Gebruik van micro X-Ray computertomografie met Foshotungstic zuur preparaat om menselijk Fibromusculair weefsel te visualiseren
Summary
Micro X-Ray computertomografie is effectief in het verkrijgen van driedimensionale informatie van onbeschadigde menselijke specimens, maar heeft een beperkt succes bij het observeren van zachte weefsels. Het gebruik van phosphotungstic acid contrast agent kan dit probleem oplossen. We implementeerden dit contrastmiddel om menselijke delicate fibromusculaire weefsels (het behoud van het ligament van orbicularis) te onderzoeken.
Abstract
Handmatige dissectie en histologische observatie zijn veelgebruikte methoden die worden gebruikt om menselijke weefsels te onderzoeken. Echter, handmatige dissectie kan gevoelige structuren beschadigen, terwijl de verwerking en histologische observatie beperkte informatie bieden door middel van cross-sectionele beeldvorming. Micro X-Ray computertomografie (microCT) is een effectief hulpmiddel voor het verkrijgen van driedimensionale informatie zonder de specimens te beschadigen. Echter, het toont beperkte efficiëntie in het differentiëren van zachte weefsel delen. Gebruik van contrast-verbeterende agenten, zoals phosphotungstic acid (PTA), dit probleem kan oplossen door het verbeteren van het contrast van zacht weefsel. We implementeerden microCT met PTA om te onderzoeken van de menselijke orbicularis behoud ligament (ORL), dat is een delicate structuur in de baan gebied. Bij deze methode worden geoogste specimens in formaline opgelost, gedehydrateerd in seriële ethanol oplossingen en gekleurd met een PTA-oplossing. Na kleuring worden microCT Scanning, 3D reconstructie en analyse uitgevoerd. Huid, ligamenten, en spieren kunnen duidelijk worden gevisualiseerd met behulp van deze methode. De monstergrootte en de duur van de kleuring zijn essentiële kenmerken van de methode. De geschikte preparaatdikte was ongeveer 5 – 7 mm, waarboven het proces werd vertraagd, en de optimale duur was 5 – 7 dagen, waarbeneden een leeg gat in het centrale gebied af en toe optrad. Om de locatie en de richting van kleine stukjes tijdens het snijden te behouden, wordt het naaien op hetzelfde gebied van elk onderdeel aanbevolen. Bovendien zijn voorlopige analyses van de anatomische structuur nodig om elk stuk correct te identificeren. Parafilm kan worden gebruikt om uitdroging te voorkomen, maar er moet voor worden gezorgd dat preparaat vervorming wordt voorkomen. Onze multidirectionele observatie toonde aan dat de ORL bestaat uit een meerlaagse gevlochten van doorlopende platen, in plaats van draadachtige vezels, zoals eerder gerapporteerd. Deze resultaten suggereren dat microCT scanning met PTA nuttig is voor het onderzoeken van specifieke compartimenten binnen complexe structuren van menselijk weefsel. Het kan nuttig zijn in de analyses van kanker weefsels, zenuw weefsels, en verschillende organen, zoals het hart en de lever.
Introduction
Handmatige dissectie en histologische observatie worden meestal gebruikt om menselijke weefsels te onderzoeken, zoals spieren en bindweefsels. Echter, handmatige dissectie kan gemakkelijk beschadigen delicate structuren, en histologische observatie biedt beperkte informatie over vlakke dwarsdoorsnede oppervlakken1,2. Daarom zijn betere methoden nodig om de weefsels nauwkeuriger en efficiënter te bestuderen.
Conventionele computertomografie (CT) wordt over het algemeen gebruikt in de klinische praktijk, maar het mist de mogelijkheid om kleine structuren te onderscheiden2,3. Micro X-Ray CT (microCT) is een effectief hulpmiddel voor het verkrijgen van driedimensionale (3D) informatie van kleine structuren uit specimens, zonder ze te vernietigen. Micro CT heeft echter beperkte toepassingen omdat alleen dichte weefsels duidelijk kunnen worden gevisualiseerd; het kan niet worden gebruikt om te differentiëren zachte weefsels. Om deze beperking te overwinnen, kunnen kleurings middelen worden gebruikt. Contrast-verbeterende agenten, zoals phosphotungstic acid (PTA), foshomolybdic zuur, en Lugol jodium, verbeteren de zachte weefsel contrast snelheid tijdens het scannen van4,5. Verschillende studies vergelijken deze agenten suggereren dat PTA goede prestaties toont en is gemakkelijk te hanteren6,7,8.
De orbicularis met ligament (ORL) is een delicate structuur rond de baan, die gemakkelijk kan worden beschadigd tijdens conventionele observatie9. We onderzochten en met succes opgehaalde 3D-informatie over deze structuur met behulp van microCT met PTA als contrastmiddel. Deze methode kan worden toegepast op studies op andere menselijke weefsels, zoals het hart en de lever, met de juiste wijzigingen10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
We implementeerden microCT met PTA voorbereiding bij het onderzoek van menselijke zachte weefsels. Kort samengevat worden specimens gedurende enkele dagen geoogst en in formaline gefixeerd, gevolgd door uitdroging in seriële ethanol oplossingen. Plaatsen van het monster in de PTA oplossing direct na formaline fixatie kan resulteren in sommige weefsel barsten als gevolg van snelle uitdroging. Daarom is seriële uitdroging nodig voordat de PTA wordt gekleurd. Vervolgens worden de monsters gekleurd met behulp van de PTA-op…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door een faculteits onderzoeksbeurs van Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). De auteurs bedanken de mensen die hun lichaam zeer royaal hebben geschonken aan Yonsei University College of Medicine. We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van Jun Ho Kim en jong Ho bang (medewerkers van het opleidingscentrum voor chirurgische anatomie van het Yonsei University College of Medicine). We zijn ook Genoss co., Ltd. dankbaar voor het hoogwaardige microCT-scansysteem dat in dit onderzoek wordt gebruikt.
Materials
| 12 Tungsto(Ⅵ)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
