שימוש מיקרו רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת עם חומצה Phosphotungstic הכנה לדמיין את רקמת האדם האנושי
Summary
טומוגרפיה ממוחשבת של קרני רנטגן יעילה בהשגת מידע תלת מימדי מדגימות אנושיות שאינן בשימוש, אך הצלחה מוגבלת בהתבוננות ברקמות רכות. השימוש של סוכן phosphotungstic בניגוד חומצה יכול לפתור את הבעיה. אנו ליישם את הסוכן הניגוד הזה כדי לבחון את רקמות הרקמה העדינה האנושית (הרצועה התמך שחוגי).
Abstract
ניתוח ידני ותצפית היסטולוגית הן שיטות נפוצות המשמשות לחקירת רקמות אנושיות. עם זאת, ניתוח ידני יכול לפגוע במבנים עדינים, בעוד עיבוד היסטולוגית התבוננות לספק מידע מוגבל באמצעות הדמיה חוצת-חתך. מיקרו רנטגן טומוגרפיה ממוחשבת (microCT) הוא כלי יעיל להשגת מידע תלת מימדי ללא פגיעה בדגימות. עם זאת, הוא מראה יעילות מוגבלת בהבחנה חלקי רקמה רכה. השימוש של גורמים לשיפור ניגודיות, כמו חומצה phosphotungstic (וועד ההורים), יכול לפתור בעיה זו על ידי שיפור ניגודיות רקמות רכות. הגענו ל-microCT עם וועד ההורים לחקור את רצועה התמך של האדם (בזן), שהוא מבנה עדין באזור המסלול. בשיטה זו, דגימות שנקטפו קבוע בפורמאלין, יבשים פתרונות אתנול סדרתי, ומוכתם עם פתרון הורים. לאחר כתמים, סריקת microCT, שחזור תלת-ממדי וניתוח מתבצעים. העור, הרצועות, והשרירים ניתן לדמיין בבירור באמצעות שיטה זו. גודל הדגימה והמשך של כתמים הם תכונות חיוניות של השיטה. עובי הדגימה המתאים היה כ-5 – 7 מ”מ, שמעליה התהליך הואט, והמשך האופטימלי היה 5 – 7 ימים, מתחתיו חור ריק באזור המרכזי התרחש מדי פעם. כדי לשמור על המיקום והכיוון של חתיכות קטנות במהלך חיתוך, תפירה על אותו אזור של כל חלק מומלץ. יתר על כן, ניתוחים ראשוניים של המבנה האנטומי נחוצים כדי לזהות בצורה נכונה כל פיסת. Parafilm יכול לשמש כדי למנוע ייבוש, אבל אכפת צריך לנקוט כדי למנוע עיוות הדגימה. התצפית הרב-כיוונית שלנו הראתה כי בזן מורכב מעבודה בעלת שכבות רב של צלחות רציפות, במקום סיבים כמו חוטים, כפי שדווחו קודם לכן. תוצאות אלה מרמזות כי סריקת microCT עם וועד ההורים היא שימושית לבדיקת תאים ספציפיים בתוך מבנים מורכבים של רקמת האדם. זה יכול להיות מועיל בניתוחים של רקמות סרטן, רקמות עצבים, ואיברים שונים, כמו הלב והכבד.
Introduction
ניתוח ידני ותצפית היסטולוגית משמשים בדרך כלל לבדיקת רקמות אנושיות, כגון שרירים ורקמות חיבור. עם זאת, ניתוח ידני יכול בקלות לפגוע במבנים עדינים, התבוננות היסטולוגית מספקת מידע מוגבל על משטחיםשטוחיםבחתךמשני1, 2. לכן, יש צורך בשיטות משופרות לבדיקת רקמות באופן מדויק ויעיל יותר.
טומוגרפיה ממוחשבת קונבנציונאלי (CT) משמשת בדרך כלל בפרקטיקה קלינית, אך חסרה לו היכולת להבחין בין מבנים קטנים2,3. מיקרו X-ray CT (microCT) הוא כלי יעיל להשגת מידע תלת מימדי (3D) של מבנים קטנים מדגימות, מבלי להרוס אותם. עם זאת, microCT יש יישומים מוגבלים, כי רק רקמות צפופות ניתן לדמיין בבירור; אין אפשרות להשתמש בה כדי להבדיל בין רקמות רכות. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן להשתמש בחומרים מכתיבי. הגורמים לשיפור ניגודיות, כמו phosphotungstic חומצה (ועד ההורים), חומצה פוספומפוליב, ו יוד של lugol, לשפר את שיעור ניגודיות רך רקמות במהלך סריקת4,5. מספר מחקרים השוואת סוכנים אלה מראים כי הורים מדגים ביצועים טובים קל לטפל6,7,8.
(בזן) הוא מבנה עדין סביב המסלול, שניתן לפגוע בו בקלות במהלך התצפית המקובלת9. בדקנו ובהצלחה הצלחנו לאחזר מידע תלת-ממדי על מבנה זה באמצעות microCT עם הורים כסוכן ניגודיות. ניתן להחיל שיטה זו על מחקרים על רקמות אנושיות אחרות, כגון הלב והכבד, עם שינויים מתאימים10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנת מיקרוct עם הכנה להורים בבדיקת רקמות רכות אנושיות. בקצרה, דגימות נקצרו וקבוע פורמלין במשך כמה ימים, ואחריו התייבשות פתרונות אתנול סדרתי. הצבת המדגם לתוך הפתרון של הורים ישירות לאחר קיבעון פורמלין יכול לגרום לפיצוח רקמות מסוימים בשל התייבשות מהירה. לכן, יש צורך בהתייבשות טורית. לפני כתמ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מלגת מחקר של הפקולטה של אוניברסיטת יונסיי המכללה לרפואה (6-2018-0099). המחברים מודים לאנשים שתרמו בנדיבות את גופם לקולג ‘ של אוניברסיטת יונסיי לרפואה. אנחנו אסירי תודה לג הו קים וג הו באנג על התמיכה הטכנית שלהם (אנשי הצוות במרכז החינוך לאנטומיה כירורגית ב אוניברסיטת יונסיי המכללה לרפואה). אנחנו גם אסירי תודה ל-ג’נובה ושות בע מ עבור מערכת סריקת microCT באיכות גבוהה בשימוש במחקר זה.
Materials
| 12 Tungsto(Ⅵ)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
