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Immunology and Infection

Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos

doi: 10.3791/59731 Published: May 24, 2019

Summary

Aquí presentamos un protocolo para preparar los timocitos apopónticos y los macrófagos peritoneal y analizar la eficiencia de la efervocitosis y el bloqueo específico por inhibidores de los timocitos apopónticos. Este protocolo tiene una amplia aplicación en el aclaramiento mediado por células de otras partículas, incluyendo granos artificiales y bacterias.

Abstract

La apoptosis celular es un proceso natural y desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario, la regulación homeostática, la inducción de la tolerancia inmune y la resolución de la inflamación. La acumulación de desechos apopónticos en el cuerpo puede desencadenar respuestas inflamatorias crónicas que conducen a enfermedades autoinmunes sistémicas con el tiempo. El aclaramiento de células apopónticas deterioradas se ha implicado en una variedad de enfermedades autoinmunes. El aclaramiento apopético es un proceso complejo que raramente se detecta en condiciones fisiológicas. Implica abundantes receptores de superficie y moléculas de señalización. El estudio del proceso de aclaramiento de la célula apopéctica proporciona mecanismos moleculares perspicaces y subsiguientes respuestas biológicas, que pueden conducir al desarrollo de nuevas terapias. Aquí describimos los protocolos para la inducción de los timocitos apopónticos, la preparación de los macrófagos peritoneales y el análisis del aclaramiento de las células apopónticas por citometría de flujo y microscopía. Todas las células se someten a la apoptosis en una cierta etapa, y muchas células residenciales y circulantes pueden captación de desechos apopético. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí se puede utilizar en muchas aplicaciones para caracterizar la Unión de la célula apopóntica y la ingestión por muchos otros tipos de células.

Introduction

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Nuestro cuerpo genera 1-10 mil millones de células apopónticas sobre una base diaria. Se debe borrar un número tan grande de células apopónticas de manera que las respuestas inmunitarias permanezcan en reposo. Para asegurar el aclaramiento de las células apopónticas de manera oportuna, numerosos tipos de células residentes de tejido y células circulantes desarrollan mecanismos para engullir las células apopónticas1. Regulación disfuncional de la apoptosis se ha implicado en la aparición y progresión de diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunidad2. La apoptosis también desempeña un papel crítico en la patogénesis del desarrollo del cáncer y su posterior resistencia a los tratamientos convencionales3,4. La eliminación de las células apopónticas generalmente promueve una respuesta antiinflamatoria, que puede estar relacionada con la tolerancia inmunológica5. La alteración del aclaramiento de las células apopónticas impulsa la autoinmunización y contribuye al desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas tanto en humanos como en ratones6.

Cuando las células se someten a la apoptosis, exponen la fosfatidilserina (PtdSer) desde el prospecto interno hasta el prospecto externo de la membrana. El PtdSer será reconocido por los fagocitos a través de los receptores de la superficie. Se han identificado más de una docena de receptores para reconocer y/o facilitar el internalización de las células apopónticas. En general, hay al menos tres tipos de receptores de superficie implicados en el aclaramiento de la célula apopóntica: receptores tethering, reconocer las células apopónticas; receptores de cosquillas, iniciar el engulfment; receptores de Chaperos, facilitan todo el proceso7. Los receptores de tirosina quinasas TAM (TAM RTKs) constan de Tyro-3, AXL y MER y se expresan principalmente por células mieloide del sistema inmunitario8. La función principal de TAM RTKs es servir como receptores de tethering, facilitando la eliminación fagocitaria de células apopónticas y escombros. Nuestro grupo ha estudiado el aclaramiento de células apopécticas mediadas en el entorno de autoinmunidad durante muchos años. El crecimiento proteico dependiente de la vitamina K, proteína específica 6 (Gas6) y proteína S (pros) se une y activa los receptores TAM9,10. Gas6 se produce en el corazón, los riñones y los pulmones. ProS se produce principalmente en el hígado11. TAM reconoce las células apopónticas de tal manera que la terminal N de Gas6/ProS se une al PtdSer en una célula apopéctica y el terminal C de Gas6/ProS se une a los receptores TAM que anclaron en la superficie de los fagocitos. Junto con los otros receptores, el internalización de las células apopónticas se produce12. Aunque Mer puede unirse a los ligandos ProS y Gas6, descubrimos que Gas6 parece ser el ligando único para la fagocitosis de macrófagos mediada por Mer de las células apopónticas, que pueden ser bloqueadas por el anticuerpo anti-Mer13. Los macrófagos son fagocitos profesionales. El aclaramiento rápido de las células apopónticas por macrófagos es importante para la inhibición de la inflamación y las respuestas autoinmunes contra antígenos intracelulares. El receptor de la tirosina quinasa del Mer es crítico para el internalización del macrófago y el aclaramiento eficiente de las células apopónticas14. En el bazo del ratón, Mer expresa principalmente en la zona marginal y los macrófagos corporales tangibles13.

El protocolo presentado aquí describe un método básico para inducir la apoptosis celular y demostrar maneras de medir el proceso y la eficiencia de la efervocitosis. Estos protocolos pueden ser fácilmente adaptados para estudiar la efferocitosis por otros tipos de células en el internalización de las células apopónticas de diferentes orígenes.

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Protocol

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Ratones experimentales fueron criados y mantenidos en nuestra colonia de ratones. Todo el trabajo en animales se llevó a cabo de acuerdo con las pautas del Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Cincinnati.

1. preparación de los timocitos apopónticos etiquetados como CFSE

  1. Eutanasia dos ratones C57/B6 ingenuos por inhalación de CO2 durante 10 min y diseccionar para abrir la cavidad torácica, remover (extraer) el timo con fórceps curvados de punta fina en un plato de Petri de cultivo de tejido que contenga 10 ml de medio RPMI1640.
  2. Obtenga la suspensión de una sola célula moliendo todo el timo contra dos extremos esmerilados de los portaobjetos del microscopio y luego filtre la suspensión a través del colador de células de 100 μm.
  3. Recoja la suspensión de timus de 10 mL en un tubo de 50 mL y centrifugue a 300 x g durante 5 min.
  4. Retire el sobrenadante, resupend en 40 mL de 1x PBS, y cuente los números celulares con un hemociómetro.
  5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
  6. Resuspendio en 20 mL de 1x PBS en un tubo de 50 mL como una suspensión de célula única con hasta 2 x 108 células (si más de 2 x 108 células, Resuspender el resto de las células en otros 20 ml de 1 x PBS en un tubo de 50 ml diferente).
  7. Hacer 5 μM de CFSE en el mismo volumen (20 mL) de 1x PBS en un tubo separado de 50 mL pipeteando 40 μL de la solución de la bolsa de CFSE (2,5 mM) en 20 mL de 1x PBS y mezclar bien invirtiendo el tubo 2-3 veces.
  8. Añadir los 20 mL de CFSE del paso 1,7 en los 20 mL de suspensión celular del paso 1,6 (la concentración final de CFSE es ahora de 2,5 μM).
    Nota: para cada suspensión de celda de 20 mL, se necesita un tubo de CFSE de 20 mL.
  9. Invierta la célula y el tubo de mezcla de CFSE 2-3 veces e incube la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente durante un máximo de 2 min, luego detenga la reacción añadiendo 10 mL de suero de caballo inactivado por calor.
  10. Centrifugar la mezcla de tubos de 50 mL a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: Si el etiquetado CFSE es exitoso, el pellet de células se convertirá en color amarillo claro.
  11. Retire el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 40 mL de 1x PBS y cuente los números celulares con un hemociómetro.
  12. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
  13. Lavar el pellet de la célula de nuevo con 40 mL de medio RPMI1640.
  14. Retire el sobrenadante y las células de resuspendio con RPMI1640 medio de cultivo de tejido (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% de FBS (calor inactivado), 20 mM de glutamina y 1x Pen/Strep) a una concentración de 7 x 106 células/ml en un plato de cultivo de tejido de 100 mm.
    Nota: si se obtienen más células, se necesita un plato de cultivo de tejido de 100 mm por separado.
  15. Añadir staurosporina en el cultivo de la suspensión celular a una concentración final de 1 μM y cultivo durante 4 h a 37 ° c en una incubadora de cultivo de tejidos suministrada con 5% de CO2.

2. preparación de los macrófagos peritoneales

  1. Inyectar dos ratones C57B6 (o cualquier ratón manipulado por genes en el laboratorio) intraperitonealmente con 1 mL de tioglycollato envejecido al 3% en el día 0.
  2. Eutanasia los ratones en el día 5 como en el paso 1,1, corte y cáscara abrir la piel abdominal pero dejar el peritoneo intacto. Enjuague la cavidad peritoneal empujando rápidamente 10 mL de tampón de lavado (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) en la cavidad peritoneal utilizando una jeringa de 10 mL unida con una aguja de 18 G.
  3. Recupere el tampón de lavado lentamente con la misma aguja/jeringa y recoja el tampón de lavado en un tubo de 50 mL (los detalles se refieren al artículo15del laboratorio de Janssen).
  4. Lavar el gavaje peritoneal dos veces con 1x PBS, resuspender los macrófagos peritoneal en RPMI1640 medio de cultivo de tejido a una densidad de 2 x 106 células/ml y alícuota 500 μL en cada pozo de la placa de 24-well. Dejar la placa en una incubadora de cultivo de tejido durante 2 h.
  5. Retire las células flotantes aspirando y reemplazando con 500 μL de medio de cultivo fresco, dos veces.
  6. Opcionalmente, añadir inhibidor de la tirosina del receptor TAM, RXDX-106, en las concentraciones indicadas en las leyendas de la figura en cada pozo de la cultura macrófagos e incubar para otro 2 h.

3. cocultivo de macrófagos peritoneal con timocitos apopónticos

  1. Recoger los timocitos apopónticos del paso 1 y lavar tres veces con RPMI1640 medio. La eficiencia de la inducción apopóntica se puede medir en esta etapa con el kit anexion V/7-AAD.
  2. Distribuir 0-12 x 106 células (en 500 μl medio) en cada pozo de los cultivos de macrófagos de protocolo #2, de acuerdo con la disposición experimental (por ejemplo, ver figura 1). Esto hace que todo el volumen de cultivo de 1 mL en cada pozo de la placa de 24-well. Añadir el anticuerpo de bloqueo en la cultura inmediatamente antes de la adición de los timocitos apopónticos.
  3. Cultivo de la mezcla celular a 37 ° c durante 4 h en una incubadora de cultivo de tejidos suministrada con 5% de CO2.
  4. Lave cada pozo de la cultura con 1x PBS (que contiene 500 μM EDTA) dos veces para eliminar las células apopónticas de flotación libre.
  5. Mancha los macrófagos atados con placas con CD11b-PE en esta etapa.
    1. Lave los macrófagos atados con placas con tampón de tinción (1x PBS, 1% BSA) una vez.
    2. Añadir 200 μL de tampón de tinción que contenga 2 μL de CD11b-PE en cada pozo.
    3. Incubar la placa a 4 ° c durante 20 min.
    4. Lave cada pozo de la placa tres veces con el tampón de tinción.
    5. Añadir 200 μL de tampón de tinción y proceder a la placa de análisis de imagen bajo el microscopio fluorescente.
  6. Alternativamente, separe los macrófagos ligados a placas añadiendo 1 mL de lidocaína al 1% en PBS e incubando durante 10 min a 37 ° c.
  7. Separe los macrófagos encuadernado en placa con pipeteo repetitivo.
  8. Transfiera la suspensión de macrófagos a un tubo FACS de 5 mL de fondo redondo individual de cada pozo de la placa de 24-well.
  9. Centrifugar a 300 x g durante 5 min.
  10. Extraer el sobrenadante y añadir 200 μL de tampón de tinción que contenga 2 μL de CD11b-PE (dilución 1:200 en tampón de tinción).
  11. Incubar la suspensión celular en tampón de tinción a 4 ° c durante 20 min.
  12. Lavar la suspensión de la célula dos veces con tampón de tinción.
  13. Añadir 200 μL de tampón de tinción y proceder al análisis de FACS con un CITOMETRO de caudal y analizar el porcentaje de macrófagos positividad de la CFSE.

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Representative Results

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Análisis de la enfaración peritoneal de los timocitos apópticos por macrófagos. Los macrófagos y las células apopónticas peritoneal se prepararon y cocultivaron como se describe en el protocolo. Los macrófagos fueron separados y manchados con el anticuerpo anti-CD11b de PE conjugada durante 20 min en hielo. Los macrófagos fueron lavados y procesados en un CITOMETRO de flujo. Como se ve, no hay macrófago positivo de CFSE en el cuadrante inferior derecho cuando no se agregaron células apopónticas en la cultura (figura 1A y figura 2, primer panel). Los macrófagos peritoneal estimulados por el tioglycollate tienen la capacidad variable de engullir las células apopónticas. Hasta un 30% de los macrófagos mostraron positivo en el canal CFSE, indicando que han ingerido células apopécticas etiquetadas con CFSE en este experimento (figura 1). Vale la pena señalar que los macrófagos positivos de CFSE se extienden en el cuadrante inferior derecho debido a diferentes intensidades, lo que indica que el número de células apopónticas dentro de los macrófagos es diferente. Por lo tanto, la observación microscópica del internalización de macrófagos de las células apopónticas es esencial para investigar la capacidad de los macrófagos para ingerir células apopónticas (figura 2). La mayor proporción de células apopónticas a los macrófagos no sólo aumenta el número de macrófagos que ingieren las células apopónticas, sino que también mejora la capacidad de los macrófagos para ingerir más células apopónticas (figura 2).

Inhibición dependiente de la dosis de efferocitosis por obstrucción de Mer.
En otro conjunto de experimentos, descubrimos que alrededor del 15% de los macrófagos se convirtieron en un positivo de CFSE cuando los thymocitos apopécticos etiquetados con CFSE (ración de 6:1) fueron añadidos a la cultura de los macrófagos durante 4 h, indicando que son los macrófagos fagocíticos (figura 3 B). una función de Mer en los macrófagos es reconocer y mediar la fagocitosis de las células apopónticas a través de la molécula puente, Gas6. Para probar el porcentaje de efervocitosis atribuida por la inhibición de Mer, agregamos anticuerpos anti-Mer en la cultura para bloquear la efervocitosis mediada por Mer. El anticuerpo de Mer bloquea la efervocitosis de los macrófagos de manera dependiente de la dosis (figura 3C, figura 3D) y el bloqueo general puede tener en cuenta alrededor del 30% de la eficiencia de la efferocitosis en el ajuste actual (figura 3) , Estos datos también se confirmaron en nuestro estudio anterior con Mer Knockout macrófagos13. Luego probamos la eficiencia de la inhibición con el inhibidor del receptor TAM aprobado recientemente por la FDA, RXDX-106, que inhibe todos los receptores TAM con afinidades diferentes (AXL > > Tyro3 > mer). RXDX-106 fue añadido al cultivo de macrófagos 2 horas antes de la co-incubación con timocitos apopónticos. Como se muestra en la figura 4, rxdx-106 inhibió la efervocitosis de macrófagos de una manera dependiente de la dosis. La concentración de inhibición saturada fue de aproximadamente 100 nM (figura 4, línea sólida), una concentración que parece ser más eficaz que la deficiencia de Mer (figura 4 línea punteada) o anticuerpo de Mer (figura 3, panel D) solo. Dado que el macrófago expresa los tres receptores TAM en la superficie16, se espera que las concentraciones más altas de rxdx-106 (más de 100 nm) bloqueen los tres receptores y, por lo tanto, sean más eficaces en el bloqueo de la efferocitosis que el apuntando a un solo receptor TAM, Mer.

Figure 1
Figura 1 . Porcentaje de fagocitosis de timocitos apopónticos por macrófagos peritoneal. Los timocitos apopécticos fueron inducidos por incubando con 1 mm de staurosporina durante 4 h y añadidos al cultivo de macrófagos en una proporción como se indica en los paneles de figuras: (a) 1:0; (B) 1:1; (C) 1:2; (D) 1:4; (E) 1:6; (F) 1:8; (G) 1:10; (H) 1:12. Los datos se adquirieron con un CITOMETRO de flujo. Se analizó el porcentaje de macrófagos fagocíticos utilizando el software asociado con el CITOMETRO de flujo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 . Análisis microscópico de efervocitosis. La efervocitosis se preparó como en la figura 1. Los macrófagos fagocíticos fueron manchados in situ en la placa con CD11b-PE, fijados con paraformaldehído, y evaluados. Las imágenes se adquirieron utilizando el microscopio fluorescente y se analizaron con el software asociado con el microscopio. Las inserciones representativas se ampliaron digitalmente y se muestran a continuación en cada imagen. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 . Inhibición de la efervocitosis peritoneal de macrófagos por un anticuerpo anti-Mer. Las células apopécticas fueron preparadas y cocultivadas con macrófagos durante 4 h como se describe en el protocolo. Anti-Mer AB se añadió al cultivo de macrófagos inmediatamente antes de la co-cultura con células apopónticas. Los macrófagos fagocíticos fueron separados y manchados con anticuerpo anti-ratón CD11b-PE en hielo durante 20 min. los datos fueron adquiridos y analizados como en la figura 1. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 . RXDX-106 mediada por la inhibición de la efervocitosis de macrófagos. La efervocitosis se estableció como se describe en la figura 3. RXDX-106 se añadió dos horas antes de la co-cultura con thymocitos apopético. Los macrófagos peritoneales deficientes de Mer se prepararon de manera similar y sirvieron como grupo de control. Se adquirieron datos y el porcentaje de macrófagos fagocíticos se ha bloqueado en células positivas CD11b y se ha analizado utilizando el software del CITOMETRO de flujo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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La apoptosis es un proceso de muerte celular altamente conservado que involucra muchas cascadas de señal e induce la expresión de proteínas, secreción, y el transporte. La apoptosis se asocia a menudo con los cambios de morfología celular17. Las células apopónticas liberan activamente citocinas y quimioquinas que atraen a los fagocitos para emigrar al sitio e iniciar el proceso de engulfment, una vía extremadamente compleja bajo control estricto18. Por otro lado, la muerte celular necrótica libera señales de peligro que desencadenan respuestas inflamatorias1. El aclaramiento defectuoso o prolongado de las células apopónticas conducirá a la necrosis secundaria de estas células19. Por lo tanto, el tiempo en la inducción de apoptosis es muy crítico en el experimento. Hay numerosas maneras de inducir la apoptosis de la célula20. Sin embargo, la duración y la fuerza de la inducción son dependientes del tipo de célula. Se recomienda configurar un experimento de valoración para determinar la condición óptima del máximo (90-95%) producción de apoptosis. Se utilizó el kit de detección de apoptóticos Anexiin-V/7-AAD y se siguieron las instrucciones en nuestro laboratorio para evaluar la eficiencia apoptótica. Nuestro laboratorio ha intentado dos maneras diferentes de inducir la apoptosis de los thymocitos en el pasado. La radiación gamma parece ser un método mejor, ya que no tiene residuos químicos en la cultura e induce pocas muertes de células necróticas. Exponemos los thymocitos a 500 Rad de radiación g seguido de la cultura 4-h en medio RPMI1640. Observamos acerca de 95% timocitos apopético13. Cuando un radiador no está disponible, inducimos thymocitos a someterse a apoptosis con 1 μM de staurosporina en la cultura para 4 h (paso 1,15). Las células primarias son generalmente más sensibles a la inducción de apoptosis. También se requieren pasos de lavado extensivos para eliminar los productos químicos del cultivo antes de la co-cultura con fagocitos. Hay muchas maneras de etiquetar las células apopécticas. Aunque la toxicidad se ha asociado con alta concentración, el CFSE se retiene muy eficientemente dentro del citoplasma cuando se optimiza cuidadosamente21. pHrodo es un tinte sensible al ácido, que aumenta la fluorescencia a medida que disminuye el pH del medio ambiente. Debido al bajo pH del fagolisosome, las células apopécticas fagocitizadas pueden distinguirse fácilmente de las células apopécticas conectadas físicamente pero no engullizadas en el ensayo22.

Numerosos receptores de superficie (receptores TAM, receptor de manosa, integrinas (CD11b/CD18), receptores de carroñero, receptores FC, et al) permiten a los fagocitos distinguirse de los patógenos y discriminar las respuestas subsiguientes23. Diferentes receptores trabajan juntos para terminar un proceso bastante complejo. El receptor (es) de bloqueo probablemente resulte en una inhibición parcial de la fagocitosis. Los macrófagos primarios se pueden preparar a partir de diferentes recursos con diversos métodos (macrófagos derivados de la médula ósea, macrófagos peritoneales, macrófagos del bazo, et al.). La ventaja de los macrófagos inducidos por el tioglycollate es el fenotipo fagociítico sesgado de los macrófagos; la desventaja es que el tioglicato debe ser envejecido en la oscuridad durante al menos 3 meses. Sin embargo, la solución de tioglycollate tiene una vida útil de 2 años. Un stock constante de la solución debe superar esta desventaja. En la preparación de los macrófagos peritoneales, la cantidad traza de glóbulos rojos en la colección de macrófagos peritoneal no debe afectar el experimento, ya que van a ser lavados junto con las células flotantes después de 2 h de cultivo de macrófagos. Una gran cantidad de glóbulos rojos (pellet visible) puede requerir tratamiento con tampón de lising ACK. Los macrófagos tienden a adherirse firmemente a la superficie de cultivo. En la literatura se han citado diferentes métodos para separar las células de adhesión de la superficie24. El desprendimiento basado en enzimas produce los niveles más altos de recuperación celular, pero puede dañar los receptores de la superficie, deteriorar la función celular y los análisis asociados. La alteración de los receptores de superficie también puede afectar el análisis de citometría de flujo basada en receptores. La lidocaína hace que la morfología celular cambie a una conformación más esférica debido al bloqueo de los canales de iones de calcio25. Es la mejor manera de separar los macrófagos de la superficie sin daños notables en nuestro experimento.

Los macrófagos que contienen células apopónticas pueden analizarse mediante ensayos basados en citometría de flujo o basados en microscopios. FACS se puede aplicar para analizar un gran número de células en poco tiempo y puede identificar más subtipos de células mediante la tinción diferencial con anticuerpos contra la superficie específica o proteínas citoplásmicas. Una concentración óptima (ratio) de los números de células apopónticas en el sistema de co-cultivo también puede ser decidida por el análisis de FACS. El análisis microscópico tiene limitaciones en cuanto a números celulares y manchas diferenciales en comparación con el análisis de FACS. Sin embargo, la microscopía fluorescente proporciona información detallada. El análisis microscópico del enfareo de macrófagos de las células apopónticas es esencial para investigar la capacidad y la cinética de los macrófagos para ingerir células apopónticas. Un lapso de tiempo de toda la progresión de la ingestión puede proporcionar información detallada sobre cuánto tiempo se tarda en engullir una célula apopóntica, y cuántas células apopónticas pueden ingerir un solo macrófago simultáneamente. Los macrófagos fagocíticos también pueden ser analizados por Western blot para investigar las moléculas de señalización reguladas por el proceso de internalización. Los perfiles de expresión génica asociados con este proceso se pueden evaluar mediante PCR en tiempo real.

Por último, este protocolo proporciona una plataforma básica en el análisis experimental de la efervocitosis. Otros tipos celulares (células dendríticas, células mesangiales, células epiteliales) también pueden funcionar para la captación de células apopónticas en sus sitios residenciales. Esas células tienen preferencias en la utilización de diferentes receptores para reconocer e iniciar el proceso de aclaramiento celular apopético2. La eficiencia fagocitaria general puede estar influenciada por varios factores, incluyendo factores específicos experimentales y de tipo celular. Los resultados variables reportados en la literatura se deben probablemente a 1) duración de la co-cultura; 2) recursos y preparación de fagocitos y células apopónticas; 3) métodos para disociar las células apopónticas de los fagocitos. El protocolo descrito aquí puede aplicarse al potencial fagocítico de otras células. La optimización puede ser necesaria para maximizar el potencial fagociítico de las células diana. Hemos analizado la fagocitosis renal de células mesangiales de los timocitos apopónticos generados de la misma manera como se describe en este protocolo. Los neutrófilos juegan un papel clave en el sistema inmune innato a través de la eliminación de patógenos. La fagocitosis de neutrófilos de bacterias o partículas etiquetadas puede analizarse mediante citometría de flujo26. Sin embargo, los neutrófilos tienen una vida media muy corta (6-8 h) y la fagocitosis de neutrófilos de bacterias u hongos se produce en cuestión de segundos a minutos27,28.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La investigación en el laboratorio de Shao es apoyada por la investigación de premio innovador de la Facultad de medicina y el Premio de piloto de la Facultad Junior del Departamento de medicina interna, Universidad de Cincinnati y Grant DK K01_095067 de NIDDK/NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13, (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28, (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14, (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172, (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80, (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123, (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133, (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411, (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68, (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31, (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112, (4), 935-945 (2008).
Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos
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Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

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