Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

doi: 10.3791/59731 Published: May 24, 2019

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להכין thymocytes, מקרופאגים הצפק ולנתח את היעילות של efferocytosis ואת החסימה בתיווך מעכבי של האפוטוציטים thymocytes שתבלע. פרוטוקול זה יש יישום נרחב בסיווג התא-תיווך של חלקיקים אחרים כולל חרוזים מלאכותיים וחיידקים.

Abstract

ואפופטוזיס תא הוא תהליך טבעי וממלא תפקיד קריטי בפיתוח עובריים, רגולציה הומסטטית, עמידות החיסונית אינדוקציה, ורזולוציה של דלקת. הצטברות של פסולת אפוטוטית בגוף עלולה לגרום לתגובות דלקתיות כרוניות המובילות מחלות אוטואימוניות מערכתית לאורך זמן. . מעורב במגוון מחלות אוטואימוניות סיווג האפוטוטיק הוא תהליך מורכב שנדיר לעתים רחוקות בתנאים פיזיולוגיים. זה כולל קולטני שטח שופע מולקולות איתות. לימוד התהליך של הסיווג התא האפוטוטיק מספק מנגנונים מולקולריים תובנה ותגובות ביולוגיות עוקבות, אשר עשוי להוביל לפיתוח של therapeutics חדש. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים עבור אינדוקציה של thymocytes האפוטוציטים, הכנת מקרופאגים הצפק, וניתוח של הסיווג התא האפוטוטיק על ידי הזרמת cy, ומיקרוסקופ. כל התאים יעברו אפופטוזיס בשלב מסוים, ומגורים רבים במחזור התאים יכולים ספיגה של פסולת אפוטוטית. לכן, הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש ביישומים רבים כדי לאפיין את כריכת התא האפוטוטית ובליעה של סוגים רבים של תאים אחרים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הגוף שלנו מייצר 1-10 מיליארד תאי האפוטוטיים על בסיס יומי. מספר גדול של תאים אפוטוטיים חייב להיות מתנקה באופן שהתגובות החיסונית יישארו בשקט. כדי להבטיח את הסיווג של תאים האפוטוטיים בזמן, סוגים רבים של תאים תושב רקמות ותאים מחזורי לפתח מנגנונים לתאי האפוטוטיים מפרץ1. רגולציה מתפקדת של אפופטוזיס כבר מעורב בתחילתה והתקדמות של מחלות דלקתיות שונות החסינות האוטומטית2. אפופטוזיס גם משחק תפקיד קריטי בפתוגנזה של התפתחות הסרטן ההתנגדות הבאה שלה טיפולים קונבנציונליים3,4. הסרת תאים אפוטוטיים מקדמת בדרך כלל תגובה אנטי דלקתית, אשר עשויה להיות מקושרת לסובלנות החיסונית5. הפרעה של הסיווג תא האפוטוטיק כוננים חיסון עצמי תורמת לפיתוח של מחלות אוטואימוניות מערכתית בבני אדם ועכברים6.

כאשר התאים עוברים ואפופטוזיס, הם חושפים את הפוספלדיסרין (פטין) מתוך העלון הפנימי אל העלעל החיצוני של הקרום. לאחר מכן יהיה מזוהה על ידי phagocytes באמצעות קולטני פני השטח. למעלה מתריסר קולטנים זוהו לזהות ו/או להקל על הבזלת של תאים אפוטוטיים. באופן כללי, ישנם לפחות שלושה סוגים של קולטני פני השטח המעורבים בסיווג התא האפוטוטית: הקולטנים קולטני, לזהות תאים אפוטוטיים; לדגדג קולטנים, ליזום שתבלע; קולטנים למשגיחים, להקל על התהליך כולו7. שיטת הקולטן טאם (TAM RTKs) מורכבת מ- Tyro-3 , Xl, ו- Mer והם מבוטאים בעיקר על ידי תאים מיאלואידים של מערכת החיסון8. התפקיד העיקרי של TAM RTKs הוא לשמש קולטנים הקשירה, הקלה על הסרת phagocytic של תאים אפוטוטיים ופסולת. הקבוצה שלנו למדה את הסיווג של התאים טאם בתיווך במסגרת החסינות האוטומטית במשך שנים רבות. הגידול ויטמין K התלוי חלבון מעצר מסוים חלבון 6 (Gas6) וחלבון S (היתרונות) נקשר ומפעיל את קולטני טאם9,10. Gas6 מופק בלב, הכליות, והריאות. מקצוענים מיוצרים בעיקר בכבד11. TAM מזהה בתאים אפוטוטיים בצורה כזאת, כי N-מסוף של Gas6/המקצוענים נקשר לפטין על תא האפוטוטיק ואת C-מסוף של Gas6/המקצוענים נקשר לקולטני TAM המעוגן על פני השטח של phagocytes. יחד עם קולטני אחרים, הבזים של תאים אפוטוטיים מתרחש12. למרות Mer יכול לאגד הן מומחי ליגנדס ו Gas6, מצאנו כי Gas6 מופיע להיות ligands עבור מר בתיווך מקרופאג phagocyציטוזה של תאים אפוטוטיים, אשר ניתן לחסום על ידי נוגדן אנטי מאר13. מקרופאגים הם phagocytes מקצועי. סיווג מהיר של תאים אפוטוטיים על ידי מקרופאגים חשוב עיכוב של דלקת ותגובות אוטואימוניות נגד אנטיגנים תאיים. קולטן מר טירולך קינאז הוא קריטי עבור מקרופאג הבזים וסיווג יעיל של תאים אפוטוטיים14. בטחול העכבר, Mer מבטא בעיקר על אזור שולי מקרופאגים גוף מוחשי13.

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה בסיסית כדי לגרום אפופטוזיס התא ולהפגין דרכים למדוד את התהליך ואת היעילות של efferocytosis. פרוטוקולים אלה ניתן להתאים בקלות כדי ללמוד efferocytosis על ידי סוגי תאים אחרים בתוך שתבלע של תאים אפוטוטיים של מקורות שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עכברים ניסיוניים התרבו והחזיקו במושבת העכברים שלנו. כל העבודות בעלי החיים נערכו על פי ההנחיות של הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת סינסינטי.

1. הכנת תימוציטים מותווית של CFSE

  1. המתת חסד שני העכברים C57/B6 על ידי CO2 שאיפת עבור 10 דקות ולנתח כדי לפתוח את חלל החזה, להסיר (למשוך החוצה) את התימוס עם מלקחיים בסדר מעוקל עצה לתוך צלחת התרבות הרקמה פטרי המכיל 10 מ ל של RPMI1640 medium.
  2. השג השעיה תא יחיד על ידי שיוף התימוס כולו נגד שני קצוות מזוגג של שקופיות מיקרוסקופ ולאחר מכן לסנן את ההשעיה דרך מסננת תא 100 יקרומטר.
  3. לאסוף את 10 מ"ל בלוטת התימוס הבולם לתוך צינור 50 mL ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
  4. הסר את הסופרנטאנט, השהה מחדש ב-40 mL של 1x PBS, וספור מספרי תאים עם הומוציטומטר.
  5. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ולהסיר את supernatant.
  6. השהה מחדש 20 מ ל של 1x PBS בצינור 50 mL כמו תא אחד השעיה עם עד 2 x 108 תאים (אם יותר מ 2 x 108 תאים, להשעות את שאר התאים בעוד 20 מ ל של 1 x PBS ב שונים 50 ml שפופרת).
  7. לעשות 5 μM של CFSE בנפח שווה (20 מ ל) של 1x PBS בצינור 50 mL נפרד על ידי pipetting 40 μL של פתרון מלאי CFSE (2.5 mM) לתוך 20 מ ל של 1x PBS ומערבבים היטב על ידי היפוך הצינור 2-3 פעמים.
  8. הוסף את 20 מ ל CFSE משלב 1.7 לתוך 20 מ ל של השעיית תא משלב 1.6 (הריכוז הסופי של CFSE הוא עכשיו 2.5 μM).
    הערה: עבור כל 20 mL השעיית תא, 20 מ ל של צינור CFSE נדרש.
  9. היפוך התא ו CFSE תערובת שפופרת 2-3 פעמים ו דגירה את התערובת בחושך בטמפרטורת החדר עבור מקסימום של 2 דקות, ולאחר מכן להפסיק את התגובה על ידי הוספת 10 מ ל של סרום הסוס חום המופעל.
  10. צנטריפוגה את תערובת שפופרת 50 mL ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: אם התיוג CFSE מוצלח, גלולה תא יהיה צהוב בהיר בצבע.
  11. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בתא ב 40 mL של 1x PBS וספירת מספרי תאים עם הומוציטומטר.
  12. צנטריפוגה את ההשעיה התא ב 300 x g עבור 5 דקות ולהיפטר supernatant.
  13. לשטוף את הגלולה התא שוב עם 40 mL של מדיום RPMI1640.
  14. להסיר את supernatant ולהשעות את התאים עם RPMI1640 התרבות רקמות בינונית (RPMI1640, 20 מ"מ HEPES, 10% FBS (חום מופעל), 20 מ"מ גלוטמין, ו-1x עט/דלקת) בריכוז של 7 x 106 תאים/mL בצלחת התרבות 100 מ"מ רקמות.
    הערה: אם מתקבלים תאים נוספים, יהיה צורך בגידול נפרד של מ100 מ"מ ברקמות.
  15. הוסף סטרוספורטין לתוך התרבות ההשעיה התא בריכוז הסופי של 1 μM ותרבות עבור 4 h ב 37 ° c בחממה תרבות רקמות שסופקו עם 5% CO2.

2. הכנת מקרופאגים הצפק

  1. הכנס שני עכברים C57B6 (או כל העכברים מניפולציות הגנים במעבדה) intraperitoneally עם 1 mL של 3% בגילאי הזמן לאסוף ביום 0.
  2. המתת חסד העכברים ביום 5 כמו בשלב 1.1, לגזור ולקלף לפתוח את עור הבטן אבל לעזוב את צפק ללא פגע. ריקון החלל הצפק על ידי דוחף במהירות 10 מ ל של מאגר כביסה (RPMI1640, 2% FBS, 0.04% EDTA) לתוך חלל הצפק באמצעות מזרק 10 מ ל מוצמד עם מחט 18 גרם.
  3. לאחזר את מאגר לשטוף לאט עם אותו מחט/מזרק, ולאסוף את המאגר לשטוף לתוך צינור 50 mL (פרטים מתייחסים לסעיף מעבדה ג ' ינסן15).
  4. לשטוף את gavage הצפק פעמיים עם ה-PBS 1x, מחדש את מקרופאגים הצפק במדיום תרבות RPMI1640 רקמות בצפיפות של 2 x 106 תאים/mL ו-סדרת מחלקים 500 μl לתוך כל טוב של צלחת 24. השאירו את הצלחת בחממה לתרבית רקמות במשך 2 שעות.
  5. להסיר את התאים צף על ידי מתיף והחלפה עם 500 μL של מדיום תרבות טרייה, פעמיים.
  6. באופן אופציונלי, להוסיף את המעכב הקולטן של TAM מעכב, RXDX-106, בריכוזים שצוין באגדות דמות לתוך כל טוב של התרבות המקרופאג ו דגירה עבור 2 h אחר.

3. שיתוף תרבות של מקרופאגים הצפק עם האפומוציטים

  1. לאסוף thymocytes האפוציטים משלב 1 ולשטוף שלוש פעמים עם RPMI1640 medium. את היעילות של אינדוקציה האפוטוטית ניתן למדוד בשלב זה עם ערכת V/7-עמ ' של אנשין.
  2. הפץ 0-12 x 106 תאים (ב 500 μl בינונית) לתוך כל טוב של התרבויות המקרופאג מהפרוטוקול2, על פי הסדר ניסיוני (למשל, ראה איור 1). זה הופך את כל נפח התרבות של 1 mL בכל טוב של הצלחת 24-הבאר. להוסיף את הנוגדן חסימת לתוך התרבות מיד לפני התוספת של thymocytes האפוציטים.
  3. התרבות תערובת התאים ב 37 ° c עבור 4 h בחממה תרבות רקמות שסופקו עם 5% CO2.
  4. לשטוף כל היטב של התרבות עם 1x PBS (המכיל 500 μM EDTA) פעמיים כדי להסיר את התאים בחינם צף האפוטוטיים.
  5. הכתם את מקרופאגים מאוגדים בצלחת עם CD11b-PE בשלב זה.
    1. לשטוף את הצלחת מקרופאגים מאוגד עם מאגר צביעת (1x PBS, 1% BSA) פעם אחת.
    2. הוסף 200 μL של מאגר כתמים המכיל 2 μL CD11b-PE לתוך כל באר.
    3. מודקת את הצלחת ב 4 ° c עבור 20 דקות.
    4. רוחצים את כל הצלחות בצלחת שלוש פעמים עם מאגר הצביעת.
    5. הוסף 200 μL של מאגר כתמים ולהמשיך את הצלחת עבור ניתוח תמונה תחת מיקרוסקופ פלורסנט.
  6. לחילופין, לנתק את מקרופאגים לוחית הרישוי על ידי הוספת 1 mL של 1% לידוקאין ב-PBS ו הדגירה עבור 10 דקות ב 37 ° c.
  7. ניתוק מקרופאגים מאוגדים בצלחת עם ליטוף חוזר.
  8. העברת מקרופאג השעיה לתוך בודד 5 מ ל הצינור התחתון FACS מתוך כל טוב של צלחת 24-הבאר.
  9. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות.
  10. הסר את הסופרנטאנט והוסף 200 μL של מאגר כתמים המכיל 2 μL של CD11b-PE (1:200 דילול במאגר הצביעת).
  11. מודקון התא הבולם במאגר מכתים ב 4 ° צ' עבור 20 דקות.
  12. שטוף את ההשעיה של התא פעמיים עם מאגר מכתים.
  13. הוסף 200 μL של מאגר כתמים ולהמשיך לניתוח FACS עם cytometer זרימה ולנתח עבור אחוז של מקרופאגים חיוביות CFSE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ניתוח של מקרופאג הצפק-מתווך של האפוטוציטים. מקרופאגים הצפק ותאי האפוטוטיק היו מוכנים ושיתוף תרבותי כפי שמתואר בפרוטוקול. מקרופאגים היו מנותקים ומוכתמים עם הנוגדן PE anti-CD11b באוב עבור 20 דקות על הקרח. מקרופאגים נשטפו לאחר מכן ועובדו באמצעות ציטוטומטר זורם. כפי שנראה, אין CFSE חיובי מקרופאג ברביע הימני התחתון כאשר לא נוספו תאים האפוטוטיים לתוך התרבות (איור 1A ואיור 2, הפאנל הראשון). ליוגליל-מקרופאגים בצפק ממריצים יש את הקיבולת המשתנה של תאי אפוטוטיק. עד 30% של מקרופאגים הראו חיובי בערוץ CFSE, המציינת שהם אכלו תאים מתויגים CFSE מתויג בניסוי זה (איור 1). כדאי לציין כי CFSE מקרופאגים חיוביים התפזרו ברביע הימני התחתון בשל עוצמות שונות, המציין כי מספר התאים האפוטוטיים בתוך מקרופאגים הוא שונה. לכן, התבוננות מיקרוסקופית של המקרופאג בתאי האפוטוטיק חיוני כדי לחקור את היכולת של מקרופאגים לבלוע תאים אפוטוטיים (איור 2). היחס הגבוה ביותר של תאים אפוטוטיים מקרופאגים לא רק מגביר את מספר מקרופאגים בליעת תאים אפוטוטיים אלא גם מגביר את היכולת של מקרופאגים לבלוע תאים אפוטוטיים יותר (איור 2).

עיכוב תלוי במינון של efferocytosis על ידי חסימה של מר.
בקבוצה אחרת של ניסויים, מצאנו כי כ 15% של מקרופאגים הפך CFSE חיובי כאשר מסומן cftotic התווית האפוטוציטים (הקצבה של 6:1) נוספו לתרבות מקרופאג עבור 4 h, המציין שהם מקרופאגים phagocytic (איור 3 B). אחד הפונקציות של מאר על מקרופאגים הוא להכיר ולתווך phagocyציטוזה של תאים אפוטוטיים דרך מולקולה גישור, Gas6. כדי לבחון את אחוז הefferocytosis המיוחס לעיכוב מר, הוספנו את הנוגדנים האנטי-מאר לתוך התרבות כדי לחסום בefferocytosis של מר מתווך. מר בלוקים נוגדן מקרופאג efferocytosis באופן התלוי במינון (איור 3ג, איור 3ד) ואת החסימה הכוללת עשוי להסביר כ 30% היעילות efferocytosis בהגדרה הנוכחית (איור 3) , נתונים אלה אושרו גם במחקר הקודם שלנו עם מקרופאגים של מר הנוקאאוט13. לאחר מכן בדקנו את היעילות של עיכוב עם ה-FDA החדש אישר מעכב הקולטן TAM, RXDX-106, אשר מעכב את כל קולטני טאם עם afמסיימים שונים (אקסל > > Tyro3 > Mer). RXDX-106 התווסף לתרבות מקרופאג 2 שעות לפני הדגירה המשותף עם thymocytes. כפי שמוצג באיור 4, rxdx-106 עכבות מקרופאג efferocytosis באופן תלוי במינון. ריכוז עיכוב רווי היה כ 100 ננומטר (איור 4, קו מלא), ריכוז שנראה יעיל יותר מאשר מאר-מחסור (איור 4 קו מנוקד) או נוגדן מר (איור 3, פאנל D) לבד. מאז מקרופאג מבטאת את כל שלושת קולטני TAM על פני השטח16, זה צפוי לראות ריכוזים גבוהים יותר של RXDX-106 (מעל 100 nM) יחסום את כל שלושת הקולטנים, ולכן, יהיה יעיל יותר בחסימת efferocytosis מאשר מיקוד של קולטן TAM יחיד, מר.

Figure 1
איור 1 . אחוז של phagocytosis של האפוטוציטים של מקרופאגים בצפק. Thymocytes האפוציטים המושרה על ידי הדגירה עם 1 מ"מ של סטרוספורטין עבור 4 h והוסיף לתרבות מקרופאג ביחס כפי שצוין בלוחות האיור: (א) 1:0; (ב) 1:1; (ג) 1:2; (ד) 1:4; (ה) 1:6; (ו) 1:8; (ז) 1:10; (H) 1:12. הנתונים נרכשו עם cytometer זרימה. אחוז של מקרופאגים phagocytic נותחו באמצעות התוכנה המשויכת cytom, הזרימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 . אנליזה מיקרוסקופית של efferocytosis. Efferocytosis היה מוכן באיור 1. מקרופאגים phagocytic היו מוכתמים באתרו על צלחת עם CD11b-PE, קבוע עם פאראפורמלדהיד, ו העריכו. התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט ונותחו עם התוכנה המשויכת למיקרוסקופ. הוספות מייצגים הוגדלו דיגיטלית והוצגו להלן בכל תמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 . עיכוב של מקרופאג efferocytosis הצפק על ידי נוגדן אנטי מאר. תאים אפוטוטיים היו מוכנים ושיתוף תרבותי עם מקרופאגים במשך 4 שעות כפי שמתואר בפרוטוקול. אנטי מר Ab התווסף לתרבות המקרופאג מיד לפני שיתוף התרבות עם תאים אפוטוטיים. מקרופאגים phagocytic היו אז מנותקים ומוכתם עם אנטי עכבר CD11b-PE נוגדן על קרח 20 דקות. הנתונים נרכשו ונותחו כמו באיור 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 . RXDX-106 בתיווך עיכוב של מקרופאג efferocytosis. Efferocytosis הוגדרה כמתואר באיור 3. RXDX-106 התווסף שתי שעות לפני שיתוף התרבות עם thymocytes האפוטוטית. מקרופאגים הצפק מסוימים הוכנו באופן דומה ושימשו כקבוצת הביקורת. הנתונים נרכשו ואת אחוז מקרופאגים phagocytic היו מגודרת על CD11b תאים חיוביים ונותחו באמצעות התוכנה cytom, זרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אפופטוזיס הוא תהליך שימור מאוד תאים מוות המערבת הרבה אותות מפלי ומשרה ביטוי חלבון, הפרשה, ותחבורה. אפופטוזיס קשורה לעיתים קרובות עם שינויים מורפולוגיה הסלולר17. תאים אפוטוטיים משחררים ציטוקינים ונוגדנים שמושכים phagocytes כדי לעבור לאתר וליזום את תהליך של שריפת, מסלול מורכב מאוד תחת שליטה הדוקה18. מצד שני, מוות תאי נקרוטי משחרר אותות סכנה המפעילים תגובות דלקתיות1. הסיווג פגום או ממושך של תאים אפוטוטיים יוביל לנמק משני של תאים אלה19. לכן, העיתוי האינדוקציה אפופטוזיס הוא קריטי מאוד בניסוי. ישנן דרכים רבות כדי לגרום אפופטוזיס תא20. עם זאת, משך וחוזק של אינדוקציה הם סוג תא תלוי. אנו ממליצים להגדיר ניסוי טיטור כדי לקבוע את המצב האופטימלי של מקסימום (90-95%) הפקת אפופטוזיס. נעשה שימוש בערכת גילוי האפוקסין-V/7-עמ ' וההוראות הופעלו במעבדה שלנו כדי להעריך את היעילות האפוטוטית. המעבדה שלנו ניסו שתי דרכים שונות כדי לגרום לאפופטוזיס thymocytes בעבר. קרינת גמא נראה שיטה טובה יותר, משום שאין לו שמות כימיים בתרבות וגורם מקרי מוות של תאי נמק. אנו חושפים thymocytes ל 500 rad של g-קרינה ואחריו תרבות 4-h ב RPMI1640 בינונית. הבחנו ב 95% האפוטוציטים. כאשר רדיאטור אינו זמין, אנו המושרה thymocytes לעבור אפופטוזיס עם 1 μM של סטרופספורטין בתרבות עבור 4 h (שלב 1.15). התאים העיקריים הם בדרך כלל רגישים יותר האינדוקציה אפופטוזיס. שלבי הכביסה נרחב נדרשים גם כדי להסיר את הכימיקלים מן התרבות לפני שיתוף תרבות עם phagocytes. ישנן דרכים רבות לתווית תאים אפוטוטיים. למרות רעילות היתה קשורה לריכוז גבוה, CFSE הוא נשמר ביעילות רבה בתוך הציטופלסמה כאשר אופטימיזציה בזהירות21. pHrodo הוא צבע רגיש לחומצה, אשר מגביר את הזריחה כמו pH של הסביבה פוחתת. בשל ה-pH נמוך של phagolysosome התאים האפוטוקטיים מובחנים ניתן להבדיל בקלות מן התאים הקשורים פיזית, אך לא האפוטוטיות מובלע בתוך השיטת22.

קולטני שטח רבים (קולטני TAM, קולטן מנוז, אינטנס (CD11b/CD18), קולטני נבלות, קולטני Fc, ואח ') לאפשר phagocytes להבדיל עצמי מפתוגנים ולהפלות את התגובות הבאות23. קולטנים שונים לעבוד יחד כדי לסיים תהליך מורכב למדי. סביר להניח שחסימות עלולות להיות בעיכוב חלקי של phagocyציטוזה. מקרופאגים ראשוניים יכולים להיות מוכנים ממשאבים שונים עם שיטות שונות (מח עצם הנגזר מקרופאגים, מקרופאגים הצפק, מקרופאגים הטחול, ואח '). היתרון של מקרופאגים לאסוף המושרה הוא הפנוטיפ phagocytic מוטה של מקרופאגים; החיסרון הוא שצריך לתיישן בחשכה לפחות שלושה חודשים. עם זאת, לפתרון התמשוש יש חיי מדף של שנתיים. מלאי קבוע של הפתרון צריך להתגבר על חסרון זה. בהכנת מקרופאגים הצפק, כמות העקבות של כדוריות הדם האדומות באוסף מקרופאג הצפק לא צריך להשפיע על הניסוי, מאז הם הולכים להיסחף יחד עם התאים צף אחרי 2 h של תרבות מקרופאג. כמות גדולה של כדוריות הדם האדומות (הנראה גלולה) עשוי לדרוש טיפול עם מאגר ACK ליסינג. מקרופאגים נוטים לדבוק בחוזקה על פני השטח התרבותי. שיטות שונות הצוטטים בספרות כדי לנתק תאי הדבקה מפני השטח24. התנתקות מבוססת אנזימים מניב את הרמות הגבוהות ביותר של שחזור תאים, אך עלול לגרום נזק לפני קולטני השטח, תפקוד התא הפוגע וניתוחים משויכים. שינוי של קולטני פני השטח עשוי גם להשפיע על קולטן מבוסס cy, לנתח הזרימה. לידוקאין גורם למבנה התאים להשתנות לקונפורמציה כדורית יותר עקב המצור על ערוצי יון הסידן25. זוהי הדרך הטובה ביותר לנתק מקרופאגים מפני השטח עם נזק בולט בניסוי שלנו.

מקרופאגים המכילים תאים אפוטוטיים ניתן לנתח על ידי מבוססי cytometry מבוסס או מיקרוסקופ מבוסס assays. FACS ניתן להחיל כדי לנתח מספר גדול של תאים בזמן קצר והוא יכול עוד לזהות תת-סוגי תאים על ידי כתמים דיפרנציאלי עם נוגדנים נגד משטח ספציפי או חלבונים cytoplasmic. ריכוז מיטבי (יחס) של מספרי תאים מפוטוטיים במערכת שיתוף התרבות יכול להיות גם החליט על ידי ניתוח ה-FACS. לניתוח מיקרוסקופי יש מגבלות בנוגע למספרי התאים והצביעת הדיפרנציאלי לעומת ניתוח ה-FACS. עם זאת, מיקרוסקופ פלורסנט מספק מידע מעמיק. ניתוח מיקרוסקופי של המקרופאג בתאי אפוטוטיק חיוני כדי לחקור את הקיבולת ואת הקינטיקה של מקרופאגים לבלוע תאים אפוטוטיים. זמן לשגות של ההתקדמות בליעה כולה עשוי לספק מידע מפורט לגבי כמה זמן לוקח כדי להפרץ תא אחד אפוטוטיים, וכמה תאים האפוטוטיים יכול לבלוע בודד מקרופאג בו. מקרופאגים phagocytic יכול גם להיות מנותח על ידי כתם המערבי לחקור מולקולות איתות מוסדר על ידי התהליך שריפת. ניתן להעריך פרופילים של ביטוי גנטי המשויכים לתהליך זה על-ידי PCR בזמן אמת.

לבסוף, פרוטוקול זה מספק פלטפורמה בסיסית בניתוח ניסיוני של efferocytosis. סוגי תאים אחרים (תאים דנדריטים, mesangial תאים, אפיתל תאים) יכול גם לתפקד בתאי ספיגת התאים באתרי המגורים שלהם. תאים אלה יש העדפות ניצול קולטנים שונים כדי לזהות וליזום את התהליך של הסיווג תא האפוטוטית2. היעילות הכוללת של phagocytic עשויה להיות מושפעת ממספר גורמים, כולל הניסוי והסוג התאים הספציפיים. תוצאות משתנה שדווחו בספרות הן כנראה עקב 1) משך התרבות המשותף; 2) משאב והכנת התאים phagocytes והאפוטוטיק; 3) שיטות לנתק את התאים האפוטוטיים מ phagocytes. הפרוטוקול המתואר כאן עשוי לחול על הפוטנציאל phagocytic של תאים אחרים. מיטוב עשוי להידרש כדי למקסם את הפוטנציאל phagocytic של תאי היעד. יש לנו ניתחו mesangial תא כליות phagocyציטוזה של האפוטוציטים thymocytes שנוצר באותו אופן כפי שמתואר בפרוטוקול זה. נויטרופילים לשחק תפקיד מפתח במערכת החיסונית מולדת באמצעות חיסול של פתוגנים. הנויטרופילים של חיידקים או חלקיקים שכותרתו ניתן לנתח על ידי הזרימה cy, try26. עם זאת, נויטרופילים יש מאוד קצר חיים מחצית (6-8 h) ו נויטרופילים phagocyציטוזה של חיידקים או פטריות מתרחשת בתוך שניות לדקות27,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקר במעבדת האלה נתמך על ידי מחקר של פרס חדשני של המכללה לרפואה ואת הפרס טייס הפקולטה זוטר מהמחלקה לרפואה פנימית, אוניברסיטת סינסינטי וגרנט DK K01_095067 מ NIDDK/NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13, (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28, (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14, (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172, (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80, (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123, (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133, (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411, (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68, (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31, (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112, (4), 935-945 (2008).
אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter