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Immunology and Infection

Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi

doi: 10.3791/59731 Published: May 24, 2019

Summary

Qui, vi presentiamo un protocollo per preparare i timociti apoptotici e i macrofagi peritoneali e analizzare l'efficienza dell'efferocitosi e il blocco specifico inibitore-mediato di timociti apoptotici engulfment. Questo protocollo ha un'ampia applicazione nella clearance mediata da cellule di altre particelle, tra cui perle artificiali e batteri.

Abstract

L'apoptosi cellulare è un processo naturale e svolge un ruolo critico nello sviluppo embrionale, nella regolazione omeostatica, nell'induzione della tolleranza immunitaria e nella risoluzione dell'infiammazione. L'accumulo di detriti apoptotici nel corpo può innescare risposte infiammatorie croniche che portano a malattie immunitarie sistemiche nel tempo. Alterata clearance delle cellule apoptotiche è stata implicata in una varietà di malattie autoimmuni. La clearance apoptotica è un processo complesso raramente rilevato in condizioni fisiologiche. Si tratta di abbondanti recettori superficiali e molecole di segnalazione. Studiando il processo di clearance delle cellule apoptotiche fornisce meccanismi molecolari penetranti e successive risposte biologiche, che possono portare allo sviluppo di nuove terapie. Qui, descriviamo i protocolli per l'induzione di thymocytes apoptotici, la preparazione di macrofagi peritoneali, e l'analisi della clearance delle cellule apoptotiche da citometria di flusso e microscopia. Tutte le cellule subiscono l'apoptosi in un certo stadio, e molte cellule residenziali e circolanti possono captazione di detriti apoptotici. Pertanto, il protocollo qui descritto può essere utilizzato in molte applicazioni per caratterizzare l'associazione di cellule apoptotiche e l'ingestione da molti altri tipi di cellule.

Introduction

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Il nostro corpo genera 1-10 miliardi di cellule apoptotiche su base giornaliera. Tale numero elevato di cellule apoptotiche deve essere cancellato in modo che le risposte immunitarie rimangano quiescenti. Per garantire la clearance delle cellule apoptotiche in modo tempestivo, numerosi tipi di cellule residenti tessuto e cellule circolanti sviluppano meccanismi per inghiottire le cellule apoptotiche1. La regolazione disfunzionale dell'apoptosi è stata implicata nell'insorgenza e nella progressione di varie malattie infiammatorie e autoimmunità2. L'apoptosi svolge anche un ruolo critico nella patogenesi dello sviluppo del cancro e la sua conseguente resistenza ai trattamenti convenzionali3,4. La rimozione delle cellule apoptotiche generalmente promuove una risposta antinfiammatoria, che può essere legata alla tolleranza immunologica5. La violazione della clearance delle cellule apoptotiche spinge l'auto-immunizzazione e contribuisce allo sviluppo di malattie autoimmuni sistemiche sia negli esseri umani che nei topi6.

Quando le cellule subiscono l'apoptosi, espongono la fosfatidilserina (PtdSer) dall'opuscolo interno al foglietto esterno della membrana. PtdSer sarà quindi riconosciuto dai fagociti attraverso i recettori superficiali. Oltre una dozzina di recettori sono stati identificati per riconoscere e/o facilitare l'fiamme di cellule apoptotiche. In generale, ci sono almeno tre tipi di recettori superficiali coinvolti nella clearance delle cellule apoptotiche: recettori tethering, riconoscono le cellule apoptotiche; solletico recettori, avviare engulfment; i recettori di da chaperon, facilitano l'intero processo7. Le tirosina chinasi del recettore TAM (RTK TAM) consistono in TYRO-3, AXL e Mer e sono espresse principalmente da cellule mieloidi del sistema immunitario8. La funzione primaria di TAM RTKs è quella di servire come recettori tethering, facilitando la rimozione fagocitica di cellule apoptotiche e detriti. Il nostro gruppo ha studiato la clearance della cellula apoptotica mediata da TAM nell'impostazione dell'autoimmunità per molti anni. La proteina K-dipendente dall'arresto della crescita proteica specifica 6 (Gas6) e proteina S (Pro) si lega e attiva i recettori Tam9,10. Gas6 è prodotto nel cuore, nei reni e nei polmoni. Pro è prodotto principalmente nel fegato11. TAM riconosce le cellule apoptotiche in modo tale che il N-terminale di Gas6/ProS si lega al PtdSer su una cellula apoptotica e il C-terminal di Gas6/ProS si lega ai recettori TAM che ancorati sulla superficie dei fagociti. Insieme con gli altri recettori, fiamme di cellule apoptotiche si verifica12. Anche se Mer può legarsi sia ai ligandi Pro e Gas6, abbiamo scoperto che Gas6 sembra essere l'unico ligando per la fagocitosi di macrofage mediata da Mer di cellule apoptotiche, che può essere bloccata dall'anticorpo anti-Mer13. I macrofagi sono fagociti professionali. La clearance rapida delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi è importante per l'inibizione dell'infiammazione e delle risposte autoimmuni contro gli antigeni intracellulari. La tirosina chinasi del recettore del Mer è critica per l'fiamme macrofage e la clearance efficiente delle cellule apoptotiche14. Nella milza del topo, Mer si esprime principalmente sulla zona marginale e sui macrofagi corporei tangibili13.

Il protocollo presentato qui descrive un metodo di base per indurre l'apoptosi cellulare e dimostrare modi per misurare il processo e l'efficienza dell'efferocitosi. Questi protocolli possono essere facilmente adattati per studiare l'efferocitosi da altri tipi di cellule in fiamme di cellule apoptotiche di diverse origini.

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Protocol

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I topi sperimentali sono stati allevati e mantenuti nella nostra colonia di topi. Tutti i lavori sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di Cincinnati.

1. preparazione di CFSE etichettati timociti apoptotici

  1. Euthanize due topi C57/B6 naïve di CO2 inalazione per 10 min e sezionare per aprire la cavità toracica, rimuovere (estrarre) il timo con pinze curve fine-Tip nella coltura tissutale Petri piatto contenente 10 ml di RPMI1640 medium.
  2. Ottenere una sospensione a singola cellula rettificando l'intero Timo contro due estremità smerigliate dei vetrini del microscopio e quindi filtrare la sospensione attraverso 100 μm filtro a cellule.
  3. Raccogliere la sospensione da 10 ml di timo in un tubo da 50 ml e centrifugare a 300 x g per 5 min.
  4. Rimuovere il supernatante, risospendere in 40 mL di 1X PBS, e contare i numeri di cella con un emocytometro.
  5. Centrifugare a 300 x g per 5 min e rimuovere il surnatante.
  6. Risospendere in 20 mL di 1X PBS in un tubo da 50 mL come una sospensione singola cellula con fino a 2 x 108 cellule (se più di 2 x 108 cellule, risospendere il resto delle cellule in un altro 20 ml di 1 x PBS in un diverso 50 ml tubo).
  7. Fare 5 μM di CFSE in volume uguale (20 mL) di 1X PBS in un tubo separato 50 mL pipettando 40 μL di soluzione stock CFSE (2,5 mM) in 20 mL di 1X PBS e mescolare bene invertendo il tubo 2-3 volte.
  8. Aggiungere i 20 mL di CFSE dal passo 1,7 nel 20 mL di sospensione cellulare dal passo 1,6 (la concentrazione finale di CFSE è ora 2,5 μM).
    Nota: per ogni sospensione cellulare da 20 mL, è necessario un 20 mL di tubo CFSE.
  9. Invertire la cella e il tubo della miscela CFSE 2-3 volte e incubare la miscela al buio a temperatura ambiente per un massimo di 2 min, quindi arrestare la reazione aggiungendo 10 mL di siero di cavallo inattivato dal calore.
  10. Centrifugare la miscela di provette 50 mL a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: se l'etichettatura CFSE ha esito positivo, il pellet cellulare diventerà di colore giallo chiaro.
  11. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 40 mL di 1X PBS e contare i numeri di cella con un emocytometro.
  12. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min e scartare il surnatante.
  13. Lavare nuovamente il pellet cellulare con 40 mL di media RPMI1640.
  14. Rimuovere le cellule supernatanti e risospendere con il mezzo di coltura tissutale RPMI1640 (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (calore inattivato), 20 mM di glutammina e 1x Pen/STREP) ad una concentrazione di 7 x 106 cellule/ml in un piatto di coltura di tessuto di 100 mm.
    Nota: se si ottengono più cellule, sarà necessario un piatto di coltura tissutale separato di 100 mm.
  15. Aggiungere la staurosporina nella coltura della sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 1 μM e la coltura per 4 h a 37 ° c in un incubatore di colture tissutali fornito con 5% CO2.

2. preparazione di macrofagi peritoneali

  1. Iniettare due topi C57B6 (o qualsiasi topo manipolato dal gene in laboratorio) intraperitonealmente con 1 mL del 3% di tioglicicolato invecchiato al giorno 0.
  2. Euthanize i topi al giorno 5 come al passo 1,1, tagliare e sbucciare aprire la pelle addominale, ma lasciare il peritoneo intatto. Sciacquare la cavità peritoneale spingendo rapidamente 10 mL di tampone di lavaggio (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 10 mL fissata con un ago da 18 G.
  3. Recuperate lentamente il tampone di lavaggio con lo stesso ago/siringa e raccogliete il tampone di lavaggio in un tubo da 50 mL (i dettagli si riferiscono all'articolo15del Lab Janssen).
  4. Lavare il gavaggio peritoneale due volte con 1x PBS, risospendere i macrofagi peritoneali nel mezzo di coltura tissutale RPMI1640 a una densità di 2 x 106 cellule/ml e aliquota 500 μl in ogni pozzetto della piastra 24-well. Lasciare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per 2 h.
  5. Rimuovere le cellule galleggianti aspirando e sostituendo con 500 μL di mezzo di coltura fresco, due volte.
  6. Facoltativamente, aggiungere l'inibitore della tirosina del recettore TAM, RXDX-106, alle concentrazioni indicate nelle leggende figura in ogni pozzo della coltura macrofage e incubare per un altro 2 h.

3. co-coltura di macrofagi peritoneali con timociti apoptotici

  1. Raccogliere i timociti apoptotici dal passo 1 e lavare tre volte con RPMI1640 medio. L'efficienza dell'induzione apoptotica può essere misurata in questa fase con il kit Annexin V/7-AAD.
  2. Distribuire 0-12 x 106 cellule (in 500 μl di media) in ogni pozzo delle colture di macrofage dal protocollo #2, secondo la disposizione sperimentale (ad esempio, vedere Figura 1). Questo rende l'intero volume di coltura di 1 mL in ogni pozzo della piastra 24-well. Aggiungere l'anticorpo bloccante nella coltura immediatamente prima dell'aggiunta di thymocytes apoptotici.
  3. Coltura della miscela cellulare a 37 ° c per 4 h in un incubatore di colture tissutali fornito con 5% CO2.
  4. Lavare ogni pozzo della coltura con 1x PBS (contenente 500 μM EDTA) due volte per rimuovere le cellule apoptotiche libere galleggianti.
  5. In questa fase, macchiare i macrofagi con CD11b-PE legati alla placca.
    1. Lavare i macrofagi a piastre con tampone di colorazione (1x PBS, 1% BSA) una volta.
    2. Aggiungere 200 μL di tampone di colorazione contenente 2 μL di CD11b-PE in ciascun pozzetto.
    3. Incubare la piastra a 4 ° c per 20 min.
    4. Lavare ogni pozzetto di piastra tre volte con il tampone di colorazione.
    5. Aggiungere 200 μL di tampone di colorazione e procedere con la piastra per l'analisi delle immagini sotto il microscopio fluorescente.
  6. In alternativa, staccare i macrofagi legati alla placca aggiungendo 1 mL di lidocaina 1% in PBS e incubando per 10 min a 37 ° c.
  7. Scollegare i macrofagi a piastre con il pipettaggio ripetuto.
  8. Trasferire la sospensione di macrofage in un singolo tubo FACS a fondo rotondo da 5 mL da ciascun pozzetto della piastra 24-well.
  9. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
  10. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 μL di tampone di colorazione contenente 2 μL di CD11b-PE (1:200 diluizione nel tampone di colorazione).
  11. Incubare la sospensione cellulare nel tampone di colorazione a 4 ° c per 20 min.
  12. Lavare due volte la sospensione cellulare con tampone di colorazione.
  13. Aggiungere 200 μL di tampone di colorazione e procedere all'analisi FACS con un citometro a flusso e analizzare la percentuale dei macrofagi di positività CFSE.

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Representative Results

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Analisi dell'fiamme peritoneale del macrofago mediato di thymocytes apoptotici. I macrofagi peritoneali e le cellule apoptotiche sono state preparate e co-coltivate come descritto nel protocollo. I macrofagi sono stati staccati e macchiati con l'anticorpo anti-CD11b di PE coniugato per 20 minuti sul ghiaccio. I macrofagi sono stati poi lavati ed elaborati in un citometro a flusso. Come si è visto, non esiste un macrofago positivo CFSE nel quadrante in basso a destra quando non sono state aggiunte cellule apoptotiche nella coltura (Figura 1a e Figura 2, primo pannello). I macrofagi peritoneali stimolati da tioglycollato hanno la capacità variabile di inghiottire le cellule apoptotiche. Fino al 30% dei macrofagi ha mostrato positivo nel canale CFSE, indicando che hanno ingerito cellule apoptotiche con etichetta CFSE in questo esperimento (Figura 1). Vale la pena di notare che i macrofagi positivi CFSE si diffondono nel quadrante in basso a destra a causa di diverse intensità, indicando che il numero di cellule apoptotiche all'interno dei macrofagi è diverso. Pertanto, l'osservazione microscopica dell'fiamme dei macrofagi delle cellule apoptotiche è essenziale per indagare la capacità dei macrofaggi di ingerire le cellule apoptotiche (Figura 2). Il più alto rapporto di cellule apoptotiche ai macrofagi non solo aumenta il numero di macrofagi ingerendo le cellule apoptotiche, ma migliora anche la capacità dei macrofagi per ingerire più cellule apoptotiche (Figura 2).

Inibizione dose-dipendente di efferocitosi da blocco Mer.
In un altro insieme di esperimenti, abbiamo scoperto che circa il 15% dei macrofagi è diventato positivo per CFSE quando i timociti apoptotici etichettati con CFSE (razione di 6:1) sono stati aggiunti nella coltura del macrofago per 4 ore, indicando che sono i macrofagi fagocitici (Figura 3 B). una funzione di Mer sui macrofagi è quella di riconoscere e mediare la fagocitosi delle cellule apoptotiche attraverso la molecola di bridging, Gas6. Per testare la percentuale di efferocitosi attribuita dall'inibizione del Mer, abbiamo aggiunto anticorpi anti-Mer nella coltura per bloccare l'efferocitosi mediata da Mer. L'anticorpo Mer blocca l'efferocitosi macrofage in modo dose-dipendente (Figura 3C, Figura 3D) e il blocco complessivo può tenere conto di circa il 30% dell'efficienza dell'efferocitosi nell'impostazione corrente (Figura 3) , Questi dati sono stati confermati anche nel nostro precedente studio con Mer Knockout macrofagi13. Abbiamo poi testato l'efficienza di inibizione con la nuova FDA approvato inibitore del recettore TAM, RXDX-106, che inibisce tutti i recettori TAM con diverse affinità (Axl > > Tyro3 > Mer). RXDX-106 è stato aggiunto nella coltura dei macrofage 2 ore prima della co-incubazione con i timociti apoptotici. Come mostrato nella Figura 4, rxdx-106 ha inibito l'efferocitosi macrofage in modo dipendente dalla dose. La concentrazione di inibizione satura era di circa 100 nM (Figura 4, linea solida), una concentrazione che sembra essere più efficace della carenza di Mer (Figura 4 linea tratteggiata) o dell'anticorpo Mer (Figura 3, pannello D) da solo. Poiché il macrofago esprime tutti e tre i recettori TAM sulla superficie16, si prevede di vedere che le concentrazioni più elevate di rxdx-106 (oltre 100 nm) bloccherà tutti e tre i recettori, e quindi, sarà più efficace nel bloccare l'efferocitosi rispetto bersaglio di un singolo recettore TAM, Mer.

Figure 1
Figura 1 . Percentuale di fagocitosi di timociti apoptotici da macrofagi peritoneali. I timociti apoptotici sono stati indotti incubando con 1 mm di staurosporina per 4 h e aggiunti in coltura macrofage ad un rapporto come indicato nei pannelli di figura: (a) 1:0; B) 1:1; C) 1:2; D) 1:4; (E) 1:6; (F) 1:8; (G) 1:10; (H) 1:12. I dati sono stati acquisiti con un citometro a flusso. Percentuale di macrofagi fagocitici è stata analizzata utilizzando il software associato al citometro di flusso. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 2
Figura 2 . Analisi microscopica dell'efferocitosi. L'efferocitosi è stata preparata come nella Figura 1. I macrofagi fagocitici sono stati macchiati in situ sulla piastra con CD11b-PE, fissati con paraformaldeide, e valutati. Le immagini sono state acquisite utilizzando il microscopio fluorescente e analizzate con il software associato al microscopio. Gli inserimenti rappresentativi sono stati ingranditi digitalmente e mostrati di seguito in ogni immagine. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 3
Figura 3 . Inibizione dell'efferocitosi del macrofage peritoneale da parte di un anticorpo anti-Mer. Le cellule apoptotiche sono state preparate e co-coltivate con i macrofagi per 4 h come descritto nel protocollo. Anti-Mer AB è stato aggiunto nella coltura macrofage immediatamente prima della co-coltura con cellule apoptotiche. I macrofagi fagocitici sono stati poi staccati e macchiati con anticorpi anti-topo CD11b-PE su ghiaccio per 20 min. i dati sono stati acquisiti e analizzati come nella Figura 1. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

Figure 4
Figura 4 . RXDX-106 inibizione mediata di efferocitosi macrofage. L'efferocitosi è stata impostata come descritto nella Figura 3. RXDX-106 è stato aggiunto due ore prima della co-coltura con thymocytes apoptotici. I macrofagi peritoneali di Mer-deficienti sono stati preparati in modo analogo e sono serviti come gruppo di controllo. I dati sono stati acquisiti e la percentuale di macrofagi fagocitici è stata recintata su CD11b cellule positive e analizzata utilizzando il software del citometro di flusso. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.

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Discussion

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L'apoptosi è un processo di morte cellulare altamente conservato che coinvolge molte cascate di segnale e induce l'espressione proteica, la secrezione e il trasporto. L'apoptosi è spesso associata a cambiamenti della morfologia cellulare17. Le cellule apoptotiche rilasciano attivamente citochines e chemokine che attraggono i fagociti per migrare al sito e avviare il processo di engulfment, un percorso estremamente complesso sotto stretto controllo18. Dall'altro lato, la morte delle cellule necrotiche rilascia segnali di pericolo che attivano risposte infiammatorie1. La clearance difettosa o prolungata delle cellule apoptotiche porterà a necrosi secondaria di queste cellule19. Pertanto, il tempismo nell'induzione dell'apoptosi è molto critico nell'esperimento. Ci sono numerosi modi per indurre l'apoptosi cellulare20. Tuttavia, la durata e la forza dell'induzione sono dipendenti dal tipo di cella. Si consiglia di impostare un esperimento di titolazione per determinare la condizione ottimale del massimo (90-95%) produzione di apoptosi. Il kit di rilevamento apoptotico Annexin-V/7-AAD è stato utilizzato e le istruzioni sono state seguite nel nostro laboratorio per valutare l'efficienza apoptotica. Il nostro laboratorio ha provato due modi diversi per indurre l'apoptosi di timociti in passato. La radiazione gamma sembra essere un metodo migliore, in quanto non ha residui chimici nella cultura e induce poche morti di cellule necrotiche. Esponiamo i timociti a 500 rad di g-Radiation seguiti da cultura 4-h nel medium RPMI1640. Abbiamo osservato circa 95% di timociti apoptotici13. Quando un radiatore non è disponibile, abbiamo indotto i timociti a sottoporsi a apoptosi con 1 μm di staurosporina nella coltura per 4 h (passo 1,15). Le cellule primarie sono generalmente più sensibili all'induzione apoptosi. Sono inoltre necessarie ampie fasi di lavaggio per rimuovere le sostanze chimiche dalla cultura prima della co-coltura con i fagociti. Ci sono molti modi per etichettare le cellule apoptotiche. Anche se la tossicità è stata associata ad alta concentrazione, CFSE è mantenuto in modo molto efficiente all'interno del citoplasma quando accuratamente ottimizzato21. pHrodo è un colorante sensibile agli acidi, che aumenta in fluorescenza come il pH dell'ambiente diminuisce. A causa del basso pH del phagolysosome, le cellule apoptotiche phagocitizzate possono essere facilmente distinte dalle cellule apoptotiche fisicamente attaccate ma non inghiottite nel saggio22.

Numerosi recettori superficiali (recettori TAM, recettore mannosio, integrine (CD11b/CD18), recettori scavenger, recettori FC, et al) permettono ai fagociti di distinguere l'auto dagli agenti patogeni e discriminare le risposte successive23. Diversi recettori lavorano insieme per terminare un processo piuttosto complesso. Il recettore/i bloccante (i) provoca probabilmente una parziale inibizione della fagocitosi. I macrofagi primari possono essere preparati da diverse risorse con vari metodi (macrofagi derivati dal midollo osseo, macrofagi peritoneali, macrofagi della milza, et al.). Il vantaggio dei macrofagi indotta da tioglycollato è il fenotipo fagocitico distorto dei macrofagi; lo svantaggio è che il tioglicolato deve essere invecchiato al buio per almeno 3 mesi. Tuttavia, la soluzione di tioglicolato ha una durata di conservazione di 2 anni. Uno stock costante della soluzione dovrebbe superare questo svantaggio. Nella preparazione dei macrofagi peritoneali, la quantità di globuli rossi nella raccolta peritoneale del macrofago non dovrebbe influenzare l'esperimento, dal momento che stanno per essere lavati via insieme alle cellule galleggianti dopo 2 h di coltura dei macrofagi. Una grande quantità di globuli rossi (pellet visibile) può richiedere un trattamento con tampone di lisi ACK. I macrofagi tendono ad aderire strettamente alla superficie della coltura. In letteratura sono stati citati diversi metodi per staccare le cellule di adesione dalla superficie24. Il distacco basato su enzimi produce i più alti livelli di recupero cellulare, ma può danneggiare i recettori superficiali, compromettere la funzione delle cellule e le analisi associate. L'alterazione dei recettori superficiali può influenzare anche l'analisi della citometria a flusso basata sul recettore. La lidocaina provoca la morfologia cellulare per passare a una conforma più sferica a causa del blocco dei canali ionici di calcio25. È il modo migliore per staccare i macrofagi dalla superficie senza danni evidenti nel nostro esperimento.

I macrofagi contenenti cellule apoptotiche possono essere analizzati mediante saggi a base di citometria a flusso o a base di microscopio. FACS può essere applicato per analizzare un gran numero di cellule in breve tempo e può identificare ulteriormente sottotipi di cellule per colorazione differenziale con anticorpi contro la superficie specifica o proteine citoplasmatiche. Una concentrazione ottimale (rapporto) dei numeri di cellule apoptotiche nel sistema di co-coltura può anche essere decisa dall'analisi FACS. L'analisi microscopica ha limitazioni per quanto riguarda i numeri di cella e la colorazione differenziale rispetto all'analisi FACS. Tuttavia, la microscopia fluorescente fornisce informazioni approfondite. L'analisi microscopica dell'fiamme dei macrofagi delle cellule apoptotiche è essenziale per indagare la capacità e la cinetica dei macrofagi per ingerire le cellule apoptotiche. Un lasso di tempo di tutta la progressione di ingestione può fornire informazioni dettagliate su quanto tempo ci vuole per inghiottire una cellula apoptotica, e quante cellule apoptotiche possono un singolo macrofage ingerire simultaneamente. I macrofagi fagocitici possono anche essere analizzati da Western blot per indagare sulle molecole di segnalazione regolate dal processo di fiamme. I profili di espressione genica associati a questo processo possono essere valutati in tempo reale dalla PCR.

Infine, questo protocollo fornisce una piattaforma di base nell'analisi sperimentale dell'efferocitosi. Altri tipi di cellule (cellule dendritiche, cellule mesangiali, cellule epiteliali) possono anche funzionare per l'assorbimento delle cellule apoptotiche nei loro siti residenziali. Quelle cellule hanno preferenze nell'utilizzo di diversi recettori per riconoscere e avviare il processo di clearance delle cellule apoptotiche2. L'efficienza fagocitica complessiva può essere influenzata da diversi fattori, tra cui fattori specifici sperimentali e di tipo cellulare. I risultati variabili riportati in letteratura sono probabilmente dovuti a 1) durata della co-coltura; 2) risorsa e preparazione di fagociti e cellule apoptotiche; 3) metodi per dissociare le cellule apoptotiche dai fagociti. Il protocollo qui descritto può applicarsi al potenziale fagocitico di altre cellule. L'ottimizzazione può essere necessaria per massimizzare il potenziale fagocitico delle cellule bersaglio. Abbiamo analizzato la fagocitosi di cellule mesangiali renali di thymociti apoptotici generati nello stesso modo come descritto in questo protocollo. I neutrofili giocano un ruolo chiave nel sistema immunitario innato attraverso l'eliminazione dei patogeni. La fagocitosi dei neutrofili di batteri o particelle etichettati può essere analizzata mediante citometria a flusso26. Tuttavia, i neutrofili hanno un'emivita molto breve (6-8 h) e la fagocitosi dei neutrofili di batteri o funghi si verifica in pochi secondi a minuti27,28.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

La ricerca nel laboratorio di Shao è supportata da Research premio innovativo dal Collegio di medicina e il premio Junior facoltà pilota del dipartimento di medicina interna, Università di Cincinnati e Grant DK K01_095067 da NIDDK/NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13, (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28, (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14, (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172, (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80, (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123, (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133, (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411, (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68, (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31, (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112, (4), 935-945 (2008).
Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi
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Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

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