Summary
마이크로 X 선 컴퓨터 단층 촬영은 손상되지 않은 인간 표본에서 3 차원 정보를 얻는 데 효과적이지만 연조직 관찰에 는 성공이 제한적입니다. 인산조영제를 사용하면 이 문제를 해결할 수 있다. 우리는 인간의 섬세한 섬유 근육 조직 (안구 유지 인대)을 검사하기 위해이 조영제를 구현했습니다.
Abstract
수동 해부 및 조직학적 관찰은 인간의 조직을 조사하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 그러나 수동 해부는 섬세한 구조를 손상시킬 수 있으며, 처리 및 조직학적 관찰은 단면 이미징을 통해 제한된 정보를 제공합니다. 마이크로 X 선 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)은 표본을 손상시키지 않고 3 차원 정보를 얻는 효과적인 도구입니다. 그러나, 연조직 부분 분화에 있어 제한된 효율을 나타낸다. 인산화산(PTA)과 같은 조대비 증강제를 사용하면 연조직 대비를 개선하여 이 문제를 해결할 수 있습니다. 우리는 궤도 영역에서 섬세한 구조인 인간 구안성 유지 인대 (ORL)를 조사하기 위해 PTA와 마이크로 CT를 구현했습니다. 이 방법에서, 수확 된 표본은 포르말린에 고정되고, 직렬 에탄올 용액에서 탈수되고, PTA 용액으로 염색된다. 염색 후, 마이크로CT 스캐닝, 3D 재구성 및 분석이 수행됩니다. 피부, 인대 및 근육은이 방법을 사용하여 명확하게 시각화 할 수 있습니다. 시편 크기와 염색 기간은 이 방법의 필수 특징입니다. 적합한 시편 두께는 약 5-7mm였으며, 그 위에 는 공정이 느려졌고, 최적 지속 시간은 5-7일이었고, 그 아래 중앙 지역의 빈 구멍이 가끔 발생했습니다. 절단 시 작은 조각의 위치와 방향을 유지하려면 각 부품의 동일한 부위에 봉제하는 것이 좋습니다. 또한 각 조각을 올바르게 식별하려면 해부학 적 구조의 예비 분석이 필요합니다. 파라필름은 건조를 방지하는 데 사용할 수 있지만 시편 왜곡을 방지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 우리의 다방향 관측은 ORL이 이전에 보고된 바와 같이 실과 같은 섬유가 아닌 연속 플레이트의 다층 메쉬워크로 구성되어 있음을 보여주었습니다. 이 결과는 PTA를 가진 microCT 스캐닝이 인간 조직의 복잡한 구조물 내의 특정 구획을 검토하기 위해 유용하다는 것을 건의합니다. 그것은 암 조직의 분석에 도움이 될 수 있습니다., 신경 조직, 그리고 다양 한 장기, 심장과 간 같은.
Introduction
수동 해부 및 조직학적 관찰은 일반적으로 근육 및 결합 조직과 같은 인간 조직을 검사하는 데 사용됩니다. 그러나 수동 해부는 섬세한 구조를 쉽게 손상시킬 수 있으며 조직학적 관찰은 평평한 단면1,2에대한 제한된 정보를 제공합니다. 따라서 조직을 보다 정확하고 효율적으로 검사하기 위해 개선 된 방법이 필요합니다.
종래의 컴퓨터 단층 촬영(CT)은 일반적으로 임상 실습에 사용되지만 작은 구조2,3을구별하는 능력이 부족하다. 마이크로 X 선 CT (microCT)는 그들을 파괴하지 않고, 작은 구조의 3 차원 (3D) 정보를 얻기위한 효과적인 도구입니다. 그러나, microCT는 조밀한 조직만 명확하게 구상될 수 있기 때문에 한정된 적용이 있습니다; 연조직을 분화하는 데 사용할 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 염색제에 사용할 수 있다. 인산성산(PTA), 인산모질산 및 루골의 요오드와 같은 대조강화제는 스캐닝 시연조직대비비율을 향상시킨다4,5. 이러한 에이전트를 비교하는 여러 연구는 PTA가 좋은 성능을 발휘하고6,7,8을처리하기 쉽다는 것을 시사한다.
구안성 옹대(ORL)는 궤도 주위의 섬세한 구조이며, 이는 종래의 관측 시 쉽게 손상될 수 있다9. PTA를 조영제로 사용하여 microCT를 사용하여 이 구조에 대한 3D 정보를 검사하고 성공적으로 검색했습니다. 이 방법은 적절한 수정과 함께 심장과 간과 같은 다른 인간 조직에 대한 연구에 적용 할 수 있습니다10,11,12.
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Protocol
이 연구에서 활용된 모든 시신은 연세대학교 의과대학의 외과해부학교육센터에 합법적으로 기증되었습니다.
1. 샘플 획득
- 시더에 색연필로 절개선을 그려 시료 수확을 위한 절단 영역을 표시합니다. 그려진 절개선이 내측 캔따라서, 측면 캔투스로, 아래 눈꺼풀의 우수한 테두리보다 우월하고, 궤도 테두리에서 선 아래 1cm까지 열등하게 확장되는지 확인합니다.
참고: 마이크로 CT 장비의 최대 스캔 크기를 기준으로 샘플 크기를 고려하십시오(장비에서 최대 개체 치수가 7 × 7cm인 이미지를 획득할 수 있음). 여기서, 샘플은 폭 약 1cm, 길이 3 cm, 및 1.25 g의 무게를 ORL 부위로부터 수확하였다. - 절개 선 다음에 면도날로 얼굴 조직을 잘라냅니다. 칼날 끝이 뼈에 닿도록 절단이 깊지 않은지 확인합니다. 견본은 피부, 피하 조직, 근육, 지방 및 periosteum를 포함해야 합니다.
- 샘플을 즉시 10% 포르말린에 고정하고 실온에서 5-7일 동안 보존합니다(그림1A).
참고: 방부처리된 시체와 신선한 시신을 모두 이 연구에 사용할 수 있습니다. 그러나 시체에 대한 고정 솔루션은 생물학적 실험에 사용되는 용액과 약간 다를 수 있습니다. 따라서 방부 처리된 시체에서 샘플을 얻은 후에도 10% 포르말린으로 샘플을 다시 고정하는 것이 좋습니다.
2. 염색 준비
- 고정 한 후, 3 개 (두께 5-7mm)로 샘플을 슬라이스. 이 과정에서 각 조각의 위치와 방향을 잃지 마십시오.
참고: 당사가 사용하는 microCT 스캐너는 최대 7cm³ 크기를 커버할 수 있지만 너무 두껍다면 PTA 솔루션이 시료를 성공적으로 관통할 수 없습니다. - 샘플의 방향을 나중에 확인할 수 있도록 바늘과 검은 실을 사용하여 각 조각의 상각면을 바느질합니다.
- 샘플을 30%, 50%, 70% 에탄올 용액으로 1일 동안 탈수합니다.
- 샘플을 얼룩이 될 때까지 70% 에탄올에 놓습니다.
3. PTA 준비
- 마이크로CT 스캐닝이 예약되기 1주일 전에 PTA 염색 과정을 시작합니다.
- 70% 에탄올 용액 210mL를 준비하고 2.1 g의 PTA 전력을 추가합니다. 55-60 rpm에서 셰이커를 사용하여 잘 섞으세요.
참고 : PTA 용액의 농도는 에탄올에서 1 %여야합니다. - 슬라이스한 조각마다 70mL 플라스틱 용기 3개가 준비됩니다. PTA 용액으로 용기를 채웁니다. 시편을 용기에 담그고 셰이커에 넣어 효과적으로 침투합니다. 샘플을 5~7일 동안 그대로 둡니다(그림1B).
- 염색이 완료되면 샘플을 70% 에탄올에 저장하여 스캔을 준비합니다.
참고: 염색된 샘플은 몇 달 동안 유지 관리할 수 있지만, 완전한 염색을 보장하기 위해 가능한 한 빨리 샘플을 스캔하는 것이 좋습니다.
4. 마이크로CT 스캐닝
- 건조를 방지하기 위해 파라필름으로 시료를 감쌉니다. 변형으로 이어질 수 있기 때문에 샘플을 너무 단단히 감싸지 마십시오.
- 스캐너를 열고 샘플을 트레이에 놓습니다(그림2).
- 스캐닝 파라미터를 다음과 같이 설정합니다: 소스 전압(kV) = 70, 소스 전류(μA) = 114, Al 필터 = 0.5 mm, 이미지 픽셀 크기 (μm²) = 20, 픽셀 = 2240 × 2240, 노출 (ms) = 500, 회전 단계 (deg) = 0.3.
참고: 사용된 샘플 및/또는 스캐너에 따라 매개 변수가 수정될 수 있습니다. - 스캔을 시작합니다.
참고: 스캔은 스캐너의 의도된 해상도와 속도에 따라 30~60분이 소요됩니다.
5. 데이터의 재구성 및 최적화
- 재구성 소프트웨어를 실행합니다. 작업 메뉴에서 데이터 집합 열기를 선택하여 스캔한 파일을 시작합니다.
- 재구성 창에서 설정 탭을 선택합니다. 다음과 같이 매개변수를 설정합니다: 링 아티팩트 감소 = 7, 빔 경화 보정(%) = 40.
참고: 샘플에 따라 매개 변수를 수정할 수 있습니다. - 시작 탭에서 시작을 선택하여 재구성을 시작합니다. 최종 데이터는 지정된 폴더에 저장됩니다.
- 파일 크기 조정 소프트웨어를 실행합니다. 재구성된 파일을 시작하려면 소스 데이터 집합을 선택합니다.
- 대상 데이터 세트 탭에서 jpg를 선택합니다.
- 보간 없음(빠없음)의 품질 옵션을 사용 하 고 크기 조정 옵션 1/2를 선택 합니다.
- 이미지 압축 탭에서 슬라이드 막대를 100(최고)으로 조정합니다.
참고: 크기 조정 옵션은 3D 렌더링 시 컴퓨터 속도가 느려지는 것을 방지하는 것입니다. 그러나 광범위하게 크기를 조정하면 해상도가 낮아질 수 있습니다. 더 나은 처리와 함께 허용 가능한 해상도를 위해 절반으로 크기를 조정하는 것이 좋습니다.
6. 3D 재구성
- 3D 볼륨 렌더링 소프트웨어를 실행합니다.
- 작업 > 볼륨 데이터를 로드하여 데이터 집합을 시작합니다.
- 전송 기능 편집기 탭에서 히스토그램의 모양 전달 기능을 수정하여 밝기와 대비 수준을 조정합니다.
- 옵션 > 조명을선택합니다.
- 그림자 및 표면 조명 아이콘을 선택합니다. 이러한 효과는 사실적인 모델링 톤을 제공합니다.
- (클릭및 드래그),회전(마우스 오른쪽 버튼 클릭 및 드래그),및 확대 또는 축소(스크롤)에서모델을 이동하여 가장 적합한 보기를 찾습니다.
- 평면을슬라이드(시프트 + 클릭 및 내부 방향으로 드래그)를 클릭하여 단면 이미지를표시합니다(그림 3).
- 조명 아이콘을 켭니다. 조명 표시 막대를 조정하고 보기에 가장 적합한 조명을 찾습니다. 그런 다음 아이콘을 끄고 조명 탭을 닫습니다.
- 옵션 > 표시 > 클리핑 상자를 선택하여 최종 이미지의 상자를 숨깁니다.
- 작업 > 이미지를 저장하려면 이미지 저장을 선택합니다.
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Representative Results
ORL의 상세한 재구성은 PTA 제제를 가진 마이크로CT에 의해 달성되었다(그림4). 진피와 회막 사이에 비스듬히 연장되는 인대 섬유근육 구조는 뚜렷하게 관찰되었다(도4A). 관상 뷰(그림 4B)에서섬유의 양과 복잡성이 측면으로 증가했습니다. 수평뷰(도4C)에서,아버화된 형성을 가진 정교한 메쉬워크가 관찰되었다. 우리는 이전에 보고된 바와 같이 실모양의 섬유가 아닌 연속 플레이트를 특징으로 하는 모양을 관찰했습니다. 시상보기(그림 4D)에서ORL 섬유의 두께는 열등하게 감소했습니다. 전반적으로, 이 다방향 관측은 ORL이 위치에 따라 수와 두께의 변화와 연속 플레이트의 다층 메쉬 워크로 구성되어 있음을 증명했다.
그림 1. 샘플을 수확한 다음 PTA 용액으로 염색하였다.
(A)수확 후 10% 포르말린에 시료를 고정하였다. (B)샘플을 더 얇은 조각으로 절단하여 침투를 강화한 다음 PTA 용액에 넣습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 마이크로CT 스캐너.
화살표는 시편이 배치된 트레이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 3D 재구성.
평면을 안쪽 방향으로 밀어 내부의 단면 이미지를 봅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. ORL의 3D 이미지.
(A)ORL의 전체 이미지입니다. (B). 코로나 뷰. (C). 가로 보기. (D). 시상보기. S, 우수; A, 전방; L, 측면; P, 후방. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. ORL의 분석 된 구조.
노란색, 빨간색 및 녹색은 각각 피부, 근육 및 인대를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 1. 3D 이미지와 2D 이미지 간의 비교. (A)볼륨 렌더링 된 3D 이미지. (B)단면 2D 이미지. 배율 표시줄 = 1mm. 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 2. 파라필름의 래핑 및 고정. (A)파라필름을 전체 시료에 감싸서 건조를 방지합니다. (B)파라필름은 스캐너에서 시료를 단단히 고정하는 데 도움이 됩니다. (C). Parafilm은 microCT 스캐닝에서 보이지 않으며 쉽게 뺄 수 있습니다. 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 3. PTA의 불충분 한 염색. 중앙의 빈 공간은 PTA 솔루션이 충분히 침투하지 않은 위치를 보여줍니다. (A)볼륨 렌더링 된 3D 이미지. (B)단면 2D 이미지. 배율 표시줄 = 1mm. 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 4. 신선한 시체와 방부 처리 된 시체 사이의 비교. 프로토콜을 적용하기 위해 신선 하고 방부 처리된 시체 간에는 차이가 발견되지 않았습니다. 사진은 다른 기능뿐만 아니라 같은 방법으로 촬영 할 수 있습니다 보여줍니다. (A)신선한 시체에서 얻은 ORL. (B)방부 처리된 시체에서 얻은 비강 주름. 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 인간 연조직의 검사에서 PTA 준비와 마이크로CT를 구현했습니다. 간단히 말해서, 시편은 며칠 동안 포르말린에서 수확되고 고정되고, 그 다음에 직렬 에탄올 용액에서 탈수됩니다. 포르말린 고정 직후 PTA 용액에 시료를 배치하면 급속한 탈수로 인한 일부 조직 균열이 발생할 수 있습니다. 따라서 PTA 염색 전에 직렬 탈수가 필요합니다. 다음으로, 샘플은 약 1주일 동안 PTA 용액을 사용하여 염색된다. 마이크로CT 스캐닝, 3D 재구성 및 분석을 수행할 수 있습니다. 우리의 목표는 이 방법을 사용하여 ORL 및 인접 구조물을 관찰하는 것이었습니다. 우리는 성공적으로 3D 모델로 조직을 제시했다. 피부, 인대 및 근육을 뚜렷하게 시각화하였다(도5).
샘플을 처리하는 동안 몇 가지 점을 고려해야합니다. 표본의 크기와 염색 기간은 주요 관심사입니다. 몇 가지 파일럿 연구 후, 우리는 표본의 적절한 두께가 약 5-7mm이고 염색의 적절한 기간은 5-7 일 것을 발견했습니다. 이러한 조건에서 PTA 용액은 약 1mm/일의 속도로 시편에 침투합니다. 두께가 7mm를 초과하면 처리 시간이 증가합니다. 시편의 부피에 비해 염색 의 지속 시간이 불충분하면, 최종 이미지는 시편의 중앙 영역에 빈 구멍을 포함할 수 있다. 이것은 종종, 특히 피부 수준에서 발생하고, 불필요한 피부를 제거하면 염색 효율을 향상시킬 수 있습니다. 지속 시간이 너무 길면 전체 시편이 지나치게 적어 각 구획을 식별하기가 어려워집니다. 더 큰 견본을 염색을 위한 최적 기간에 추가 연구 결과는 유용할 수 있었습니다.
일반적으로, 표본은 침투를 향상시키기 위해 조각으로 나뉩니다; 이 과정에서 각 시편의 위치와 방향을 기억하는 것이 중요합니다. 이 정보를 유지하려면 각 부품의 동일한 영역에 바느질하는 것이 좋습니다. 스레드는 최종 이미지에서 볼 수 있으며 스레드가 주 영역을 방해하지 않도록 주의해야 합니다. 예를 들어, 각 조각의 상각 영역에 바느질이 도움이 될 수 있습니다. 추가적으로, 해부학 적인 구조물의 예비 분석은 그들의 복잡성 때문에 각 조직 부분을 인식하기 위하여 필요합니다.
파라필름 및 기타 재료는 시편이 건조되는 것을 방지하는 데 사용됩니다. 그러나 표본을 래핑할 때 약간의 기형이 발생할 수 있습니다. 원래 모양을 최대한 보존하는 것이 중요합니다. 때로는 파라필름 대신 액체 튜브가 사용됩니다. 그러나 기계의 사소한 떨림조차도 스캔 중에 튜브에 영향을 줄 수 있으며 최종 이미지의 선명도를 떨어뜨릴 수 있습니다.
이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 이 프로토콜은 살아있는 개체로 수행할 수 없습니다. 또한 샘플 크기는 microCT 스캐너의 최대 스캔 크기에 의해 제한됩니다. 육안으로 렌더링된 이미지를 분석하는 동안 오류가 있을 수 있습니다. 따라서, 추가 조직학적 실험은 결과를 확인하기 위하여 필요할 수 있습니다. 준비하는 동안 약간의 차원 왜곡이있을 수 있습니다; 그러나, 우리는 이것이 연구 결과에 크게 영향을 미치지 않는다고 믿습니다.
PTA 준비를 이용한 마이크로CT 스캐닝은 복잡한 구조 내에서 특정 구획을 검사하는 데 유리합니다. 본 연구는 PTA 제제를 사용하여 대비율을 향상시키는 방법의 개발에 초점을 맞추고, 스캐닝 및 재구성 과정과 같은 다른 특징들이 간략하게 표시되었다. 그러나, 독자는 염색 과정 후 현대 마이크로 CT 스캐너 및 이미지 분석 프로그램을 사용하는 경우 동일한 결과를 얻을 수 있어야합니다. 이 방법은 암 조직 및 구조물의 분석, 특정 부위의 신경 기여, 심장 및 간13,14,15와같은 장기의 고해상도 해부학 적 구조에 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 연세대학교 의과대학 교수연구보조금(2018-0099)의 지원을 받았습니다. 저자는 연세대학교 의과대학에 시신을 아낌없이 기부해주신 분들께 감사드립니다. 김준호 씨와 방종호 교수님의 기술지원에 감사드립니다(연세대학교 의과대학 외과해부학교육센터 직원). 우리는 또한 이 연구에 사용된 고품질 microCT 스캐닝 시스템에 대한 Genoss Co., Ltd.에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
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