बर 13वें, 2017. पीसीटी मार्ग के माध्यम से एक बाद के अंतरराष्ट्रीय पेटेंट आवेदन, डे की प्राथमिकता का उपयोग कर 10 2017 129 761.8 दायर किया गया है, पीसीटी / संख्या DE 20 2018 106 955.1 के साथ एक उपयोगितामॉडल का पंजीकरण 6 दिसंबर, 2018 को दायर किया गया था। नमूना धारक को जेना बायोसाइंस, जेना, जर्मनी द्वारा व्यापार नाम XtalTool और XtalTool/HT के तहत वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध कराया गया है।

Acknowledgments

लेखकों BESY द्वितीय, बीम समय का उपयोग और समर्थन के लिए helmholtz-जेन्ट्रम बर्लिन द्वारा संचालित शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और नमूना पर्यावरण और तकनीकी डिजाइन के विभागों डिजाइन और निर्माण और 3 डी-प्रिंटर सुविधाओं के लिए उपयोग के साथ उनकी मदद के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AF Satetiss RS Components 101-5738 lint-free paper, multiple retailer
Cannula Dispomed Neoject 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 multiple retailer
COC foil HJ-Bioanalytik GmbH 900360
ComboPlate Greiner Bio-one / Jena Bioscience 662050 / CPL-131 pre-greased plate, multiple retailer
Cryo Vials Jena Bioscience CV-100
Eppendorf Research Plus  Eppendorf 3123000012 0.1 - 2.5 µL volume
Eppendorf Tubes Eppendorf 30125150 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number
Forceps Usbeck FisherScientific 10750313
GELoader Eppendorf Quality Eppendorf 30001222 extruded  tips (0.2 - 20 µL), manufacturer reference number
Magnetic CryoVials Molecular Dimension MD7-402
Microfuge Thermo ThermoFisher Scientific R21
Paper wicks dental2000 64460 Set of paper wicks, multiple retailer
Rotiprotect Nitril-eco  Carl Roth TC14.1 powder free, multiple retailer
SuperClear Plates Jena Bioscience CPL-132 pre-greased plate
UHU super glue UHU GmbH & Co KG 45545 manufacturer reference number, multiple retailer
VeroBlackPlus Alphacam OBJ-40963 manufacturer reference number
XtalTool  Jena Bioscience X-XT-101 sample holder set
XtalTool HT Jena Bioscience X-XT-103 / X-XT-104 SPINE compatible sample holder set
XtalToolBases Jena Bioscience X-XT-105 Magnetic sample holder bases set

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जैव रसायन अंक 149 नमूना धारक situ डेटा संग्रह में क्रायो संरक्षण ligand-सोकिंग क्रिस्टलीकरण मंच फांसी ड्रॉप स्वचालन SPINE मानक और मैक्रोआण्विक क्रिस्टलोग्राफी
न्यूनतम पृष्ठभूमि स्कैटिंग के साथ मैक्रोआण्विक एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए एक ऑल-इन-वन नमूना धारक
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Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, … More

Feiler, C. G., Wallacher, D., Weiss, M. S. An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59722, doi:10.3791/59722 (2019).

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