Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Experimentele analyse van apoptotic Thymocyte overspoeling door macrofagen

doi: 10.3791/59731 Published: May 24, 2019

Summary

Hier presenteren we een protocol voor te bereiden apoptotic thymocyten en buikvlies macrofagen en analyseren van de efficiëntie van efferocytosis en de specifieke remmer-gemedieerde blokkering van apoptotic thymocyten overspoeling. Dit protocol heeft een brede toepassing in cel-gemedieerde ontruiming van andere deeltjes met inbegrip van kunstmatige kralen en bacteriën.

Abstract

De cel apoptosis is een natuurlijk proces en speelt een kritieke rol in embryonale ontwikkeling, homeostatische regelgeving, immune tolerantie inductie, en resolutie van ontsteking. Accumulatie van apoptotic puin in het lichaam kan leiden tot chronische inflammatoire reacties die leiden tot systemische auto-immuunziekten in de tijd. Verminderde apoptotic cel klaring is betrokken bij een verscheidenheid van auto-immuunziekten. Apoptotic klaring is een complex proces zelden ontdekt onder fysiologische omstandigheden. Het gaat om overvloedig oppervlak receptoren en signalering moleculen. Het bestuderen van het proces van apoptotic cel ontruiming biedt inzichtelijke moleculaire mechanismen en de daaropvolgende biologische reacties, die kunnen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Hier beschrijven we protocollen voor de inductie van apoptotic thymocyten, de voorbereiding van het buikvlies macrofagen, en de analyse van apoptotic cel ontruiming doorstroming Cytometry en microscopie. Alle cellen zullen apoptose ondergaan in een bepaald stadium, en veel residentiële en circulerende cellen kunnen opname apoptotic puin. Daarom, het protocol hier beschreven kan worden gebruikt in vele toepassingen te karakteriseren apoptotic cel binding en inname door vele andere soorten cellen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ons lichaam genereert 1-10 miljard apoptotic cellen op een dagelijkse basis. Zulk een groot aantal apoptotic cellen moet op een bepaalde manier worden ontruimd dat de immune reacties rustig blijven. Om de goedkeuring van apoptotic cellen tijdig te verzekeren, ontwikkelen talrijke types van weefsel ingezetene cellen en circulerende cellen mechanismen om apoptotic cellen over te spoelen1. Disfunctionele regulering van apoptosis is betrokken bij het begin en de progressie van verschillende inflammatoire aandoeningen en autoimmuniteit2. Apoptosis speelt ook een kritieke rol in de pathogenese van kankerontwikkeling en zijn verdere weerstand tegen conventionele behandelingen3,4. Verwijdering van apoptotic cellen bevordert in het algemeen een anti-inflammatoire reactie, die kan worden gekoppeld aan immunologische tolerantie5. Verstoring van apoptotic Cell klaring drives zelf-immunisatie en draagt bij tot de ontwikkeling van systemische auto-immuunziekten in zowel mensen als muizen6.

Wanneer de cellen apoptosis ondergaan, stellen zij de fosfatidylserine (PtdSer) van de binnen folder aan de buiten folder van het membraan bloot. PtdSer zal dan door fagocyten door oppervlakte receptoren worden erkend. Meer dan een dozijn receptoren zijn geïdentificeerd te herkennen en/of te vergemakkelijken de overspoeling van apoptotic cellen. In het algemeen zijn er ten minste drie soorten oppervlakte-receptoren die betrokken zijn bij de apoptotic cel klaring: Tethering receptoren, herkennen apoptotic cellen; kietelen receptoren, initiëren overspoeling; chaperoning receptoren, vergemakkelijken het hele proces7. TAM receptor tyrosine kinases (TAM RTKs) bestaan uit Tyro-3, AXL, en Mer en worden voornamelijk uitgedrukt door myeloïde cellen van het immuunsysteem8. De primaire functie van TAM RTKs is om te dienen als Tethering receptoren, het vergemakkelijken van de fagocyterende verwijdering van apoptotic cellen en puin. Onze groep heeft gestudeerd TAM gemedieerde apoptotic Cell klaring in de setting van de autoimmuniteit voor vele jaren. De vitamine K-afhankelijke eiwit de groeiarrestatie specifieke proteïne 6 (Gas6) en proteïne S (ProS) bindt aan en activeert de receptoren van TAM9,10. Gas6 wordt geproduceerd in het hart, nieren, en de longen. ProS wordt hoofdzakelijk geproduceerd in lever11. TAM erkent van apoptotic cellen op een zodanige wijze dat de N-terminal van Gas6/ProS bindt aan de PtdSer op een apoptotic cel en de C-terminal van Gas6/ProS bindt aan TAM-receptoren die verankerd op het oppervlak van fagocyten. Samen met de andere receptoren, overspoeling van apoptotic cellen komt12. Hoewel Mer kan binden aan zowel de ligands ProS en Gas6, vonden we dat Gas6 lijkt te zijn de enige ligand voor Mer-gemedieerde macrofagen fagocytose van apoptotic cellen, die kunnen worden geblokkeerd door anti-Mer antilichaam13. Macrofagen zijn professionele fagocyten. Snelle ontruiming van apoptotic cellen door macrofagen is belangrijk voor de remming van ontstekingen en auto-immune reacties tegen intracellulaire antigenen. Mer receptor tyrosine kinase is van cruciaal belang voor de inspoeling van de macrofagen en efficiënte klaring van apoptotic cellen14. In muis milt, Mer voornamelijk uitdrukt op de marginale zone en tastbare lichaam macrofagen13.

Het hier voorgestelde protocol beschrijft een basismethode om cel apoptosis te veroorzaken en manieren aan te tonen om het proces en de efficiency van efferocytosis te meten. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan studie efferocytosis door andere cel types in het overspoelen van apoptotic cellen van verschillende oorsprong.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Experimentele muizen werden gefokt en onderhouden in onze muizen kolonie. Alle dierlijk werk werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal zorg en het gebruik Comite (DEC) van de Universiteit van Cincinnati.

1. voorbereiding van CFSE gelabeld apoptotic thymocyten

  1. Euthanaseren twee naïeve C57/B6 muizen door CO2 inhalatie voor 10 min en ontleden om de borstholte te openen, verwijderen (pull out) de thymus met gebogen Fine-Tip Tang in weefselcultuur petrischaal met 10 ml van RPMI1640 medium.
  2. Verkrijg enkele cel schorsing door het slijpen van de hele Thymus tegen twee matte uiteinden van de Microscoop dia's en vervolgens filteren de schorsing door middel van 100 μm cel zeef.
  3. Verzamel de 10 mL Thymus suspensie in een 50 mL buis en centrifuge op 300 x g voor 5 min.
  4. Verwijder de bovendrijvende, opnieuw op te schorten in 40 mL van 1x PBS, en Tel cel nummers met een hemocytometer.
  5. Centrifugeer bij 300 x g voor 5 min en verwijder de bovendrijvende.
  6. Hersuspendeer in 20 mL van 1x PBS in een 50 mL buis als een enkele cel schorsing met maximaal 2 x 108 cellen (indien meer dan 2 x 108 cellen, de rest van de cellen opnieuw op te schorten in een andere 20 ml van 1 x PBS in een andere 50 ml buis).
  7. Maak 5 μM van CFSE in gelijk volume (20 mL) van 1x PBS in een aparte 50 mL buis door het pipetteren van 40 l van CFSE Stock Solution (2,5 mM) in 20 mL 1x PBS en meng goed door het inverteren van de buis 2-3 keer.
  8. Voeg de 20 mL CFSE van stap 1,7 in de 20 mL van de cel schorsing van stap 1,6 (de uiteindelijke concentratie van CFSE is nu 2,5 μM).
    Opmerking: voor elke 20 mL cel schorsing is een 20 mL CFSE buis nodig.
  9. Omkeren van de cel en CFSE mengsel buis 2-3 keer en Incubeer het mengsel in het donker bij kamertemperatuur voor een maximum van 2 min, dan stoppen met de reactie door toevoeging van 10 mL warmte-geïnactiveerde paard serum.
  10. Centrifugeer het 50 mL Tube mengsel bij 300 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
    Nota: als de CFSE etikettering succesvol is, zal de cel korrel lichtgeel van kleur worden.
  11. Verwijder de bovendrijvende en hersuspendeer de Cell pellet in 40 mL van 1x PBS en Tel de cel nummers met een hemocytometer.
  12. Centrifugeer de cel suspensie bij 300 x g voor 5 min en gooi de bovendrijvende.
  13. Was de cel pellet weer met 40 mL van RPMI1640 medium.
  14. Verwijder de bovendrijvende en opnieuw op te schorten cellen met RPMI1640 weefselkweek medium (RPMI1640 mM HEPES, 10% FBS (warmte geïnactiveerd), 20 mM glutamine, en 1x pen/keelontsteking) bij een concentratie van 7 x 106 cellen/ml in een 100 mm weefselkweek schaal.
    Opmerking: als er meer cellen worden verkregen, zal een aparte 100 mm weefselkweek schotel nodig zijn.
  15. Voeg staurosporine in de cel schorsing cultuur bij een definitieve concentratie van 1 μM en cultuur voor 4 uur bij 37 ° c in een weefselkweek incubator geleverd met 5% CO2.

2. bereiding van de buik macrofagen

  1. Injecteren twee C57B6 muizen (of een Gene-gemanipuleerde muizen in het lab) ze intraperitoneaal met 1 mL van 3% oud thioglycollaat op dag 0.
  2. Euthanaseren de muizen op dag 5 als in stap 1,1, knippen en schil open de buikhuid, maar laat het buikvlies intact. Spoel de buikholte door snel 10 mL was buffer (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) in de buikholte te duwen met een 10 mL spuit bevestigd met een naald van 18 G.
  3. Haal de Wash buffer langzaam met dezelfde naald/spuit, en verzamel de Wash buffer in een 50 mL Tube (details verwijzen naar Janssen Lab artikel15).
  4. Was het buikvlies sonde tweemaal met 1x PBS, hersuspendeer de buik macrofagen in RPMI1640 weefselkweek middel bij een dichtheid van 2 x 106 cellen/ml en hoeveelheid 500 l in elk van de 24-Well plaat. Laat de plaat in een weefselkweek incubator voor 2 uur.
  5. Verwijder de zwevende cellen door opzuigen en vervangen met 500 l van verse cultuurmedium, tweemaal.
  6. Optioneel, voeg TAM receptor tyrosine-remmer, RXDX-106, bij concentraties aangegeven in de figuur legendes in elk goed van de macrofagen cultuur en incubeer voor een andere 2 h.

3. co-cultuur van buik macrofagen met apoptotic thymocyten

  1. Verzamel apoptotic thymocyten van stap 1 en was drie keer met RPMI1640 medium. De efficiëntie van apoptotic inductie kan in dit stadium gemeten worden met de Annexine V/7-AAD Kit.
  2. Distribueer 0-12 x 106 cellen (in 500 l medium) in elke put van de macrofagen culturen van Protocol #2, volgens de experimentele regeling (bijv. Zie figuur 1). Dit maakt het gehele cultuur volume van 1 mL in elk goed van de 24-goed plaat. Voeg het blokkerende antilichaam in de cultuur onmiddellijk voor de toevoeging van apoptotic thymocyten.
  3. Cultuur het cel mengsel bij 37 °C voor 4 h in een incubator van de weefselcultuur die met 5% CO2wordt geleverd.
  4. Was elk goed van de cultuur met 1x PBS (bevattend 500 μM EDTA) tweemaal om de vrij-drijft apoptotic cellen te verwijderen.
  5. Vlek de plaat-gebonden macrofagen met CD11b-PE in dit stadium.
    1. Was de plaat-gebonden macrofagen met vlekken buffer (1x PBS, 1% BSA) een keer.
    2. Voeg 200 l van de vlek buffer met 2 l CD11b-PE in elk goed toe.
    3. Incubeer de plaat bij 4 °C gedurende 20 min.
    4. Was elk goed van de plaat drie keer met de kleuring buffer.
    5. Voeg 200 l van de vlek buffer toe en ga de plaat voorbeeld analyse onder de fluorescente microscoop te werk.
  6. Alternatief, Los de plaat-gebonden macrofagen door toevoeging van 1 mL 1% lidocaïne in PBS en incubatie voor 10 min bij 37 ° c.
  7. Maak plaat-gebonden macrofagen met REPEAT pipet los.
  8. Breng de macro-suspensie over in een individuele 5 mL ronde-onderkant FACS buis van elk goed van de 24-Well plaat.
  9. Centrifugeer bij 300 x g voor 5 min.
  10. Verwijder de bovendrijvende en voeg 200 l van de vlek buffer toe met 2 l CD11b-PE (1:200 verdunning in kleur buffer).
  11. Incubatie de cel schorsing in kleuring buffer bij 4 ° c voor 20 min.
  12. Was de cel schorsing tweemaal met kleuring buffer.
  13. Voeg 200 l van kleuring buffer en ga voor FACS analyse met een flow cytometer en analyseren voor het percentage van CFSE positiviteit macrofagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Analyse van het buikvlies macrofagen-gemedieerde overspoeling van apoptotic thymocyten. Buik macrofagen en apoptotic cellen werden voorbereid en co-Cultured zoals beschreven in het protocol. Macrofagen werden losgemaakt en gekleurd met PE geconjugeerd anti-CD11b antilichaam voor 20 min op ijs. Macrofagen werden vervolgens gewassen en verwerkt in een stroom cytometer. Zoals te zien, er is geen CFSE positieve macrofagen in de rechtsonder Kwadrant als er geen apoptotic cellen werden toegevoegd in de cultuur (Figuur 1A en Figuur 2, eerste paneel). Thioglycollaat-gestimuleerde buik macrofagen hebben de variabele capaciteit om apoptotic cellen over te spoelen. Tot 30% van de macrofagen bleek positief in het CFSE kanaal, wat aangeeft dat ze CFSE apoptotic cellen hebben ingenomen in dit experiment (Figuur 1). Het is de moeite waard op te merken dat CFSE positieve macrofagen verspreid in het rechtsonder Kwadrant als gevolg van verschillende intensiteiten, wat aangeeft dat het aantal apoptotic cellen in macrofagen is anders. Daarom is microscopische observatie van de inname van macrofagen van apoptotic cellen essentieel om de capaciteit van macrofagen te onderzoeken om apoptotic cellen in te nemen (Figuur 2). De hogere verhouding tussen apoptotic cellen en macrofagen verhoogt niet alleen het aantal macrofagen dat apoptotic cellen inneemt, maar vergroot ook het vermogen van macrofagen om meer apoptotic cellen te inslikken (Figuur 2).

Dosis-afhankelijke remming van efferocytosis door de stagnatie van Mer.
In een andere reeks van experimenten, vonden we dat ongeveer 15% van de macrofagen werd CFSE positief toen CFSE-label apoptotic thymocyten (rantsoen van 6:1) werden toegevoegd in de macrofagen cultuur voor 4 h, wat aangeeft dat ze de fagocyterende macrofagen (Figuur 3 B). een functie van Mer op macrofagen is het herkennen en bemiddelen fagocytose van apoptotic cellen door de overbruggings molecule, Gas6. Om het percentage van efferocytosis te testen dat door Mer remming wordt toegeschreven, voegden wij anti-Mer antilichamen in de cultuur toe om Mer-gemedieerde efferocytosis te blokkeren. Mer antilichaam blokkeert macrofagen efferocytosis in een dosis-afhankelijke manier (Figuur 3C, Figuur 3D) en de algehele blokkade kan goed zijn voor ongeveer 30% van de efferocytosis efficiëntie in de huidige stand (Figuur 3) , Deze gegevens werd ook bevestigd in onze vorige studie met Mer knock-out macrofagen13. Vervolgens hebben we getest de efficiëntie van remming met de nieuwe FDA goedgekeurde TAM receptor remmer, RXDX-106, die alle TAM-receptoren met verschillende affiniteiten remt (Axl > > Tyro3 > Mer). RXDX-106 werd toegevoegd in de macrofagen cultuur 2 uur voor co-incubatie met apoptotic thymocyten. Zoals weergegeven in Figuur 4, RXDX-106 geremde macrofagen efferocytosis in een dosisafhankelijke wijze. De verzadigde remming concentratie was ongeveer 100 nM (Figuur 4, vaste lijn), een concentratie die lijkt effectiever te zijn dan Mer-deficiëntie (Figuur 4 stippellijn) of Mer antilichaam (Figuur 3, paneel D) alleen. Aangezien macrofagen alle drie de TAM-receptoren op de oppervlakte16uitdrukt, zal men naar verwachting zien dat hogere concentraties van RXDX-106 (meer dan 100 nm) alle drie de receptoren zullen blokkeren, en daarom effectiever zullen zijn in het blokkeren van efferocytosis dan gericht op een enkele TAM-receptor, Mer.

Figure 1
Figuur 1 . Percentage van fagocytose van apoptotic thymocyten door buik macrofagen. Apoptotic thymocyten werden geïnduceerd door incubatie met 1 mm staurosporine voor 4 h en toegevoegd in de macrofagen cultuur op een ratio zoals aangegeven in de figuur panelen: (a) 1:0; B1:1; C1:2; D1:4; E1:6; F1:8; G1:10; (H) 1:12. De gegevens werden verworven met een stroom cytometer. Percentage van fagocyterende macrofagen werd geanalyseerd met behulp van de software in verband met de flow cytometer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 . Microscopische analyse van efferocytosis. Efferocytosis werd voorbereid als in Figuur 1. Fagocyterende macrofagen werden in situ gekleurd op de plaat met CD11b-PE, gefixeerd met Paraformaldehyde, en geëvalueerd. De beelden werden verworven gebruikend de fluorescente microscoop en werden geanalyseerd met de software verbonden aan de Microscoop. Representatieve inserties werden digitaal vergroot en hieronder weergegeven in elk beeld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 . Remming van het buikvlies macrofagen efferocytosis door een anti-Mer antilichaam. Apoptotic cellen werden voor 4 h voorbereid en samen met macrofagen gekweekt, zoals beschreven in het protocol. Anti-Mer AB werd toegevoegd in de macrofagen cultuur onmiddellijk voor de co-cultuur met apoptotic cellen. Fagocyterende macrofagen werden dan losgemaakt en bevlekt met anti-muis CD11b-PE antilichaam op ijs 20 min. de gegevens werden verworven en werden geanalyseerd zoals in Figuur 1. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 . RXDX-106 gemedieerde remming van de macrofagen efferocytosis. Efferocytosis is opgezet zoals beschreven in Figuur 3. RXDX-106 werd toegevoegd twee uur voor de co-cultuur met apoptotic thymocyten. Mer-gebrekkige buik macrofagen werden op dezelfde manier voorbereid en dienden als controlegroep. Gegevens werden verworven en het percentage van fagocyterende macrofagen werden gated op CD11b positieve cellen en geanalyseerd met behulp van de flow cytometer software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Apoptosis is een hoogst behouden celdood proces dat vele signaalcascades impliceert en proteïne uitdrukking, afscheiding, en vervoer veroorzaakt. Apoptosis wordt vaak geassocieerd met cellulaire morfologie veranderingen17. Apoptotic cellen actief vrijgeven cytokines en chemokines die aantrekken fagocyten om te migreren naar de site en initiëren van het proces van overspoeling, een uiterst complexe route onder strakke controle18. Aan de andere kant, necrotic Cell Death releases gevaar signalen die leiden tot inflammatoire reacties1. Defecte of langdurige ontruiming van apoptotic cellen zal leiden tot secundaire necrose van deze cellen19. Daarom, is de timing in inductie apoptosis zeer kritiek in het experiment. Er zijn talrijke manieren om cel apoptosis20te veroorzaken. De duur en de sterkte van inductie zijn echter afhankelijk van het type cel. Wij raden het opzetten van een titratie experiment om de optimale conditie van maximaal (90-95%) te bepalen de productie van apoptosis. De Annexine-V/7-AAD apoptotic Detection Kit werd gebruikt en de instructies werden gevolgd in ons lab om de apoptotic efficiency te evalueren. Ons laboratorium heeft twee verschillende manieren geprobeerd om thymocyten apoptosis in het verleden te veroorzaken. Gamma-straling lijkt een betere methode, want het heeft geen chemische residuen in de cultuur en induceert weinig necrotic celdood. We bloot thymocyten aan 500 Rad van g-straling gevolgd door 4-h cultuur in RPMI1640 medium. We waargenomen ongeveer 95% apoptotic thymocyten13. Wanneer een radiator niet beschikbaar is, bewogen wij thymocyten om apoptosis met 1 μM van staurosporine in de cultuur voor 4 h (stap 1,15) te ondergaan. De primaire cellen zijn over het algemeen gevoeliger voor inductie apoptosis. Uitgebreide wassen stappen zijn ook nodig om de chemische stoffen te verwijderen uit cultuur voor co-cultuur met fagocyten. Er zijn vele manieren om apoptotic cellen te labelen. Hoewel de toxiciteit is geassocieerd met een hoge concentratie, CFSE is zeer efficiënt behouden in het cytoplasma wanneer zorgvuldig geoptimaliseerd21. pHrodo is een zuur-gevoelige kleurstof, die toeneemt in fluorescentie naarmate de pH van het milieu afneemt. Wegens de lage pH van de phagolysosome, phagocytized apoptotic cellen gemakkelijk kunnen worden onderscheiden van fysisch verbonden maar niet overspoelde apoptotic cellen in test22.

Talrijke oppervlakte receptoren (de receptoren van TAM, mannose receptor, integrines (CD11b/CD18), de receptoren van de straatveger, de receptoren van FC, et al) staan fagocyten toe om zelf van ziekteverwekkers te onderscheiden en de verdere reacties te discrimineren23. Verschillende receptoren werken samen om een vrij complex proces af te maken. Blokkerende receptor (s) waarschijnlijk resulteert in een gedeeltelijke remming van fagocytose. Primaire macrofagen kunnen worden bereid uit verschillende middelen met verschillende methoden (beenmerg afgeleide macrofagen, buik macrofagen, milt macrofagen, et al..). Het voordeel van thioglycollaat-geïnduceerde macrofagen is het scheef fagocyterende fenotype van de macrofagen; het nadeel is dat thioglycollaat moet worden verouderd in het donker voor ten minste 3 maanden. Echter, thioglycollaat oplossing heeft een houdbaarheid van 2 jaar. Een constante voorraad van de oplossing zou dit nadeel moeten overwinnen. Bij de voorbereiding van het buikvlies macrofagen, het spoor bedrag van rode bloedcellen in de buikvlies macrofagen collectie mag niet van invloed op het experiment, omdat ze zullen worden weggespoeld samen met de drijvende cellen na 2 h van de macrofagen cultuur. Een grote hoeveelheid rode bloedcellen (zichtbare pellet) kan een behandeling met ACK Lysing buffer vereisen. Macrofagen hebben de neiging om stevig vast te houden aan het cultuur oppervlak. De verschillende methodes zijn aangehaald in de literatuur om adhesie cellen van de oppervlakte24los te koppelen. Het op enzymen gebaseerde detachement levert de hoogste niveaus van cel terugwinning op maar kan oppervlakte receptoren, het schaden van cel functie en bijbehorende analyses beschadigen. Wijziging van oppervlakte-receptoren kan ook van invloed op receptor-based flow Cytometry analyse. Lidocaïne oorzaken cel morfologie te veranderen in een meer sferische conformatie als gevolg van de blokkade van calciumionen kanalen25. Het is de beste manier om macrofagen los te koppelen van het oppervlak zonder merkbare schade in ons experiment.

Macrofagen met apoptotic cellen kunnen worden geanalyseerd doorstroming op basis van Cytometry of Microscoop-gebaseerde assays. FACS kan worden toegepast om een groot aantal cellen te analyseren in een korte tijd en kan verder identificeren cel subtypes door differentiële vlekken met antilichamen tegen de specifieke oppervlak of cytoplasma eiwitten. Een optimale concentratie (ratio) van apoptotic cel nummers in het co-cultuursysteem kan ook worden bepaald door de FACS analyse. Microscopische analyse heeft beperkingen ten aanzien van cel nummers en differentiële vlekken in vergelijking met de FACS analyse. Echter, fluorescerende microscopie biedt diepgaande informatie. Microscopische analyse van de inname van macrofagen van apoptotic cellen is essentieel om de capaciteit en de kinetiek van macrofagen te onderzoeken om apoptotic cellen in te nemen. Een time-lapse van de hele inname progressie kan gedetailleerde informatie over hoe lang het duurt om overspoelen een apoptotic cel, en hoeveel apoptotic cellen kan een enkele macrofagen inslikken gelijktijdig. Fagocyterende macrofagen kunnen ook worden geanalyseerd door Western Blot om signalering moleculen gereguleerd door het overspoelings proces te onderzoeken. Genexpressie profielen geassocieerd met dit proces kan worden geëvalueerd door real-time PCR.

Tot slot biedt dit protocol een basisplatform in de experimentele analyse van efferocytosis. Andere cel types (dendritische cellen, mesangiale cellen, epitheelcellen) kunnen ook functioneren om apoptotic cellen op hun residentiële sites te gebruiken. Deze cellen hebben voorkeuren in het gebruik van verschillende receptoren te herkennen en initiëren van het proces van apoptotic Cell Clearance2. De algehele fagocyterende efficiëntie kan worden beïnvloed door verschillende factoren, met inbegrip van experimentele en cel type specifieke factoren. Variabele resultaten gerapporteerd in de literatuur zijn waarschijnlijk te wijten aan 1) duur van de co-cultuur; 2) bron en bereiding van fagocyten en apoptotic cellen; 3) methodes om de apoptotic cellen van fagocyten te scheiden. Het hier beschreven protocol kan van toepassing zijn op het fagocyterende potentieel van andere cellen. De optimalisering kan worden vereist om het fagocyterende potentieel van doelcellen te maximaliseren. We hebben renale mesangiale Cell fagocytose of apoptotic thymocyten gegenereerd op dezelfde manier als beschreven in dit protocol. Neutrofielen spelen een belangrijke rol in het aangeboren immuunsysteem door eliminatie van pathogenen. Neutrofiele Fagocytose van gelabelde bacteriën of deeltjes kan worden geanalyseerd doorstroming Cytometry26. Nochtans, hebben neutrofielen een zeer korte halveringstijd (6-8 h) en neutrofiele Fagocytose van bacteriën of paddestoelen komt binnen seconden aan notulen27,28voor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Onderzoek in de Shao Lab wordt ondersteund door onderzoek innovatieve Award van het College of Medicine en de Junior Faculty pilot Award van het ministerie van interne geneeskunde, Universiteit van Cincinnati en Grant DK K01_095067 van NIDDK/NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13, (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28, (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14, (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172, (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80, (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123, (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133, (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411, (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68, (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31, (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112, (4), 935-945 (2008).
Experimentele analyse van apoptotic Thymocyte overspoeling door macrofagen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter