Summary
يتم تقديم حامل عينة جديد لبلورات الأشعة السينية الجزيئية مع بروتوكول التعامل المناسب. يسمح النظام بنمو البلورات، ونقع الكريستال وجمع بيانات الانعراج في الموقع في كل من درجة الحرارة المحيطة والمبردة دون الحاجة إلى أي تلاعب بالكريستال أو التركيب.
Abstract
البلورات الأشعة السينية الجزيئية (MX) هو الأسلوب الأكثر بروزا للحصول على عالية الدقة المعرفة ثلاثية الأبعاد من الجزيئات البيولوجية. ومن الشروط الأساسية لهذه الطريقة أن العينة البلورية ذات الترتيب العالي تحتاج إلى أن تزرع من الجزيئات الكبيرة التي يتعين دراستها، والتي تحتاج بعد ذلك إلى الاستعداد لتجربة الانعراج. هذا الإجراء إعداد ينطوي عادة على إزالة البلورة من الحل، الذي كان يزرع، نقع من الكريستال في محلول ليجاند أو محلول الحماية من البرد ومن ثم تجميد الكريستال على جبل مناسبة للتجربة. وهناك مشكلة خطيرة لهذا الإجراء هو أن البلورات الجزيئية الكلية غالبا ما تكون غير مستقرة ميكانيكيا وهشة إلى حد ما. وبالتالي، فإن التعامل مع مثل هذه البلورات الهشة يمكن أن يصبح بسهولة عنق الزجاجة في محاولة تحديد الهيكل. أي قوة ميكانيكية تطبق على مثل هذه البلورات الحساسة قد تخل التعبئة العادية للجزيئات، ويمكن أن يؤدي إلى فقدان قوة الانعراج من البلورات. هنا، نقدم رواية الكل في واحد حامل العينة، والتي تم تطويرها من أجل التقليل من خطوات التعامل مع بلورات وبالتالي لتحقيق أقصى قدر من معدل النجاح من تجربة تحديد هيكل. حامل العينة يدعم إعداد قطرات الكريستال عن طريق استبدال الزلاجات غطاء المجهر المستخدمة عادة. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح التلاعب في مكان الكريستال مثل نقع الليجان، والحماية من البرد وتشكيل معقدة دون أي فتح تجويف تبلور ودون التعامل مع الكريستال. وأخيراً، تم تصميم حامل العينة من أجل تمكين جمع بيانات الانعراج بالأشعة السينية في الموقع في كل من درجة الحرارة المحيطة والمبردة. وباستخدام حامل العينة هذا، فإن فرص إتلاف البلورة في طريقها من التبلور إلى جمع بيانات الانعراج تتقلص إلى حد كبير نظراً لأن التعامل المباشر مع الكريستال لم يعد مطلوباً.
Introduction
وتشكل معرفة البنية الثلاثية الأبعاد للجزيئات الجزيئات البيولوجية حجر الزاوية الهام في جميع البحوث البيولوجية والبيوكيميائية والطبية الحيوية الأساسية. وهذا يمتد حتى إلى جوانب ترجمة معينة من هذه البحوث، مثل اكتشاف المخدرات على سبيل المثال. من بين جميع الطرق للحصول على هذه المعلومات ثلاثية الأبعاد في البلورات الأشعة السينية القرار الذري هو أقوى وأبرز واحد كما يتضح من حقيقة أن 90٪ من جميع المعلومات الهيكلية المتاحة يتم المساهمة من خلال الأشعة السينية علم البلورات1. والشرط الأساسي الرئيسي لبلورة الأشعة السينية، وهو في الوقت نفسه قيدها الرئيسي، هو أنه يتعين إنتاج بلورات ذات نوعية الانعراج وإعدادها لتجربة الانعراج. ولا تزال هذه الخطوة تشكل أحد الاختناقات الرئيسية في الأسلوب.
تاريخيا، تم جمع بيانات الانعراج من بلورات البروتين في درجة الحرارة المحيطة. تم نقل بلورات الفردية بعناية في الشعيرات الدموية الزجاج أو الكوارتز قبل جمع البيانات، وأضيفت الأم الخمور إلى الشعيرات الدموية بحيث بلورات لن تجف ومختومة الشعيرات الدموية2،3، 4. ومنذ الثمانينات، أصبح من الواضح أكثر وأكثر أنه نظرا للخصائص المؤينة للإشعاع X والحساسية الإشعاعية الوشيكة للبلورات الجزيئية الكلية، فإن جمع البيانات في درجة الحرارة المحيطة يشكل قيودا شديدة على الطريقة. وبالتالي، تم تطوير نهج للتخفيف من آثار الأضرار الناجمة عن الإشعاع عن طريق تبريد البلورات الجزيئية الكلية إلى 100 K وجمع بيانات الانعراج في مثل هذه درجة الحرارة المنخفضة5و6. للعمل في درجات حرارة منخفضة، أصبح تركيب العينات في الشعيرات الدموية غير عملي بسبب انخفاض معدل نقل الحرارة. على الرغم من هذا، هناك جهود مستمرة لاستخدام الشعيرات الدموية أيضا، ولا سيما من التجارب التبلور مكافحة الانتشار، للعمل الانكسار منخفضة درجة الحرارة7،8، ولكن ، بغض النظر عن ذلك ، أصبح المعيار نهج في علم البلورات الجزيئية لجبل بلورات الجزيئات الكلية التي عقدت من قبل فيلم رقيقة من الخمور الأم داخل حلقة رقيقة السلكية9,10. على الرغم من أن عددا من التحسينات (على سبيل المثال، إدخال الحلقات الحجرية والهياكل المماثلة11)قد أدخلت مع مرور الوقت لهذا تصاعد حلقة على أساس، المبادئ الأساسية التي وضعت في أوائل التسعينات لا تزال قيد الاستخدام حتى اليوم. ويمكن القول بأمان أن معظم مجموعات بيانات الانعراج على بلورات الجزيئات الكلية في الوقت الحاضر لا تزال تعتمد على هذا النهج5.
وبمرور الوقت، كانت هناك بعض التطورات والتعديلات الجديدة المثيرة للاهتمام في طريقة التركيب القائمة على الحلقة، ولكن هذه النهج لم تعتمد حتى الآن على نطاق واسع في المجتمع. واحد هو ما يسمى حلقة أقل تصاعد من البلورات، والتي وضعت لتحقيق انخفاض الخلفية تشتت12،13،14. آخر واحد هو استخدام أغلفة الجرافين لالتفاف العينات البلورية وحمايتها من الجفاف. الجرافين هو مادة مناسبة جيدا في هذا الصدد بسبب انخفاض جدا الأشعة السينية تشتت الخلفية15.
في الآونة الأخيرة، ركزت التطورات في مجال يتصاعد عينة أساسا على توحيد يتصاعد بهدف زيادة الإنتاجية عينة16 أو على تصميم يتصاعد، والتي يمكن أن تعقد أكثر من عينةواحدة 17،مثل على سبيل المثال الأغشية المنقوشة على إطار السيليكون، والتي هي قادرة على عقد مئات من بلورات صغيرة في الغالب في مجال البلورات المسلسل18،19،20،21،22.
جميع وسائل تركيب العينة التي نوقشت حتى الآن لا تزال تتطلب درجة ما من التدخل اليدوي، مما يعني أن هناك خطرا متأصلا من التسبب في أضرار ميكانيكية للعينة. ولذلك، يجري البحث عن نُهج جديدة عن طريق هندسة بيئة العينة بحيث يمكن جمع بيانات الانعراج عن البلورات داخل بيئة نموها. ويسمى أحد هذه الطرق في الموقع أو لوحة الفرز23،24 ويتم تنفيذه بالفعل في عدد من البلورات الجزيئية في مختلف المصادر سينكروترون في جميع أنحاء العالم25. ومع ذلك، فإن استخدام هذه الطريقة محدود بالمعلمات الهندسية للوحة الكريستال والمساحة المتاحة حول نقطة العينة من الصك.
بعد نهج آخر يتحقق في ما يسمى نظام كريستال دايركت26. هنا، يتم حصاد قطرات التبلور بالكامل تلقائيا. رقائق التي تم زرع البلورات هي مخصصة قطع باستخدام الليزر وتستخدم مباشرة كما حامل العينة27.
في العمل الموصوف هنا، كان الهدف هو تطوير حامل العينة، والتي من شأنها أن تسمح للمستخدم لنقل العينة البلورية من غرفة نموها إلى جهاز جمع البيانات دون لمسها والتي من شأنها أن تمكن المستخدم من التعامل مع العينة بسهولة. منذ العديد من الباحثين في مجال علم البلورات الجزيئية لا تزال تستخدم شكل تبلور 24 جيدا لتحسين نمو الكريستال عن طريق تعديل الظروف المحددة في حملات الفحص الكبيرة، تم تصميم حامل العينة الجديدة لتكون متوافق مع هذا التنسيق. وفي ما يلي، سيُوصف تصميم حامل العينة الجديد، كما سيبين عن طريقة التعامل مع حامل العينة وأدائه لجمع البيانات في الموقع ونقع الليجان. وأخيراً، سيتم مناقشة مدى ملاءمة حامل العينة الجديد هذا، فضلاً عن القيود التي يفرضها على مختلف خطوات العمل.
Protocol
تحذير: بالنسبة لجميع الأعمال اللاحقة، من المهم جداً أن رقائق بوليميد ذات اللون الأصفر يجب ألا يتم لمسها بأصابع غير محمية، بسبب التلوث المحتمل لحامل العينة. أيضا، ينصح بشدة استخدام الملقط المحمية.
1. حامل العينة
- استخدم أحد الأنواع الثلاثة لحامل العينة.
ملاحظة: يتم عرض ثلاثة إصدارات مختلفة من حامل العينة المطورة الجديدة في الشكل 1. كل منهم يحتوي على هيكل الدعم من البلاستيك الأسود، ورقائق COC محكم في الخارج ورقائق بوليميد منظم ميكرويوريس في الداخل. النوع 1 (الشكل1A)يحتوي على حلقة بلاستيكية خارجية ثابتة، بينما بالنسبة للأنواع 2 و3 (الشكل1B،1C)يمكن قطع الحلقة الخارجية ميكانيكيا ً عند نقاط التوقف المخصصة للاستخدام في أنظمة نقل العينات الآلية (انظر الأحمر الأسهم في الشكل 1B). تصميم أصحاب العينة يسمح الإعداد من قطرات تبلور متعددة على احباط بوليميد الأصفر. وهو لا يعرض للخطر رصد تجربة التبلور، حيث أن المادة شفافة للغاية بالنسبة للضوء المرئي. كما يتميز رقائق بوليميد السميكة التي تبلغ 21 ميكرومتر بـ 5 ميكروم المسام، مما يسمح بمعالجة الكريستال البسيط عن طريق النقع في وقت لاحق. وبما أن انتقال الأشعة السينية يقترب من 1.0 في جميع طاقات جمع بيانات الانعراج المستخدمة في البلورات الجزيئية الكلية، فإن مساهمة الرقاقة في تشتت الخلفية في تجربة الانعراج لا تذكر28.
2. إعداد قطرات بلورة
- قم بإنشاء سطح نظيف وخالي من الغبار باستخدام قطعة قماش رطبة خالية من الوبر. خذ حامل عينة واحدة من صندوقه ووضعها بلطف، احباط الصفراء التي تواجه، على سطح تنظيفها لتجنب الضرر أو ثقب غير مرغوب فيه من احباط COC المؤخر.
- إعداد قطرات التبلور مع الحد الأقصى من حجم الموصى بها من 2 μL على احباط الأصفر كما سيتم القيام به على الشرائح الغطاء المستخدمة عادة. ضع قطرات بلطف لتجنب أي تمزق أو ثقب من احباط باستخدام ماصة. على حامل عينة من النوع 1 (الشكل2A)يمكن وضع ما يصل إلى ثلاث قطرات، في حين أن على حاملي العينة من النوع 2 و 3 اثنين من قطرات هي الحد الأقصى الموصى به (الشكل2C).
- الوجه حامل العينة أكثر ووضعها على تجويف مدهون مسبقا من لوحة نمط لينبرو 24 جيدا. استخدام المعينات تحديد المواقع (انظر السهام الحمراء في الشكل 1A)من حامل العينة لتوجيهه إلى موقعه الأمثل.
- ضمان الوضع الصحيح لصاحب العينة من أجل تجنب التبخر غير المرغوب فيها (الشكل2A).
3. رصد نمو الكريستال
- عن طريق وضع لوحة تبلور تحت المجهر الضوئي انتقال، مع أو بدون المستقطبات، ورصد نمو الكريستال دون أي اضطراب من التجربة (الشكل4).
- عند استخدام أصغر 18 ملم حامل عينة من نوع 3 (الشكل1C)،والتي تم تصميمها للاستخدام على لوحات البصمة SBS، واستخدام الروبوت التصوير قادرة على التعامل مع لوحات SBS البصمة لرصد نمو الكريستال بطريقة أكثر الآلي.
4. التلاعب الكريستال
ملاحظة: من المستحسن تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة تحت المجهر الضوئي انتقال.
-
الحماية من البرد
- اخترق بلطف احباط COC الخارجي باستخدام قنية غرامة. تأكد من أن احباط الأصفر الداخلي لا يزال لم يمسها. يجب أن يكون ثقب الحق بجوار قطرة التي هي أن يتم التلاعب (الشكل 3A,3C).
- استخدام الفتيل ورقة غرامة وإدراجه في حفرة مطعون. دفع بعناية الفتيل إلى الأمام حتى يمس احباط بوليميد الأصفر. إبقاء الفتيل في اتصال مع احباط مثقبة. الفتيل سوف تمتص بعيدا كل حل الزائدة. الوقت اللازم لإزالة السائل الكامل يعتمد على لزوجة الحلول وتكوين الخمور الأم (الشكل3B).
- بعد أن يتم امتصاص كل السائل بعيدا، تراجع بلطف الفتيل ورقة. تذكر موقف من قطرة، لأنه قد لا تكون مرئية بعد إزالة الخمور الأم.
- خذ ماصة قياسية لتطبيق حجم صغير من محلول الحماية بالتبريد، كحد أقصى. 3 ميكرولتر، باستخدام طرف مقذوف (على سبيل المثال، تلميح تحميل هلام) من خلال نفس الحفرة. مرة واحدة يتم الاستغناء عن السائل، تراجع غيض. المسامية من احباط الصفراء يسمح لانتشار عبر احباط. الوقت لتحقيق حماية كريو من بلورات الخاص يعتمد إلى حد كبير على الحل المستخدمة ومكوناته.
- لإعادة ختم احباط COC الشفاء الذاتي، وضع بلطف إصبع محمي على الحفرة لحوالي 1 ق وحركه عبر ثقب. الضغط الطفيف في تركيبة مع ارتفاع درجة الحرارة سوف تعزز إعادة ختم الثقوب، والتي ليست كبيرة جدا.
-
اللّغة
ملاحظة: قد يتم إزالة الخمور الأم الزائدة قبل نقع ليغو. للقيام بذلك، اتبع الخطوات الموضحة في 4.1.1 إلى 4.1.3.- حل الليجان في الخمور الأم في التركيز المطلوب في أنبوب رد فعل.
- تدور الحل لمدة 10 دقائق في 12،000 س ز من أجل إزالة الجسيمات غير القابلة للذوبان. استخدام جهاز طرد مركزي يتم التحكم في درجة حرارته إذا لزم الأمر.
- ضع حجمًا كبيرًا برفق. 3 μL من ليجان التي تحتوي على حل في الفجوة بين رقائق COC والفيلم polyimide باستخدام طويلة، تلميح الأنابيب مقذوف. سحب الطرف.
- لإعادة ختم احباط COC الشفاء الذاتي، وضع بلطف إصبع محمي على الحفرة لحوالي 1 ق وحركه عبر ثقب (انظر أيضا 4.1.5).
- احتضان التجربة لبعض الوقت من أجل السماح للانتشار عبر الغشاء. الوقت النقع يعتمد إلى حد كبير على لزوجة الحل المنفّع ومكوناته29.
- كرر الخطوات من 4.2.1 إلى 4.2.5 عدة مرات لنقع لاحقاً مختلف الليجان.
5- جمع بيانات الانعراج الموضعي عند درجة الحرارة المحيطة
ملاحظة: من أجل تقليل تشتت المذيبات، قم بإزالة الحل الزائد قبل جمع البيانات.
- ضمان الرطوبة مستقرة التي تسيطر عليها beamlineالبيئة مع الشروط المستقرة 30.
- رفع بلطف رقائق COC شفافة في نقطة معينة باستخدام ملقط وقشر تشغيله مثل واحد من شأنه إزالة الغطاء من كوب اللبن ( الشكل 6B).
- رفع بلطف حامل العينة من تجويفها وإدراجه فورا في قاعدة حامل العينة المغناطيسية المعدة مسبقا. لا الغراء هو ضروري لهذه الخطوة (الشكل 6B).
- تطبيق ضغط لطيف لضمان تحديد المواقع الصحيح من حامل العينة داخل القاعدة.
- قم بتركيب حامل العينة على مقياس الشعاع والتأكد من تحديد موضع الحامل بشكل صحيح. اعتمادا على هندسة مقياس الغوناليمكن تدوير حامل العينة بنسبة تصل إلى 160 درجة دون التسبب في أي التظليل أثناء تجربة الانعراج.
- استخدام الفتيل ورقة وتلمس بلطف احباط بوليميد الأصفر من المؤخر لإزالة الخمور الأم الزائدة. يرجى ملاحظة أنه في تلك المرحلة يمكن تنفيذ النقع أو الحماية من البرد فقط. العينة جاهزة الآن لتجميع البيانات والانعراج.
- عند استخدام حامل عينة مع حلقة خارجية قابلة للإزالة، وتطبيق ضغط لطيف من خلال عقد على الحلبة الخارجية وكسر تشغيله في نقاط كسر معينة (الشكل 6C). العينة جاهزة الآن لتجميع البيانات والانعراج.
6- جمع بيانات الانعراج الموضعي عند درجة حرارة التبريد
ملاحظة: من المستحسن إزالة الخمور الأم المتبقية من العينة عن طريق تنفيذ الخطوات 4.1.1. 4-1-3. قبل الاستمرار في الخطوات التالية لتقليل تشتت المذيبات. يمكن نقل معظم العينات إلى النيتروجين السائل دون الحماية بالتبريد قبل31. إذا كانت هناك حاجة إلى الحماية من البرد، راجع الخطوات 4.1.1. ةيلاب ةيلاب ةيلاب ةيلابةةةةةبة
- رفع بلطف احباط COC في نقطة معينة باستخدام ملقط وقشر تشغيله (انظر الخطوة 5.1.2) (الشكل6A).
- خذ حامل العينة قبالة تجويف وتركيبه على قاعدة حامل عينة المغناطيسي. ويمكن تطبيق ضغط لطيف من أجل ضمان المناسب الصحيح وضيق (انظر الخطوة 5.1.5، الشكل 6B).
ملاحظة: نقاط فاصل مرتبة بشكل متناظر تسمح لإزالة بسيطة من الحلقة الخارجية من حامل العينة عن طريق تطبيق ضغط لطيف (انظر الخطوة 5.1.8., الشكل 6C). الآن، حامل العينة على استعداد ويمكن أن تغرق في النيتروجين السائل. الهندسة من نوع حامل العينة 2 و 3 (الشكل1B،1C) يسمح نقلهم إلى قوارير عينة العمود الفقري القياسية ، والتي يمكن استخدامها لالروبوت عينة متزايدة ساعد (الشكل 6D).
Representative Results
وقد تم تصميم نوع حامل العينة 1 بحيث يناسب على بئر من لوحة نمط لينبرو 24 جيدا. كل حامل عينة الفردية يحتوي على المعينات تحديد المواقع على جانبي الحافة الخارجية من أجل ضمان تحديد المواقع الأمثل على حافة البئر (الشكل1A، الشكل 2A). يمكن وضع ما يصل إلى ثلاث قطرات التبلور الفردية من أقصى حجم 2 μL كل على احباط بوليميد الأصفر (الشكل2B). بالنسبة لحاملي العينات من النوعين 2 و3، يُنصح بتعيين حد أقصى قدره قطرتين من أقصى حجم 2 ميكرولتر لكل منهما. يمكن تركيب 24 حامل عينة على واحد 24-well Linbro لوحة (الشكل3D).
تم إعداد تجربة تبلور على لوحة Linbro 24 بئر باستخدام حامل عينة من النوع 1. 1 μL من الدجاجة البيض الأبيض محلول lysozyme (15 ملغ / مل) كان مختلطا مع 1 μL من الأم الخمور التي تتألف من 50 مللي M NaAc pH 4.7، 500 mM NaCl و 25٪ (ث / الخامس) PEG-6000 على رقائق بوليميد الصفراء على حامل العينة (الجدول1). وقد تم الإسقاط في 293 K مقابل 500 μL من الأم الخمور وبلورات من حجم 40-50 ميكرومتر لوحظ بعد 5 ساعات (الشكل 4). ويمكن ملاحظة نمو الكريستال باستخدام المجهرالضوئي انتقال (الشكل 4) مع أو بدون المستقطب. تضمن أفلام الشفافية العالية أفضل مراقبة ورصد لظروف نمو الكريستال باستخدام كليهما، مجهر ضوئي تقليدي أو نظام تصوير كريستالي آلي. لم يتم اختبار مراقبة نمو الكريستال باستخدام الأشعة فوق البنفسجية الأشعة فوق البنفسجية.
بعد إزالة الخمور الأم من حول البلورات، تم أخذ حامل عينة مع الدجاجة البيض الأبيض بلورات lysozyme من لوحة تبلور ووضعها في مجرى الهواء التي تسيطر عليها الرطوبة على HZB-MX beamline 14.332. جمعت بيانات الانعراج عند درجة حرارة المحيط بزيادات 1 درجة باستخدام شعاع 150 ميكرومتر في طاقة 13.8 كيلو فولت مع 4 x 1010 فوتونات/ثانية ووقت التعرض 5 ثانية لكل صورة. تظهر صورة نموذجية للانعراج في الشكل 5. لا يمكن الكشف عن تشتت الخلفية مرتفعة على صورة الانعراج. وترد في الجدول 2تفاصيل تجريبية أخرى فضلا عن إحصاءات معالجة البيانات المرتبطة بها.
الشكل 1 : عرض تخطيطي لمالكي العيناتالجدد. تتكون حاملو العينة من دعم بلاستيكي أسود، يتم تغطيته على الجانب الخارجي بورق رقائقي من البوليمر اتويل الأوليفين (COC) غير متبلور. هذا احباط (اللون باللون الأزرق) هو شفافة للغاية والشفاء الذاتي. كما أنه يضمن ضيق الغاز من التجربة. احباط الداخلية (الملونة باللون الأصفر) مصنوعة من بوليميد الحيوي الخامل، والتي هي شفافة للغاية للأشعة السينية. على هذا احباط، يمكن وضع قطرات تبلور. الحافة الخارجية لحامل العينة تحتوي على اثنين من المعينات تحديد المواقع المشار إليها من قبل السهم الأحمر (لوحة A)، والذي يسمح وضع دقيق من حامل العينة على التجويف الفردية قبل مدهون من لوحة تبلور. (أ) حامل العينة (نوع 1) مع قطر 22 مم مع حلقة دعم خارجي ثابت. (B) حامل العينة (نوع 2) مع قطر 22 ملم مع حلقة دعم خارجي قابل للإزالة. (C) حامل العينة (نوع 3) مع قطر 18 ملم مع حلقة دعم خارجي قابل للإزالة. وقد تم تطوير الأخيرين لاستخدامها بطريقة عالية الإنتاجية مع عينة الآلي تصاعد الروبوتات باستخدام معيار SPINE. يتم تمييز نقاط التوقف المحددة من خلال الأسهم الحمراء في اللوحة B. يشير السهم الأسود في اللوحة C إلى علامة تحديد المواقع. الدبابيس جاحظ في محيط الخارجي من احباط الصفراء ضرورية لمحاذاة احباط polyimide خلال عملية الإنتاج. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : يمكن استخدام حامل العينة على لوحة Linbro 24-well بنفس الطريقة التي ينزلق بها غطاء المجهر المستخدم ة. إنه يغلق التجويف محكم الهواء تحديد المواقع الإيدز ضمان تحديد المواقع الصحيح من حامل العينة على تجويف (الأسهم الحمراء في لوحة A). ويمكن وضع ما يصل إلى ثلاث قطرات فردية على حامل عينة من النوع 1 (اللوحة B)، في حين أن الحد الأقصى الموصى به لعدد قطرات وضعت على حامل عينة من النوع 2 أو 3 هو اثنين. الحد الأقصى لحجم الموصى به لكل قطرة 2 μL. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 : 24 نوع 1 أصحاب العينة تناسب على لوحة 24 جيدا. يمكن وضع أصحاب العينة في اتجاهين على لوحة 24-well كما هو مشار إليه (لوحة D). ويستخدم قنية لاختراق احباط COC الظهر من أجل إزالة الخمور الزائدة من قطرة تبلور (لوحات A و C)باستخدام الفتيل ورقة إدراجها بلطف في نفس الحفرة (لوحة B). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : صورة لبلورات الدجاجة البيض الليسوزيم الأبيض لوحظ من خلال المجهر انتقال مجهزة الاستقطاب. يتم تمييز بلورات الفردية بسهولة من محلول البروتين المعجل. البلورات في هذه الصورة هي من متوسط حجم 40 μm X 50 ميكروم.
الشكل 5 صورة نموذجية لإنعراج الأشعة السينية لبلورة ليسوزيم تزرع على حامل العينة. قبل التعرض للأشعة السينية تم إزالة جميع الخمور الأم الزائدة من جميع أنحاء البلورة. تم جمع بيانات الانعراج عند درجة الحرارة المحيطة على BL14.3 في حلقة تخزين الإلكترون BESSY II32 باستخدام بيئة عينات الرطوبة التي تسيطر عليها مع الرطوبة النسبية بنسبة 97.5%. لا يمكن ملاحظة خلفية مرتفعة بسبب أصحاب العينة. تشير الخطوط المتقطعة في الصورة إلى حلقات الدقة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6 : وحامل العينة جاهز لجمع بيانات الانعراج. أولا، يتم رفع الفيلم COC بلطف باستخدام ملقط ومن ثم مقشر قبالة (لوحة A). وبعد ذلك، تتم إزالة حامل العينة من التجويف وإدخاله في الفتحة المركزية للقاعدة المغناطيسية حتى يتم الإشارة إليها بواسطة العلامة (اللوحة B). من خلال التمسك بالجزء المركزي، يتم تطبيق ضغط لطيف على الحلقة الخارجية لتحرير الجزء المركزي باستخدام نقاط استراحة مرتبة مرتبة بشكل متناظر (لوحة C). بعد الإزالة، يمكن أن يغرق حامل العينة في النيتروجين السائل ونقلها إلى قوارير SPINE القياسية. وضعت، على سبيل المثال، في عفريت أنها يمكن نقلها إلى مواقع سينكروترون حيث الآلي الروبوتات عينة تصاعد الاعتراف بها كعينات العادية (لوحة D). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تفاصيل التبلور | |
| الاسلوب | تعليق قطرة، بخار انتشار طريقة |
| نوع اللوحة | لوحات فائقة الوضوح |
| درجة الحرارة (K) | 293 |
| تركيز البروتين (ملغ مل-1) | 15 |
| تركيب محلول الخزان | 50 m NaAc pH 4.7, 500 mM NaCl, 25% (w/v) PEG-6000 |
| حجم ونسبة الانخفاض | 2 [ل] إجماليّة, 1:1 نسبة (بروتين: أم كحول |
| حجم الخزان | 500 ميكرولتر |
| حضانة وقت | 12 ساعة |
الجدول 1: تفاصيل تجريبية لتجربة البلورة الموصوفة.
| جمع البيانات ومعالجتها | |
| الطول الموجي (Å) | 0.89429 |
| درجة الحرارة (K) | 293 |
| كاشف | اتفاقية مكافحة التصحر MX225 |
| الكريستال-- كاشف المسافة (مم) | 120 |
| نطاق الدوران لكل صورة (درجة) | 0.5 |
| إجمالي نطاق التناوب (درجة) | 120 |
| وقت التعرض لكل صورة (صور) | 5 |
| مجموعة الفضاء | ف-4 3212 2 |
| معلمات خلية الوحدة (Å) | (أ) = 79.01، ب = 79.01، ج = 37.95 |
| الموساسيتي (°) | 0.07 |
| نطاق الدقة (Å) | 39.50 - 1.35 (1.37 - 1.35) |
| مجموع عدد الأفكار | 191940 (8932) |
| عدد التأملات الفريدة | 27020 (1292) |
| الاكتمال (%) | 99.88 (99.20) |
| تعدد | 7.1 (6.9) |
| يعني I / σ (I) | 15.0 (1.9) |
| Rmeas35 (%) | 6.3 (107.0) |
| Rpim36 (%) | 2.4 (40.4) |
| CC1/237 | 99.9 (68.5) |
| ISa38 | 16-1 |
| ويلسون [ب-فكتور] (Å2) | 17.0 |
الجدول 2: جمع بيانات الإنعراج ومعالجة الإحصاءات.
Discussion
ملاءمة لتجارب التبلور. ويمكن استخدام حاملي العينات الجديدة لتجارب تبلور الإسقاط المعلقة القياسية باستخدام لوحات من نوع Linbro ذات 24 بئراً (النوعان 1 و2)، أو لوحات البصمة SBS ذات الـ 24 بئراً التي يبلغ قطر كل بئر فيها 18 مم (النوع 3). ويمكن استخدامها بدلا من المجهر القياسية تغطية زلات. احباط COC غير متبلور يضمن التهوية من النظام. رصد تجربة تبلور ممكن باستخدام المجهر الضوئي انتقال، وذلك بسبب استخدام رقائق عالية الوضوح. على حد علمنا، لا يوجد أصحاب عينات أخرى للوحات تبلور 24 جيدا، والتي من شأنها أن تسمح التلاعب الكريستال أو التجارب الانعراج، دون إزالة ميكانيكيا الكريستال من قطرة، التي تزرع. هذا هو من أهمية خاصة، لأن العديد من الباحثين في هذا المجال لا تزال تعتمد على لوحات مثل التحسين الكريستال، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن كميات أكبر قطرة يمكن استخدامها بالمقارنة مع 96 جيدا لوحات الجلوس قطرة. مع هذه الكميات قطرة أكبر، يمكن الحصول على بلورات أكبر.
ملاءمة للتلاعبالكريستال. نظرا لخصائص الشفاء الذاتي من احباط COC الخارجي وهيكل ميكرومبوريس من احباط بوليميد الأصفر الداخلي، يمكن الوصول إلى بيئة الكريستال والبلورات يمكن التلاعب بها دون نقلها ميكانيكيا إلى حاويات أخرى. وهذا يجعل أصحاب العينة مريحة للغاية. النظام الوحيد الآخر الذي نعرفه، والذي يسمح لهذا الوصول غير المباشر واللطيف إلى الكريستال، هو نظام CrystalDirect26. ومع ذلك، CrystalDirect أقل مرونة منذ لوحات التبلور الخاصة 96 جيدا يجب أن تستخدم. احباط، والتي تنمو البلورات، هو نفسه أن الأختام تجربة تبلور وأنها ليست الشفاء الذاتي. وهذا يعني أن الفتحة التي تم اختراقها في احباط عن طريق الاستئصال بالليزر لligand أو تسليم المبردة للحماية إلى بلورات ستبقى مفتوحة، مما يزيد من فرصة لتبخر السائل. هذا هو على النقيض من تصميمنا، حيث بلورات لن تتعرض مباشرة للبيئة حتى لو يحصل مثقوب احباط COC عدة مرات.
ملاءمة تجارب الانعراج في الموقع عند درجة الحرارة المحيطة. يمكن إزالة حامل العينة من لوحة التبلور بطريقة مستقيمة إلى الأمام، عالقة على قاعدة مغناطيسية ووضعها على مقياس الشعاع. لتجربة الانعراج في درجة حرارة الغرفة، فمن المستحسن وضع العينة في تيار الهواء من الرطوبة المحددة33. ويمكن إزالة الخمور الأم حول الكريستال قبل وضع حامل العينة على مقياس الغونية من أجل الحد من تشتت الخلفية. هذا الإعداد مستقر لساعات.
ملاءمة المواد المستخدمة للتشغيل والتخزين في 100ك. لا المواد المستخدمة لإنتاج حامل العينة ولا فيلم polyimide تتأثر سلبا عن طريق تبريد هالهم وصولا الى درجات حرارة منخفضة34. ومن ثم، فإن العمل مع حامل العينة في درجة حرارة منخفضة (على سبيل المثال، 100 ك) لا يشكل مشكلة خطيرة.
ملاءمة تجارب الانعراج في الموقع في 100 ك. لجمع البيانات في 100 K في تيار النيتروجين، حامل العينة يحتاج إلى إزالتها من لوحة تبلور كما هو الحال في الفقرة السابقة، عالقة على قاعدة مغناطيسية ووضعها في تيار النيتروجين الغازية في 100 K على مقياس غونيميتر شعاعي. إذا رغبت في ذلك، يمكن أيضا أن تكون محمية بالتبريد العينة، على الرغم من أنه من المرجح أن عينات عارية هذا قد لا يكون ضروريا في معظم الحالات31. وبالنسبة للتجارب التي تجري عند 100 ألف، فإن حاملي العينات من النوعين 2 و3 أكثر ملاءمة لأن الحلقة البلاستيكية الخارجية يمكن إزالتها. وبالتالي، فهي أصغر حجما، وبالتالي ينبغي أن تكون أقل عرضة للجليد. ومع ذلك، يمكن استخدام حتى حامل عينة من النوع 1. نظرا للرطوبة ليست عالية جدا في القفص التجريبية ومحاذاة بشكل صحيح نظام التبريد الجليد حتى من حامل ليست حقا مشكلة.
القيود. تسمح هندسة حامل العينة بجمع بيانات الانعراج دون عائق من خلال طريقة التناوب على نطاق دوران إجمالي يبلغ 160 درجة. وهذا يكفي بحيث يمكن الحصول على مجموعات بيانات الانعراج المكتمللمعظم الأنظمة البلورية. في الحالات التي لا يكون ذلك ممكناً، يجب دمج البيانات من أكثر من الكريستال معاً. عندما تزرع بلورات معا، قد يكون من الممكن لضبط حجم شعاع الأشعة السينية الحادث بحيث يتم الكشف عن أجزاء فقط من بلورات الفردية. وفي الحالات القصوى، قد يحتاج المرء إلى اللجوء إلى استراتيجية لجمع البيانات مماثلة لنهج MeshAndCollect35. وباختصار، في حين أن هناك بعض القيود المرتبطة بحاملي العينات، يمكن التغلب عليها في معظم الحالات. وبطبيعة الحال، فمن الممكن دائما أن تواجه حالات، والتي لا شيء من هذا ممكن. في مثل هذه الحالات، قد يحتاج المرء إلى اللجوء إلى طرق أخرى تصاعد الكريستال.
لقد وصفنا نوع جديد من حامل العينة للبلورات الجزيئية الكلية وأظهرنا مدى ملاءمة حاملي العينات لمختلف التطبيقات. مع الأخذ بعين الاعتبار التعامل مع بلورات البروتين بسيطة وقابلة للتكرار، فضلا عن الخصائص الفريدة لأصحاب العينة، ونحن نعتقد أن هذه العينات أصحاب سوف يثبت أن تكون إضافة قيمة إلى ترسانة من أصحاب العينة لmacromolecular البلورات.
Disclosures
وقد أودعت هيلمولتز- زينتروم برلين طلبات البراءات المتعلقة بحامل العينة المبلغ عنها مع أرقام التسجيل وتواريخ التسجيل التالية لدى المكتب الألماني للبراءات والعلامات التجارية: DE 10 2018 129 125.6، تاريخ التسجيل في 20 نوفمبر ال,2018; DE 10 2018 125 129.7، تاريخ التسجيل 11 أكتوبرth, 2018؛ DE 10 2017 129 761.8، تاريخ التسجيل 13 ديسمبرth، 2017. وتم إيداع طلب دولي لاحق للبراءات عبر مسار معاهدة التعاون بشأن البراءات، باستخدام أولوية DE 10 2017 129 761.8، PCT/DE2018/101007. تم تسجيل نموذج فائدة رقم DE 20 2018 106 955.1في 6 ديسمبر 2018. وقد تم توفير حامل العينة تجاريا تحت الاسمين التجاريين XtalTool و XtalTool/HT من قبل جينا العلوم البيولوجية، جينا، ألمانيا.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا BESSY II، التي تديرها هيلمولتز-زينتروم برلين على الوصول إلى وقت الشعاع والدعم، وإدارات بيئة العينة والتصميم التقني لمساعدتها في التصميم والبناء والوصول إلى مرافق الطابعة ثلاثية الأبعاد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AF Satetiss | RS Components | 101-5738 | lint-free paper, multiple retailer |
| Cannula | Dispomed Neoject | 25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026 | multiple retailer |
| COC foil | HJ-Bioanalytik GmbH | 900360 | |
| ComboPlate | Greiner Bio-one / Jena Bioscience | 662050 / CPL-131 | pre-greased plate, multiple retailer |
| Cryo Vials | Jena Bioscience | CV-100 | |
| Eppendorf Research Plus | Eppendorf | 3123000012 | 0.1 - 2.5 µL volume |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30125150 | 1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality, manufacturer reference number |
| Forceps Usbeck | FisherScientific | 10750313 | |
| GELoader Eppendorf Quality | Eppendorf | 30001222 | extruded tips (0.2 - 20 µL), manufacturer reference number |
| Magnetic CryoVials | Molecular Dimension | MD7-402 | |
| Microfuge Thermo | ThermoFisher Scientific | R21 | |
| Paper wicks | dental2000 | 64460 | Set of paper wicks, multiple retailer |
| Rotiprotect Nitril-eco | Carl Roth | TC14.1 | powder free, multiple retailer |
| SuperClear Plates | Jena Bioscience | CPL-132 | pre-greased plate |
| UHU super glue | UHU GmbH & Co KG | 45545 | manufacturer reference number, multiple retailer |
| VeroBlackPlus | Alphacam | OBJ-40963 | manufacturer reference number |
| XtalTool | Jena Bioscience | X-XT-101 | sample holder set |
| XtalTool HT | Jena Bioscience | X-XT-103 / X-XT-104 | SPINE compatible sample holder set |
| XtalToolBases | Jena Bioscience | X-XT-105 | Magnetic sample holder bases set |
References
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Mac Sweeney, A., D'Arcy, A. A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature. Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).
- Kalinin, Y., et al. A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography. Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).
- Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).
- Pflugrath, J. W. Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures. Methods. 34 (3), 415-423 (2004).
- Garman, E. F., Schneider, T. R. Macromolecular Cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).
- Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).
- Martínez-Rodríguez, S., et al. Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).
- Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
- Teng, T. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
- Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O'Neill, K., Gillilan, R. Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography. Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).
- Jian-Xun, Q., Fan, J. An improved loopless mounting method for cryocrystallography. Chinese Physics B. 19 (1), 010601 (2010).
- Kitatani, T., et al. New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material. Applied Physics Express. 1 (3), 037002 (2008).
- Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).
- Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter. Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).
- Parkin, S., Hope, H. Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals. Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).
- Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5, 10451 (2015).
- Roedig, P., et al. Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).
- Zarrine-Afsar, A., et al. Crystallography on a chip. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).
- Mueller, C., et al. Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography. Structural Dynamics. 2 (5), 054302 (2015).
- Feld, G. K., et al. Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography. Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).
- le Maire, A., et al. In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).
- Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).
- Aller, P., et al. Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).
- Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
- Antimonov, M., et al. Large-area Kapton x-ray windows. Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F (2015).
- McPherson, A. Penetration of dyes into protein crystals. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).
- Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. Raoult's law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments. Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).
- Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary? Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).
- Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141 (2015).
- Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
- Yano, O., Yamaoka, H. Cryogenic properties of polymers. Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).
