Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Experimentell analys av apoptotiska thymocyte Engulfment av macrophages

doi: 10.3791/59731 Published: May 24, 2019

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda apoptotiska tymocyter och peritonealdialys makro Fager och analysera effektiviteten av efferocytosis och den specifika inhibitor-medierad blockering av apoptotiska tymocyter engulfment. Detta protokoll har en bred tillämpning i cell-medierad clearance av andra partiklar, inklusive konstgjorda pärlor och bakterier.

Abstract

Cell apoptos är en naturlig process och spelar en kritisk roll i embryonal utveckling, homeostatiska reglering, immun tolerans induktion, och upplösning av inflammation. Ansamling av apoptotiska skräp i kroppen kan utlösa kroniska inflammatoriska reaktioner som leder till systemiska autoimmuna sjukdomar över tid. Nedsatt apoptotiska cell clearance har varit inblandad i en mängd olika autoimmuna sjukdomar. Apoptotiska clearance är en komplicerad process som sällan upptäcks under fysiologiska förhållanden. Det innebär rikliga ytreceptorer och signal molekyler. Att studera processen för apoptotiska cell clearance ger insiktsfulla molekyl ära mekanismer och efterföljande biologiska svar, vilket kan leda till utveckling av nya terapier. Här beskriver vi protokoll för induktion av apoptotiska tymocyter, beredning av peritonealdialys makro Fager, och analys av apoptotiska cell clearance av flödescytometri och mikroskopi. Alla celler kommer att genomgå apoptos vid ett visst Stadium, och många bostäder och cirkulerande celler kan upptag apoptotiska skräp. Därför kan det protokoll som beskrivs här användas i många program för att karakterisera apoptotiska cell bindning och intag av många andra cell typer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vår kropp genererar 1-10 miljarder apoptotiska celler på daglig basis. Ett sådant stort antal apoptotiska celler måste rensas på ett sätt som immun svaret förblir quiescent. För att säkerställa clearance av apoptotiska celler i tid, många typer av vävnad bosatta celler och cirkulerande celler utveckla mekanismer för att uppsluka apoptotiska celler1. Dysfunktionell reglering av apoptos har varit inblandad i uppkomsten och progressionen av olika inflammatoriska sjukdomar och autoimmunitet2. Apoptos spelar också en avgörande roll i patogenesen av cancer utveckling och dess efterföljande motstånd mot konventionella behandlingar3,4. Avlägsnande av apoptotiska celler främjar i allmänhet ett antiinflammatoriskt svar, som kan kopplas till immunologisk tolerans5. Störning av apoptotiska cell clearance driver själv immunisering och bidrar till utvecklingen av systemiska autoimmuna sjukdomar hos både människor och möss6.

När cellerna genomgår apoptos, de utsätter fosfatidylserin (PtdSer) från den inre broschyren till den yttre broschyren av membranet. PtdSer kommer sedan att kännas igen av fagocyter genom ytan receptorer. Över ett dussin receptorer har identifierats för att känna igen och/eller under lätta omvälvning av apoptotiska celler. I allmänhet finns det minst tre typer av ytreceptorer involverade i apoptotiska cell clearance: tjudra receptorer, erkänna apoptotiska celler; kittlande receptorer, initiera engulfment; chaperoning receptorer, under lätta hela processen7. TAM-receptortyrosinkinaser (TAM RTKs) består av TYRO-3, AXL, och Mer och uttrycks främst av myeloida celler i immun systemet8. Den primära funktionen för TAM RTKs är att fungera som tjudra receptorer, under lätta fagocytos avlägsnande av apoptotiska celler och skräp. Vår grupp har studerat TAM medierad apoptotiska cell clearance i fast ställandet av autoimmunitet i många år. Vitamin K-beroende protein tillväxt arrest specifikt protein 6 (Gas6) och protein S (ProS) binder till och aktiverar Tam-receptorer9,10. Gas6 produceras i hjärta, njurar och lungor. ProS produceras främst i levern11. TAM känner igen av apoptotiska celler på ett sådant sätt att N-terminalen av Gas6/Pros binder till ptdser på en apoptotiska cell och C-terminalen av Gas6/ProS binder till TAM-receptorer som förankrat på ytan av fagocyter. Tillsammans med de andra receptorerna, är omvälvning av apoptotiska celler12. Även om mer kan binda till både ligander ProS och Gas6, fann vi att Gas6 verkar vara den enda ligand för mer-medierad makrofag fagocytos av apoptotiska celler, som kan blockeras av anti-mer anti kropp13. Makro Fager är professionella fagocyter. Snabb Eli mineringar av apoptotiska celler av makro Fager är viktigt för hämning av inflammation och autoimmuna reaktioner mot intracellulära antigener. Mer receptor tyrosinkinas är kritisk för makro Fager omvälvning och effektivt clearance av apoptotiska celler14. I mus mjälte, uttrycker mer främst på marginella zonen och materiella kroppen makro Fager13.

Det protokoll som presenteras här beskriver en grundläggande metod för att inducera cell apoptos och Visa sätt att mäta processen och effektiviteten av efferocytos. Dessa protokoll kan lätt anpassas för att studera efferocytosis av andra cell typer i omvälvning av apoptotiska celler av olika ursprung.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Experimentella möss var uppfödda och underhållna i våra möss kolonin. Allt djur arbete utfördes enligt rikt linjerna från den institutionella djur omsorgs-och användnings kommittén (IACUC) vid University of Cincinnati.

1. beredning av CFSE märkt apoptotiska tymocyter

  1. Euthanize två naiva C57/B6 möss av CO2 inandning för 10 min och dissekera att öppna bröstet hålighet, ta bort (dra ut) brässen med böjda Fine-tip pincett i vävnad kultur petriskål innehåller 10 ml RPMI1640 medium.
  2. Få en enda cell SUS pension genom att mala hela brässen mot två frostade ändar av Mikroskop dia bilder och sedan filtrera SUS pensionen genom 100 μm cell sil.
  3. Samla in 10 mL thymussus pension i ett 50 mL-rör och centrifugera vid 300 x g i 5 min.
  4. Ta bort supernatanten, resuspendera i 40 mL 1x PBS, och räkna cell nummer med en hemocytometer.
  5. Centrifugera vid 300 x g i 5 min och ta bort supernatanten.
  6. Resuspendera i 20 mL 1x PBS i ett 50 mL-rör som en enda cell SUS pension med upp till 2 x 108 celler (om mer än 2 x 108 celler, omsuspendera resten av cellerna i en annan 20 ml 1 x PBS i en annan 50 ml tub).
  7. Gör 5 μM CFSE i lika stor volym (20 mL) 1x PBS i ett separat 50 mL-rör genom att Pipettera 40 μL CFSE-lagerlösning (2,5 mM) till 20 mL 1x PBS och blanda väl genom att Invertera röret 2-3 gånger.
  8. Tillsätt 20 mL CFSE från steg 1,7 till 20 mL cell SUS pension från steg 1,6 (den slutliga koncentrationen av CFSE är nu 2,5 μM).
    Anmärkning: för varje 20 mL cell SUS pension behövs en 20 mL CFSE-tub.
  9. Invertera cellen och CFSE blandnings röret 2-3 gånger och inkubera blandningen i mörker vid rums temperatur under högst 2 min, sedan stoppa reaktionen genom att tillsätta 10 mL Värmeinaktiverade häst serum.
  10. Centrifugera 50 mL-rörblandningen vid 300 x g i 5 min vid rums temperatur.
    Anmärkning: om CFSE märkning är framgångs rik, cell pellet blir ljusgult i färg.
  11. Ta bort supernatanten och omsuspendera cellpelleten i 40 mL 1x PBS och räkna cell numren med en hemocytometer.
  12. Centrifugera cell SUS pensionen vid 300 x g i 5 minuter och Kassera supernatanten.
  13. Tvätta cell pelleten igen med 40 mL RPMI1640-medium.
  14. Ta bort supernatanten och resuspendera celler med RPMI1640 vävnads odlings medium (RPMI1640 mM HEPES, 10% FBS (värme inaktiverat), 20 mM glutamin, och 1x Pen/STREP) vid en koncentration av 7 x 106 celler/ml i en 100 mm vävnad kultur mat rätt.
    Obs: om fler celler erhålls, en separat 100 mm vävnad kultur skålen kommer att behövas.
  15. Tillsätt staurosporine i cell SUS pension kulturen vid en slutlig koncentration av 1 μM och kultur för 4 h vid 37 ° c i en vävnads odling inkubator levereras med 5% CO2.

2. beredning av peritonealdialys makro Fager

  1. Injicera två C57B6-möss (eller några genmanipulerade möss i labbet) intraperitonealt med 1 mL 3% åldrat tioglykollat dag 0.
  2. Euthanize mössen på dag 5 som i steg 1,1, klippa och skala öppna buken huden men lämna bukhinnan intakt. Spola peritonealhålan genom att snabbt trycka 10 mL tvättbuffert (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) i peritonealhålan med en 10 mL spruta fäst med en 18 G nål.
  3. Hämta tvättbufferten långsamt med samma nål/spruta och samla upp tvättbufferten i ett 50 mL-rör (Detaljer hänvisar till Janssen Lab artikel15).
  4. Tvätta peritonealsondåldern två gånger med 1x PBS, omsuspendera peritonealmakrofager i RPMI1640 vävnads odlings medium med en densitet på 2 x 106 celler/ml och alikvot 500 μl i varje brunn av 24-brunnen plattan. Lämna plattan i en vävnadsinkubator för 2 h.
  5. Ta bort de flytande cellerna genom att aspirera och ersätta med 500 μL färskt odlings substrat, två gånger.
  6. Alternativt, tillsätt TAM receptor tyrosin hämmare, RXDX-106, vid koncentrationer som anges i figuren legender i varje brunn av makro Fager kulturen och inkubera i ytterligare 2 h.

3. samodling av peritoneala makro Fager med apoptotiska tymocyter

  1. Samla in apoptotiska thymocyter från steg 1 och tvätta tre gånger med RPMI1640 medium. Effektiviteten av apoptotisk induktion kan mätas i detta skede med Annexin V/7-AAD kit.
  2. Fördela 0-12 x 106 celler (i 500 μl medium) i varje brunn av makro Fager kulturer från protokoll #2, enligt den experimentella ordningen (t. ex. se figur 1). Detta gör hela odlings volymen på 1 mL i varje brunn av 24-brunn plattan. Tillsätt den blockerande anti kroppen i kulturen omedelbart före tillsats av apoptotiska tymocyter.
  3. Odla cell blandningen vid 37 ° c i 4 timmar i en inkubator för vävnads odling som levereras med 5% CO2.
  4. Tvätta varje brunn av kulturen med 1x PBS (som innehåller 500 μM EDTA) två gånger för att avlägsna de fritt flytande apoptotiska cellerna.
  5. Färga plattan-bundna makro Fager med CD11b-PE i detta skede.
    1. Tvätta de plattbundna makro Fager med färgbuffert (1x PBS, 1% BSA) en gång.
    2. Tillsätt 200 μL färgbuffert innehåll ande 2 μL CD11b-PE i varje brunn.
    3. Inkubera plattan vid 4 ° c i 20 min.
    4. Tvätta varje brunn av plattan tre gånger med infärgningsbufferten.
    5. Tillsätt 200 μL färgbuffert och fortsätt plattan för bild analys under fluorescerande Mikroskop.
  6. Alternativt, ta bort den plattbundna makro Fager genom att tillsätta 1 mL 1% lidokain i PBS och INRUTA i 10 min vid 37 ° c.
  7. Lossa plattbundna makro Fager med upprepad pipettering.
  8. Överför makro Fager SUS pension till en individuell 5 mL rundbottning FACS tub från varje brunn av 24-well plattan.
  9. Centrifugera vid 300 x g i 5 min.
  10. Avlägsna supernatanten och tillsätt 200 μL färgbuffert innehåll ande 2 μL CD11b-PE (1:200 spädning i infärgningsbuffert).
  11. Inkubera cell SUS pensionen i färgbufferten vid 4 ° c i 20 minuter.
  12. Tvätta cell SUS pensionen två gånger med infärgningsbuffert.
  13. Tillsätt 200 μL färgbuffert och fortsätt för FACS analys med en flödescytometer och analysera för andelen CFSE-positivitet makro Fager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Analys av peritonealdialys makrofag-medierad omvälvning av apoptotiska tymocyter. Peritoneala makro Fager och apoptotiska celler bereddes och samodlade enligt beskrivningen i protokollet. Makro Fager lösgjordes och färgas med PE-konjugerad anti-CD11b anti kropp för 20 min på is. Makro Fager tvättades och behandlades sedan i en flödescytometer. Som framgår, det finns ingen cfse positiv makrofag i nedre högra kvadranten när inga apoptotiska celler lades in i kulturen (figur 1A och figur 2, första panelen). Tioglykollat-stimulerade peritoneala makro Fager har variabel förmåga att uppsluka apoptotiska celler. Upp till 30% av makro Fager visade positiva effekter i CFSE-kanalen, vilket indikerar att de har intagit CFSE-märkta apoptotiska celler i detta experiment (figur 1). Det är värt att notera att CFSE positiva makro Fager utspridda i den nedre högra kvadranten på grund av olika intensitet, vilket tyder på att antalet apoptotiska celler inom makro Fager är olika. Därför är mikroskopisk observation av makrofagengulfment av apoptotiska celler avgörande för att undersöka förmågan hos makro Fager att inta apoptotiska celler (figur 2). Den högre kvoten av apoptotiska celler till makro Fager inte bara ökar antalet makro Fager intag av apoptotiska celler men också förbättrar förmågan hos makro Fager att inta mer apoptotiska celler (figur 2).

DOS beroende hämning av efferocytos av mer blockering.
I en annan uppsättning experiment, fann vi att cirka 15% av makro Fager blev CFSE positiva när CFSE-märkta apoptotiska tymocyter (ranson av 6:1) lades till makro Fager kulturen för 4 h, vilket tyder på att de är fagocytos makro Fager (figur 3 B). en fungera av mer på makro Fager är att känna igen och förmedla fagocytos av apoptotiska celler till och med överbryggnings molekylen, Gas6. För att testa den procentuella andelen av efferocytos, som tillskrivs mer hämning, lade vi till anti-mer-antikroppar i kulturen för att blockera mer medierad efferocytos. Anti kroppar blockerar makrofagefferocytos på ett DOS beroende sätt (figur 3C, figur 3D) och den totala blockeringen kan redogöra för cirka 30% av efferocytos verknings grad i den aktuella inställningen (figur 3) , Dessa data bekräftades också i vår tidigare studie med mer knockout makro Fager13. Vi testade sedan effektiviteten av hämning med den nyligen FDA godkända Tam receptor hämmare, rxdx-106, som hämmar alla Tam-receptorer med olika tillhörighet (Axl > > Tyro3 > mer). RXDX-106 lades in i makro Fager kulturen 2 timmar före co-inkubation med apoptotiska tymocyter. Som framgår av figur 4, rxdx-106 hämmad makrofagefferocytos på ett DOS beroende sätt. Den mättade hämnings koncentrationen var ca 100 nM (figur 4, heldragen linje), en koncentration som verkar vara mer effektiv än mer-brist (figur 4 prickad linje) eller mer anti kropp (figur 3, panel D) ensam. Eftersom makrofag uttrycker alla tre Tam-receptorer på ytan16, det förväntas att se att högre koncentrationer av rxdx-106 (över 100 nM) kommer att blockera alla tre receptorer, och därför kommer att vara mer effektiva för att blockera efferocytosis än som riktar sig mot en enda TAM-receptor, mer.

Figure 1
Figur 1 . Procent av fagocytos av apoptotiska tymocyter genom peritonealdialys makro Fager. Apoptotiska tymocyter induceras genom inkubering med 1 mm staurosporine för 4 h och tillsätts i makro Fager kultur i ett förhållande som anges i figur panelerna: (a) 1:0; B) 1:1, C) 1:2. D) 1:4. E) 1:6. F) 1:8, G) 1:10, H) 1:12. Data har erhållits med en flödescytometer. Procent av fagocytos makro Fager analyserades med hjälp av program varan i samband med flödescytometern. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Mikroskopisk analys av efferocytos. Efferocytos bereddes som i figur 1. Fagocytos makro Fager färgas in situ på plattan med CD11b-PE, fast med paraformaldehyd, och utvärderas. Bilder förvärvades med hjälp av fluorescerande Mikroskop och analyseras med den program vara som är associerad med Mikroskop. Representativa infogningar var digitalt förstorade och visas nedan i varje bild. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Hämning av peritonealdialys makrofagefferocytos av en anti-mer anti kropp. Apoptotiska celler bereddes och co-odlade med makro Fager för 4 h som beskrivs i protokollet. Anti-mer AB lades till i makro Fager kulturen omedelbart före samkulturen med apoptotiska celler. Fagocytos makro Fager var sedan lossnat och färgas med anti-mus CD11b-PE anti kropp på is i 20 min. data förvärvades och analyserades som i figur 1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . RXDX-106 medierad hämning av makrofagefferocytos. Efferocytos inrättades enligt beskrivningen i figur 3. RXDX-106 lades två timmar före samkulturen med apoptotiska tymocyter. Mer-brist peritonealdialys makro Fager utarbetades på samma sätt och fungerade som kontroll gruppen. Data förvärvades och procent andelen fagocytos makro Fager var gated på CD11b positiva celler och analyseras med hjälp av flödet flödescytometerns program vara. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Apoptos är en mycket bevarade celldöd process som involverar många signalkaskader och inducerar protein uttryck, sekretion och transport. Apoptos är ofta förknippat med cellulära morfologi förändringar17. Apoptotiska celler släpper aktivt cytokiner och chemokiner som lockar fagocyter att migrera till platsen och initiera processen för engulfment, en extremt komplex väg under snäva kontroll18. Å andra sidan, nekrotisk celldöd frigör farosignaler som utlöser inflammatoriska svar1. Defekt eller långvarig clearance av apoptotiska celler kommer att leda till sekundär nekros av dessa celler19. Därför är timing i apoptos induktion mycket kritisk i experimentet. Det finns många sätt att inducera cell apoptos20. Emellertid, varaktigheten och styrkan av induktion är cell typ anhörigen. Vi rekommenderar att du installerar ett titreringsexperiment för att fastställa det optimala tillståndet för maximum (90-95%) apoptos produktion. Det apoptotiska detektions paketet Annexin-V/7-AAD användes och instruktionerna följdes i vårt labb för att utvärdera den apoptotiska effektiviteten. Vårt laboratorium har provat två olika sätt att framkalla tymocyter apoptos i det förflutna. Gamma-strålning verkar vara en bättre metod, eftersom den inte har några kemiska residualer i kulturen och inducerar några nekrotiska cell dödsfall. Vi exponerar tymocyter till 500 rad g-strålning följt av 4-h kultur i RPMI1640 medium. Vi observerade ca 95% apoptotiska thymocyter13. När en radiator inte är tillgänglig, inducerade vi tymocyter att genomgå apoptos med 1 μM av staurosporine i kulturen för 4 h (steg 1,15). Primära celler är i allmänhet känsligare för apoptos induktion. Omfattande tvätt steg krävs också för att ta bort kemikalier från kulturen innan samodling med fagocyter. Det finns många sätt att märka apoptotiska celler. Även om toxicitet har förknippats med hög koncentration, CFSE är mycket effektivt bevaras inom cytoplasman när noggrant optimerad21. pHrodo är ett syra-känsligt färg ämne, som ökar i fluorescens som pH i miljön minskar. På grund av det låga pH i phagolysosome kan fagocytiserade apoptotiska celler lätt skiljas från fysiskt bifogade men inte uppslukade apoptotiska celler i analysen22.

Talrika yta receptorer (TAM-receptorer, mannos receptor, integriner (CD11b/CD18), Gat sopare receptorer, FC receptorer, et al) tillåter fagocyter att skilja sig från patogener och diskriminera efterföljande svar23. Olika receptorer arbetar tillsammans för att avsluta en ganska komplicerad process. Blockerande receptor (er) sannolikt resulterar i en partiell hämning av fagocytos. Primära makro Fager kan framställas från olika resurser med olika metoder (benmärg härledda makro Fager, peritonealdialys makro Fager, mjältmakro Fager, et al.). Fördelen med thioglycollate-inducerad makro Fager är skev fagocytos fenotyp av makro Fager; nack delen är att tioglykollat måste åldras i mörker i minst 3 månader. Emellertid, thioglycollate lösning har en hållbarhets tid på 2 år. En konstant lager av lösningen bör övervinna denna nackdel. Vid beredning av peritonealdialys makro Fager, spår mängden röda blod kroppar i peritonealdialys makrofag insamling bör inte påverka experimentet, eftersom de kommer att tvättas bort tillsammans med de flytande cellerna efter 2 h av makro Fager kultur. En stor mängd röda blod kroppar (synlig pellet) kan kräva behandling med ACK lyseringslösning buffert. Makro Fager tenderar att fästa tätt på kultur ytan. Olika metoder har nämnts i litteraturen för att lossa adhesionscellerna från ytan24. Enzymbaserad avlossning ger de högsta nivåerna av cell återvinning men kan skada ytreceptorer, försämra cell funktionen och tillhör ande analyser. Förändring av ytreceptorer kan också påverka receptor-baserad flödescytometri analys. Lidokain orsakar Cellmorfologi att byta till en mer sfärisk kon formation på grund av blockaden av kalcium Jon kanaler25. Det är det bästa sättet att ta bort makro Fager från ytan utan märkbar skada i vårt experiment.

Makro Fager som innehåller apoptotiska celler kan analyseras med flödescytometri-baserade eller Mikroskop-baserade analyser. FACS kan appliceras för att analysera ett stort antal celler på kort tid och kan ytterligare identifiera cell subtyper genom differential färgning med anti kroppar mot den specifika ytan eller cytoplasmatiska proteiner. En optimal koncentration (ratio) av apoptotiska cell nummer i Co-Culture-systemet kan också beslutas av FACS-analysen. Mikroskopisk analys har begränsningar avseende cell nummer och differential färgning jämfört med FACS-analysen. Fluorescerande mikroskopi ger dock djupgående information. Mikroskopisk analys av makrofagengulfment av apoptotiska celler är viktigt att undersöka kapaciteten och kinetiken hos makro Fager att inta apoptotiska celler. En tids fördröjning av hela införandet progression kan ge detaljerad information om hur lång tid det tar att uppsluka en apoptotiska cell, och hur många apoptotiska celler kan en enda makrofag mata in samtidigt. Fagocytos makro Fager kan också analyseras av Western blot att undersöka signalering molekyler regleras av omvälvning processen. Gen uttrycks profiler som associeras med den här processen kan utvärderas med real tids PCR.

Slutligen, detta protokoll ger en grundläggande plattform i experimentell analys av efferocytosis. Andra cell typer (dendritiska celler, mesangiala celler, epitelceller) kan också fungera för upptag apoptotiska celler på deras bostads områden. Dessa celler har preferenser att använda olika receptorer för att känna igen och initiera processen för apoptotiska cell clearance2. Den totala fagocytos effektivitet kan påverkas av flera faktorer, inklusive experimentella och cell typ specifika faktorer. Variabla resultat som rapporter ATS i litteraturen beror troligen på 1) samkulturens varaktighet. 2) resurs och beredning av fagocyter och apoptotiska celler; 3) metoder för att separera de apoptotiska cellerna från fagocyter. Det protokoll som beskrivs här kan gälla för den fagocytiska potentialen hos andra celler. Optimering kan krävas för att maximera den fagocytiska potentialen hos mål cellerna. Vi har analyserat renal mesangialceller cell fagocytos av apoptotiska thymocyter genereras på samma sätt som beskrivs i detta protokoll. Neutrofiler spelar en nyckel roll i det inneboende immun systemet genom Eli minering av patogener. Neutrofila fagocytos av märkta bakterier eller partiklar kan analyseras genom flödescytometri26. Emellertid, neutrofiler har en mycket kort halverings tid (6-8 h) och neutrofila fagocytos av bakterier eller svampar sker inom några sekunder till minuter27,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Forskning i Shao Lab stöds av forskning innovativa utmärkelse från College of Medicine och Junior fakulteten pilot Award från Institutionen för intern medicin, University of Cincinnati och Grant DK K01_095067 från NIDDK/NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13, (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28, (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14, (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172, (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80, (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123, (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133, (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411, (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35, (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207, (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9, (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5, (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68, (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31, (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112, (4), 935-945 (2008).
Experimentell analys av apoptotiska thymocyte Engulfment av macrophages
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).More

Zhen, Y., Shao, W. H. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter