Summary
Experimenten met eiwitbinding Microarray (PBM) in combinatie met biochemische assays koppelen de bindende en katalytische eigenschappen van DNA primase, een enzym dat RNA-primers op Template DNA synthetiseert. Deze methode, aangeduid als high-throughput Primase profilering (HTPP), kan worden gebruikt om DNA-bindende patronen van een verscheidenheid aan enzymen te onthullen.
Abstract
DNA primase synthetiseert korte RNA-primers die DNA-synthese van Okazaki fragmenten op de achterblijvende streng door DNA-polymerase tijdens DNA-replicatie initiëren. De binding van prokaryotische DnaG-achtige primases aan DNA vindt plaats in een specifieke trinucleotide-herkennings sequentie. Het is een cruciale stap in de vorming van Okazaki fragmenten. Conventionele biochemische hulpmiddelen die worden gebruikt om de DNA-herkennings volgorde van DNA primase te bepalen, bieden slechts beperkte informatie. Met behulp van een op hoge doorvoer microarray gebaseerde bindende assay en opeenvolgende biochemische analyses, is aangetoond dat 1) de specifieke bindende context (flankerende sequenties van de herkennings plaats) de bindende sterkte van het DNA primase op zijn template beïnvloedt DNA, en 2) sterkere binding van Primase aan het DNA levert langere RNA-primers op, wat duidt op een hogere processiviteit van het enzym. Deze methode combineert PBM en Primase activity assay en is aangewezen als high-throughput Primase profilering (HTPP), en het maakt karakteriseren van specifieke sequentie herkenning door DNA primase in ongekende tijd en schaalbaarheid mogelijk.
Introduction
HTPP maakt gebruik van DNA-bindende microarray-technologie in combinatie met biochemische analyse (Figuur 1) om statistisch specifieke kenmerken van DNA-templates te identificeren die de enzymatische activiteit van DNA primase beïnvloeden. Daarom biedt HTPP een technologisch platform dat een kennis sprong in het veld vergemakkelijkt. De klassieke instrumenten die worden gebruikt om de Primase herkennings locaties te bepalen, hebben niet de mogelijkheid om enorme hoeveelheden gegevens te leveren, terwijl HTPP dat wel doet.
PBM is een techniek die routinematig wordt gebruikt om de bindende voorkeuren van transcriptiefactoren te bepalen naar DNA1,2; het is echter niet geschikt voor het opsporen van zwakke/voorbijgaande binding van eiwitten aan DNA. In tegenstelling tot de universele PBM die informatie verschaft over de gemiddelde eiwit bindende specificiteit van alle mogelijke sequenties bestaande uit acht basis paren, is HTPP gebaseerd op de bibliotheek van enkel-streng DNA-templates, bestaande uit unieke sequentie-elementen. Dergelijke DNA sequentie elementen omvatten tienduizenden korte (enkele tientallen BP) genomische sequenties, evenals computationeel ontworpen DNA sequenties verrijkt in bepaalde DNA repetitieve sequentie elementen aanwezig in het genoom, die beschikken over verschillende gemiddelde GC inhoud . Een dergelijke aanpak met hoge doorvoer maakt het mogelijk om, op een systematische, kwantitatieve en hypothese-gestuurde manier, de sequentie-gerelateerde eigenschappen te bepalen die belangrijk zijn voor de binding van Primase en de enzymatische activiteit3. In het bijzonder is het belangrijke verband tussen de voorkeuren van Primase-DNA-binding (gemoduleerd door DNA-sequenties flankerende specifieke Tri-nucleotide binding sites) en Primase processiviteit geïdentificeerd voor dit enzymatische systeem4.
De nieuwe technologie werd toegepast om onze kennis van de herkenningspunten van Primase te herbekijken, zelfs voor de T7 DNA primase die uitgebreid is bestudeerd5. In het bijzonder heeft het opnieuw onderzoeken van klassieke concepten, zoals DNA-herkennings locaties van T7 DNA primase (die bijna vier decennia geleden werden vastgesteld 6) met behulp van PROTEÏNE-DNA binding Microarray (PBM) geleid tot ongekend inzicht in functies die verband houden met de flankerende volgorde van deze herkennings locaties3. Verwacht werd dat de sequenties flankerende Tri-nucleotide herkenning plaats van T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') willekeurig zal zijn. In plaats daarvan ontdekten we dat TG-rijke flankerende sequenties de kans van T7 DNA primase vergroten om langere RNA-primers te synthetiseren die wijzen op een toename van processiviteit.
Andere methoden die kunnen worden gebruikt om DNA-bindende eigenschappen van eiwitten in vitro te bestuderen, zijn onder andere de elektroforetisch Mobility Shift assay (EMSA)7, DNase I Footprinting8, Surface-Plasmon Resonance (SPR)9en zuidwestelijke blotting 10. Dit zijn echter methoden met een lage doorvoer die alleen van toepassing zijn op het onderzoeken van een klein aantal DNA-sequenties. Bovendien is de nauwkeurigheid en gevoeligheid van sommige van deze technieken (bijv. EMSA) laag. Aan de andere kant is in vitro selectie11 een techniek die, net als PBM, kan worden gebruikt voor de identificatie van talrijke bindings sequenties. Echter, lage affiniteit reeksen worden meestal uitgesloten in de meeste toepassingen van in vitro selectie; Daarom is deze benadering niet geschikt voor het verkrijgen van vergelijkende bindingsgegevens voor alle beschikbare reeksen. De universele PBM1,2wordt voornamelijk gebruikt om de bindende kenmerken van transcriptiefactoren van prokaryoten en eukaryoten te karakteriseren, evenals specifieke factoren (bijv. de aanwezigheid van bepaalde liganden, cofactoren, enz.) die kunnen invloed op deze interactie12.
HTPP breidt de PBM-toepassing uit naar DNA-verwerkings enzymen door ongekende hoge doorvoer statistisch vermogen te combineren met hoge precisie om informatie te bieden over de bindings sequentie context. Dergelijke gegevens zijn nog niet verkregen voor primases en verwante enzymen (die een zwakke/voorbijgaande binding hebben met DNA) als gevolg van bovengenoemde technische beperkingen van andere beschikbare technieken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwerp van Microarray
Opmerking: DNA-sondes vertegenwoordigen aangepaste 36-nucleotide-sequenties, bestaande uit de herkennings plaats voor T7 DNA primase (GTC), gelegen tussen twee variabele flankerende gebieden, gevolgd door een constante 24-nucleotide sequentie die is aangesloten op een glas Slide3. We gebruikten een 4 x 180.000 Microarray formaat, die het spotten van elke DNA sequentie in zes replicaten mogelijk gemaakt, willekeurig verdeeld over de glijbaan.
-
Ontwerp van de DNA-bibliotheek voor primases met bekende herkennings sequenties
- Zorg ervoor dat elke sequentie bestaat uit 60 nucleotiden. Houd de eerste 24 nucleotiden constant (te hechten aan de glazen glijbaan). Variabele regio's moeten de volgende algemene vorm hebben: (N)16GTC (n)17; waarbij N een willekeurig gewenst nucleotide vertegenwoordigt.
- Ontwerp de flankerende regio om een specifieke wetenschappelijke vraag aan te pakken (een voorbeeld van het ontwerp wordt weergegeven in de volgende tekst). De flankerende gebieden kunnen worden ontworpen om specifieke functies te bevatten, zoals de herhalings elementen of specifieke symmetrie.
Opmerking: we hebben acht categorieën van verschillende flankerende sequenties gemaakt, bestaande uit twee of drie specifieke nucleotiden: T en G (groep 1); T en C (groep 2); C en A (groep 3); A en G (groep 4); G, C en T (groep 5); C, T en A (groep 6); G, A en T (groep 7); G, A en C (groep 8). 2.000 verschillende reeksen zijn ontworpen voor elke groep. Elke groep had subgroepen van sequenties met verschillende types en verschillende aantallen van sequentie herhalingen. - Neem een set van negatieve controle sequenties (ontbreekt de specifieke binding site)4. De aanwezigheid van dergelijke sequenties valideren van het optreden van specifieke binding in het experiment.
-
Ontwerp van de DNA-bibliotheek voor primases met onbekende herkennings sequenties
- Als de herkennings volgorde onbekend is, maakt u de DNA-bibliotheek door de sequenties (met of zonder specifieke kenmerken eerder genoemd) te selecteren uit het genoom van het gewenste organisme (bacteriën, schimmels, enz.).
-
Ontwerp van Microarray Slide
- Koop aangepaste dia's (bijv. 4x180K, AMADID #78366) van een commerciële leverancier (voor meer details zie tabel van materialen). Volg elke reeks in zes replicaten, waarbij elke replicatie moet worden gekoppeld aan een willekeurig geselecteerde plek op de dia.
2. Primase DNA binding experiment
Opmerking: de dag vóór (of ten minste 2 h vóór) de PBM, bereid de blokkerende oplossing [2% w/v magere melk in fosfaatbuffer Saline (PBS)] en roer het op een magneetroerder. Filter de oplossing vóór gebruik met een 0,45 μM filter. Voor het opsporen van de Primase binding aan de DNA-strengen, moeten verschillende stappen worden uitgevoerd in de volgende volgorde.
- Blokkerings procedure
- Pre-nat de microarray Slide in een Coplin potje met 0,01% v/v Triton X-100 in PBS (5 min bij 125 rpm op een labrotator).
- Was de pakking Slide (ook wel coverslip genoemd) met water en ethanol en droog met perslucht.
- Monteer het onderste deel van de stalen hybridisatie kamer (PBM Chamber) met de pakking Schuif naar boven (commercieel label naar boven gericht). Raadpleeg de tabel met materialenvoor meer informatie over de assembly.
- Pipet blokkerende oplossing (2% w/v magere melk in PBS) in elke kamer.
- Verwijder de microarray-dia uit de Coplin-pot en droog vervolgens de niet-DNA-zijde (het DNA moet aan dezelfde kant staan als het bedrijfs label) en randen met een fijn doekje. Plaats de microarray langzaam op de pakking Slide, Vermijd bubbels (bedrijfs label naar beneden gericht). Monteer en draai de stalen hybridisatie kamer apparatuur onmiddellijk. Incuberen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
- Vul één kleurings schaal (het "PBS"-gerecht) met 800 mL verse PBS. Vul een tweede kleurings schaal (de "WASH" Dish) met 800 mL vers bereide 0,5% v/v tween-20 in PBS.
- Schroef de PBM kamer en verwijder de microarray Slide-coverslip "sandwich", het verzorgen van de afdichting niet breken. Demonteer het onderwater in de WASSCHAAL door het plaatsen van een tang tussen de glijbaan en de dekslip.
- Schud de microarray Slide onderwater en breng snel over naar een Coplin jar.
- Was één keer met 0,1% v/v tween-20 in PBS (5 min bij 125 rpm op een labrotator).
- Was één keer met 0,01% v/v Triton X-100 in PBS (2 min bij 125 rpm op een labrotator).
- Breng de dia snel over naar een Coplin-potje met PBS.
- Eiwitbinding
- Monteer de PBM-kamer zoals eerder beschreven (stappen 2.1.2 – 2.1.3).
- Pipet eiwit bindend mengsel met 5 μM T7 DNA primase, 30 mm tris-HCl pH 7,5, 6,5 mm MgCl2, 30 mm K-glutamaat, 6 mm dithiotreïtol (DTT), 65 μM ribonucleoside trifosfaat (rntp), 2% m/v magere melk, 100 ng/μl boviene serumalbumine (BSA), 50 ng/μl zalm testes DNA, en 0,02% v/v Triton X-100 (TX-100) in elke kamer van de pakking Slide (zonder de rubberen zijkanten aan te raken en zonder bubbels te introduceren).
- Spoel de microarray-dia kort door deze in de PBS-schaal te dippen, waardoor overtollig reinigingsmiddel uit het oppervlak van de dia's wordt verwijderd. Veeg de niet-DNA-oppervlakken van de dia af met een fijn doekje.
- Verlaag langzaam de microarray-Slide (naar beneden gericht) op de pakking Slide, voorzichtig om lekkage van de ene kamer naar de andere te voorkomen. Onmiddellijk monteren en draai PBM kamer apparaat zonder het introduceren van bubbels. Als bellen vorm geven, kunnen ze worden verwijderd door zachtjes op de stalen kamer te tikken tegen een hard oppervlak.
- Incuberen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Fluorescerende antilichaam bevestiging
- Schroef de PBM kamer en verwijder de microarray Slide-coverslip "sandwich", het verzorgen van de afdichting niet breken. Demonteer onderwater in de WASSCHAAL met behulp van een tang. Schud de glijbaan onderwater en breng snel over naar een Coplin-potje met PBS.
- Monteer de PBM-kamer met dichting Slide zoals eerder beschreven (stappen 2.1.2 – 2.1.3).
- Voeg Alexa 488-geconjugeerde anti-zijn antilichaam (10 ng/μL in bindings buffer) toe aan de pakking Slide.
- Spoel de dia kort door deze in PBS-schaal als voorheen te dippen, verwijder de dia dan langzaam van PBS, veeg het niet-DNA-oppervlak af en plaats het naar beneden op de pakking schuif.
- Inincuberen 30 min bij RT in het donker (fluorescentie sonde is lichtgevoelig) om foto-bleaching te verminderen.
- Demonteer de PBM kamer en dekslip als voorheen, het verwijderen van de dekslip onderwater in de WASH Dish.
- Spoel de dia's kort door ze in de PBS-schaal te dompelen. Droog de dia's met perslucht. Bewaar in het donker in een schuif kastje tot u klaar bent om te scannen.
- De microarray-dia scannen
- Scan de chip met behulp van Microarray scanner (Raadpleeg de tabel met materialen) met een excitatie van 495 Nm en een emissie van 519 nm en verzamel de mediane intensiteit van de fluorescentie.
3. Microarray data-analyse
Opmerking: alle gegevensverwerking is uitgevoerd met behulp van aangepaste geschreven scripts in MATLAB.
- Voer de initiële PBM gegevensverwerking met behulp van Wilcoxon Rank Sum test p-waarde zoals eerder beschreven4.
- Gebruik de mediaanwaarde van de bindings intensiteit voor elke DNA-sequentie voor verdere analyse.
- Vervolgens, met behulp van de One-way ANOVA p-waarden, vergelijken statistische significantie van de waargenomen verschillen in Primase-DNA bindings intensiteiten verkregen voor verschillende groepen van DNA-sondes, zoals hierboven uitgelegd in de DNA-bibliotheek ontwerp sectie3.
4. door de template geleide RNA-synthese gekatalyseerd door T7 DNA primase
- Bereiding van denaturerende polyacrylamidegel
- Om 100 mL gel mengsel te bereiden, combineer 62,5 mL 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1), 42 g ureum, 1,1 g van tris base (2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol), 0,55 g boorzuur en 0,4 mL 0,5 M ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing.
- Verdeel het mengsel in 14 mL aliquots (de hoeveelheid die nodig is voor één gel van 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) en houd ze beschermd tegen licht bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand.
- Om één denaturerende polyacrylamidegel te bereiden, Voeg 4 μL TEMED en 40 μL van 10% w/v ammonium persulfate toe aan 14 mL van het eerder bereide mengsel, giet het en laat het aan polymeriseren gedurende ten minste 2 uur bij RT. De gel kan gedurende één dag op 4 °C worden bewaard.
- Monstervoorbereiding
Opmerking: Bewaar de reagentia, het reactiemengsel en de monsters op ijs.- Om het reactiemengsel te bereiden dat nodig is voor tien reacties, combineer 11 μL 5x activiteit buffer (200 mM tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM dithiothreitol, 250 mM kalium glutamaat, 50 mM MgCl2), 5,5 μl van 2,5 mm mengsel van nucleotide Tri-fosfaat (ntps), en 5,5 μl van ribonucleotide [bv., ATP, (α-32p) 3000 CI/mmol].
Opmerking: alle bedragen zijn verhoogd met 10% als gevolg van mogelijke Pipetteer fouten. Radiolabeled ribonucleotiden moeten worden verdund volgens de sterkte van het radioactieve signaal (initiële verdunning is meestal 1:10 of meer). - Breng 2 μL van het reactiemengsel over in tien PCR-buizen.
- Voeg 1 μL 100 μM DNA-template toe aan de corresponderende PCR-buis en draai naar beneden.
- Voeg 2 μL 16 μM T7 DNA primase toe, spin naar beneden, meng zachtjes en draai weer naar beneden.
- Incuberen de reactie bij RT gedurende 20 minuten.
- Stop de reactie door 5 μL afschrikkings oplossing toe te voegen (95% formamide, 20 mm EDTA, 0,05% w/v xyleen cyanol en broom fenol Blue), meng en draai naar beneden.
- Om het reactiemengsel te bereiden dat nodig is voor tien reacties, combineer 11 μL 5x activiteit buffer (200 mM tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM dithiothreitol, 250 mM kalium glutamaat, 50 mM MgCl2), 5,5 μl van 2,5 mm mengsel van nucleotide Tri-fosfaat (ntps), en 5,5 μl van ribonucleotide [bv., ATP, (α-32p) 3000 CI/mmol].
- Scheiding van RNA-producten door elektroforese door denaturerende polyacrylamidegel en daaropvolgende signaaldetectie
- Pre-run de gel voor 1 h (10 mA, 600 V) in 1x TBE buffer (90 mM tris-borate, 2 mM EDTA).
- Laad tot 2 μL van elk monster en voer elektroforese (20 mA, 1100 V) in 1x TBE buffer (90 mM tris-borate, 2 mM EDTA).
- Droog de gel voor 2 uur bij 80 °C onder een vacuüm.
- Stel de fosfer beeldplaat gedurende enkele uren in op radioactieve gel, afhankelijk van de sterkte van het radioactieve signaal.
- Noteer het signaal (fotogestimuleerde luminescentie) met behulp van foshorimager (Zie tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze technologische voorsprong voor het in kaart brengen van de Primase bindingsplaatsen maakt het verkrijgen van DNA bindings eigenschappen die moeilijk, zo niet onmogelijk zijn, te observeren met behulp van klassieke gereedschappen. Nog belangrijker is dat HTPP het herbezoeken van het traditionele begrip van de bindende sites van Primase mogelijk maakt. In het bijzonder onthult HTPP bindende specifieke kenmerken naast bekende 5 '-GTC-3 ' herkennings sequenties, wat leidt tot veranderingen in de functionele activiteiten van T7 DNA primase. Namelijk twee groepen van sequenties werden geïdentificeerd: sterke-bindende DNA-sequenties die bevatten T/G in de flanken en zwakke-bindende sequenties die A/G in de flanken bevatte (alle thymines in de sterke-bindende templates werden vervangen door adenines). Geen Primase binding aan DNA templates die ontbrak 5 '-GTC-3 ' binnen hun sequentie werd gedetecteerd.
De Primase DNA-herkennings locaties die specifieke kenmerken bevatten, zoals T/G-rijke flanken, hebben een toename van Primase-DNA-binding tot 10-voudige, en verrassend genoeg ook de lengte van nieuw gevormde RNA (tot drieledig) (Figuur 2 in vorige publicatie 3). belangrijk, htpp stond ons toe om de variabiliteit in de primer lengte te observeren en te kwantificeren ten opzichte van de volgorde van de DNA-template.
Figuur 1: schematische weergave van de hoge doorvoer van Primase profilering (HTPP). A) de glijbaan werd geïntrigeerd met de Primase in de activiteitsbuffer (40 mm tris-HCl, pH 7,5; 10 mm MgCl2, 50 mm K-glutamaat, 10 mm DTT, 100 μM rntps). Vervolgens werd Alexa 488-geconjugeerde anti-zijn fluorescentie antilichaam geïntroduceerd om het eiwit te labelen. Na de milde wasstap werd de dia gescand met behulp van de microarray scanner. Binding affiniteit werd bepaald volgens het mediane fluorescentie signaal en DNA sequenties werden dienovereenkomstig onderverdeeld in groepen. B) biochemische assays werden uitgevoerd om de DNA-bindende resultaten van het microarray-experiment te correleren met de functionele eigenschappen van T7 DNA primase. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: vergelijking van de katalytische werking van T7 DNA primase op twee groepen van DNA-templates (sterke binding met T/g in de flanken en zwakke binding met A/g in de flanken) verkregen uit PBM. A) RNA-primer vorming gekatalyseerd door het T7 DNA primase. De reacties bevatte oligonucleotiden met de Primase-herkennings sequentie (genummerde rijstroken), 32P-α-ATP, ATP, CTP, UTP en GTP in het standaardreactie mengsel. Eén groep van DNA oligonucleotiden (donkerblauw) bevatte T/G in de flanken, terwijl alle thymines werden vervangen door adeninen in de tweede groep (licht blauw). Na incubatie werden de radioactieve RNA-producten door elektroforese gescheiden door middel van een 25% polyacrylamidegel die 7M ureum bevat en gevisualiseerd door autoradiografie. B) relatieve lengte (aantal ribonucleotiden waaruit elke RNA-primer is onbekend) en de hoeveelheid RNA-primers gesynthetiseerd door T7 DNA primase op twee groepen van DNA-templates (panel A). De plots laten zien dat langere RNA-primers worden gesynthetiseerd (verhoogde processiviteit) op DNA-templates die Primase bindt met een hogere affiniteit (die T/G in de flanken bevatten) in vergelijking met de sjablonen die zijn gebonden aan een lagere affiniteit (die A/G in de flanken bevatten). C) kwantificering van de hoeveelheid gesynthetiseerde RNA-primers op twee groepen van DNA-templates. De resultaten tonen een correlatie tussen de DNA-bindende affiniteit en de hoeveelheid gesynthetiseerd RNA door het T7 DNA primase. AU (willekeurige eenheid) is de maatstaf voor de intensiteit van het radioactieve signaal dat rechtstreeks correleert met de hoeveelheden van gesynthetiseerde RNA-primers. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De PBM-methode is op grote schaal gebruikt om bindende eigenschappen van transcriptiefactoren te onderzoeken en kan ook worden toegepast op DNA-verwerkings enzymen, zoals DNA primase, die binden aan DNA met een lage affiniteit. Er zijn echter bepaalde wijzigingen van experimentele procedures vereist. Het microarray-experiment omvat verschillende stappen: ontwerp van de DNA-bibliotheek, voorbereiding van de chip, binding van het eiwit doelwit, fluorescerende labeling en scannen. Milde wasstappen zijn van cruciaal belang, omdat de lange wassing met oplossingen die detergenten bevatten de dissociatie van het eiwit uit de DNA-template veroorzaakt door de zwakke/voorbijgaande bindings modus. Andere kritische stappen omvatten bindende voorwaarden (bijv. buffer samenstelling, cofactoren) en incubatie tijden die moeten worden geoptimaliseerd voor elk specifiek enzym.
De resultaten van Microarray moeten worden gevalideerd in biochemische assays. Biochemische assays bieden ook inzicht in interessante kenmerken van DNA-verwerkings enzymen, zoals de correlatie tussen DNA-bindingsaffiniteit en enzymatische activiteit/processiviteit. HTPP stelde ons in staat om het effect van DNA binding op functionele eigenschappen van T7 DNA primase te observeren. Er is bijvoorbeeld opgemerkt dat als Primase een hogere bindingsaffiniteit vertoont voor de DNA-template, het de vorming van langere RNA-primers katalyseert (verhoogde processiviteit).
Over het algemeen is de in dit artikel gepresenteerde methode snel, betrouwbaar en biedt de mogelijkheid om gelijktijdig bindende eigenschappen te testen op tienduizenden verschillende DNA-sequenties in een enkel experiment in een hypothese-gedreven manier. Toevoeging van andere eiwitten of metaal cofactoren aan het reactiemengsel biedt de mogelijkheid om hun effect op de DNA-bindings eigenschappen van primases op een snelle, hoge doorvoer wijze te onderzoeken. Aan de andere kant wordt de toepassing van deze methode beperkt door een relatief hoge prijs van Microarray-dia's en de veiligheidsmaatregelen die nodig zijn bij het hanteren van radioactief materiaal voor de assays van Primase-activiteiten.
Het is belangrijk op te merken dat verschillende primases vereisen wijzigingen van zowel Microarray bindende voorwaarden en buffer voorwaarden voor activiteit assays. Primase van Mycobacterium tuberculose vereist bijvoorbeeld vervanging van magnesium met divalent mangaan in de reactiebuffer. Ongepaste metalen cofactoren of ongepaste reactie buffers kunnen leiden tot een slechte activiteit van Primase of een afname van de DNA-bindingsaffiniteit.
Zoals eerder vermeld, bindt primases aan DNA-templates met zwakke affiniteit; Daarom zijn zachte wasstappen vereist tijdens het microarray binding experiment. Anders worden ze uit de microarray-glijbaan weggespoeld, wat leidt tot verlies van het TL-signaal bij toevoeging van fluorescently gelabeld antilichaam.
Samenvattend, de DNA bindings eigenschappen van vele prokaryotische primases (inclusief de trinucleotide DNA-herkennings sequentie) zijn nog steeds slecht begrepen, voornamelijk vanwege de technische beperkingen van de momenteel beschikbare methoden. HTPP vertegenwoordigt een snel en efficiënt platform voor de ontdekking van de DNA-herkenningspunten of onderzoeken van andere sjabloongerelateerde factoren (d.w.z. algehele nucleotide-samenstelling, GC-gehalte, aanwezigheid van herhaalde DNA-sequentie-elementen en hun symmetrie) die invloed hebben op de binding affiniteit en activiteit van ssDNA bindende enzymen. Daarnaast kunnen toekomstige toepassingen gericht zijn op de effecten van verschillende eiwitten of cofactoren op DNA-bindingsaffiniteit, herkennings patronen of functionele activiteit van primases en andere DNA-verwerkings enzymen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1023/18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution | Merck | 1006401000 | |
| 95% formamide | Sigma-Aldrich | F9037-100ML | |
| Alexa 488-conjugated anti-his antibody | Qiagen | 35310 | |
| Ammonuium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol | Perkin Elmer | NEG003H250UC | |
| Boric acid, granular | Glentham Life Sciences | GE4425 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 10735094001 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Coplin jar | |||
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-25G | |
| DNA microarray | Agilent | 4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Acros Organics | AC118430010 | |
| Fujifilm FLA-5100 phosphorimager | FUJIFILM Life Science | ||
| Glass slide staining rack | Thermo Scientific | 12869995 | If several slides are used |
| Lab rotator | Thermo Scientific | 88880025 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63064-500G | |
| Microarray Hybridization Chamber | Agilent | G2534A | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf |
| Microarray scanner (GenePix 4400A) | Molecular Devices | ||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Potassium glutamate | Alfa Aesar | A172232 | |
| Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) | New England BioLabs | N0466S | |
| Salmon testes DNA | Sigma-Aldrich | D1626-1G | |
| Skim milk powder | Sigma-Aldrich | 70166-500G | |
| Staining dish | Thermo Scientific | 12657696 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | |
| Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma-Aldrich | 93362-500G | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-50ML | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U6504-1KG | |
| Xylene cyanol | Alfa Aesar | B21530 |
References
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
- Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
- Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
- Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
- Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
- Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
- Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
- Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
- Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
- Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).
