Summary
La tomografia computerizzata a raggi X microagrafica è efficace nell'ottenere informazioni tridimensionali da campioni umani non danneggiati, ma ha un successo limitato nell'osservazione dei tessuti molli. L'uso di agente di contrasto dell'acido fosfoca e può risolvere questo problema. Abbiamo implementato questo agente di contrasto per esaminare i tessuti fibromuscolari delicati umani (l'orbicularis che mantiene il legamento).
Abstract
La dissezione manuale e l'osservazione istologica sono metodi comuni utilizzati per studiare i tessuti umani. Tuttavia, la dissezione manuale può danneggiare le strutture delicate, mentre l'elaborazione e l'osservazione istologica forniscono informazioni limitate attraverso l'imaging trasversale. La tomografia computerizzata a raggi X micro -x (microCT) è uno strumento efficace per ottenere informazioni tridimensionali senza danneggiare i campioni. Tuttavia, mostra una limitata efficienza nella differenziazione delle parti dei tessuti molli. L'uso di agenti che migliorano il contrasto, come l'acido fosfotungtico (PTA), può risolvere questo problema migliorando il contrasto dei tessuti molli. Abbiamo implementato microCT con PTA per studiare il legamento di mantenimento dell'orbicularis umano (ORL), che è una struttura delicata nell'area dell'orbita. In questo metodo, i campioni raccolti sono fissati in formalina, disidratati in soluzioni di etanolo seriale e macchiati con una soluzione PTA. Dopo la colorazione, vengono eseguite la scansione microCT, la ricostruzione 3D e l'analisi. La pelle, i legamenti e i muscoli possono essere visualizzati chiaramente con questo metodo. Le dimensioni del campione e la durata della colorazione sono caratteristiche essenziali del metodo. Lo spessore del provino adatto era di circa 5-7 mm, al di sopra dei quali il processo è stato rallentato, e la durata ottimale era di 5-7 giorni, al di sotto del quale occasionalmente si è verificato un buco vuoto nella zona centrale. Per mantenere la posizione e la direzione dei piccoli pezzi durante il taglio, si consiglia di cucire sulla stessa regione di ogni parte. Inoltre, sono necessarie analisi preliminari della struttura anatomica per identificare correttamente ogni pezzo. Parafilm può essere utilizzato per prevenire l'essiccazione, ma occorre prestare attenzione per evitare la distorsione del campione. La nostra osservazione multidirezionale ha mostrato che l'ORL è composto da una rete multistrato di piastre continue, piuttosto che fibre simili a fili, come riportato in precedenza. Questi risultati suggeriscono che la scansione microCT con PTA è utile per esaminare compartimenti specifici all'interno di strutture complesse del tessuto umano. Può essere utile nelle analisi dei tessuti tumorali, tessuti nervosi, e vari organi, come il cuore e il fegato.
Introduction
La dissezione manuale e l'osservazione istologica sono tipicamente utilizzate per esaminare i tessuti umani, come i muscoli e i tessuti connettivi. Tuttavia, la dissezione manuale può facilmente danneggiare strutture delicate e l'osservazione istologica fornisce informazioni limitate sulle superfici trasversali piatte1,2. Pertanto, sono necessari metodi migliorati per esaminare i tessuti in modo più preciso ed efficiente.
La tomografia computerizzata convenzionale (TC) è generalmente utilizzata nella pratica clinica, ma manca della capacità di distinguere piccole strutture2,3. Micro X-ray CT (microCT) è uno strumento efficace per ottenere informazioni tridimensionali (3D) di piccole strutture da campioni, senza distruggerli. Tuttavia, la microCC ha applicazioni limitate perché solo i tessuti densi possono essere visualizzati chiaramente; non può essere utilizzato per differenziare i tessuti molli. Per superare questa limitazione, è possibile utilizzare gli agenti di colorazione. Agenti che migliorano il contrasto, come l'acido fosfotungstico (PTA), l'acido fosfolitillimpico e lo iodio di Lugol, migliorano il tasso di contrasto dei tessuti molli durante la scansione4,5. Diversi studi che confrontano questi agenti suggeriscono che PTA dimostra buone prestazioni ed è facile da gestire6,7,8.
Il legamento di mantenimento orbicularis (ORL) è una struttura delicata intorno all'orbita, che può essere facilmente danneggiata durante l'osservazione convenzionale9. Abbiamo esaminato e recuperato con successo informazioni 3D su questa struttura utilizzando microCT con PTA come agente di contrasto. Questo metodo può essere applicato a studi su altri tessuti umani, come il cuore e il fegato, con modifiche appropriate10,11,12.
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Protocol
Tutti i cadaveri utilizzati in questo studio sono stati legalmente donati al Surgical Anatomy Education Centre dello Yonsei University College of Medicine.
1. Ottenere campioni
- Disegnare una linea di incisione sul cadavere con una matita colorata per indicare l'area di taglio per la raccolta dei campioni. Controllare che la linea di incisione disegnata si estenda mediamente a un canto mediale, lateralmente a un canto laterale, superiore a un bordo superiore della palpebra inferiore e inferiore a 1 cm sotto la linea dal bordo orbitale.
NOTA: Considerare la dimensione del campione in base alla dimensione massima di scansione dell'apparecchiatura micro-CT (la nostra apparecchiatura potrebbe acquisire un'immagine con una dimensione massima dell'oggetto di 7 cm). Qui, un campione di circa 1 cm di larghezza, 3 cm di lunghezza e 1,25 g di peso è stato raccolto dalla regione ORL. - Tagliare i tessuti facciali seguendo la linea di incisione con una lama. Assicurarsi che il taglio sia profondo in modo che la punta della lama tocchi l'osso. Il campione deve includere la pelle, il tessuto sottocutaneo, il muscolo, il grasso e il periosteo.
- Fissare immediatamente il campione in formalina al 10% e conservarlo per 5-7 giorni a temperatura ambiente (Figura 1A).
NOTA: Per questo studio è possibile utilizzare sia cadaveri imbalsamati che cadaveri freschi. Tuttavia, la soluzione di fissazione per i cadaveri potrebbe differire leggermente dalla soluzione utilizzata in un esperimento biologico. Pertanto, si consiglia di fissare il campione con il 10% di formalina anche dopo aver ottenuto il campione da cadaveri imbalsamati.
2. Preparazione per la colorazione
- Dopo il fissaggio, tagliare il campione in 3 pezzi (5-7 mm di spessore). Non perdere la posizione e la direzione di ogni pezzo durante questo processo.
NOTA: Lo scanner microCT che usiamo può coprire una dimensione massima di 7 cm3, ma la soluzione PTA non può penetrare il campione con successo se è troppo spessa. - Cucire il lato superolaterale di ogni pezzo utilizzando un ago e un filo nero in modo che la direzione del campione possa essere controllata in un secondo momento.
- Disidratare il campione in una serie di soluzioni di etanolo del 30%, 50% e 70% per 1 giorno ciascuna.
- Mettere il campione nel 70% di etanolo fino a colorazione.
3. Preparazione PTA
- Iniziare il processo di colorazione PTA 1 settimana prima della scansione microCT è prevista.
- Preparare 210 mL di soluzione di etanolo 70% e aggiungervi 2,1 g di potenza PTA. Mescolare bene con uno shaker a 55-60 rpm.
NOTA: la concentrazione della soluzione PTA dovrebbe essere dell'1% nell'etanolo. - Preparare tre contenitori di plastica da 70 ml per ogni pezzo a fette. Riempire i contenitori con la soluzione PTA. Immergere i campioni nei contenitori e metterli su uno shaker per una penetrazione efficace. Lasciare i campioni per 5-7 giorni (Figura 1B).
- Una volta completata la colorazione, conservare il campione nel 70% di etanolo per preparare la scansione.
NOTA: I campioni macchiati possono essere mantenuti per diversi mesi, ma si consiglia di eseguire la scansione dei campioni il prima possibile per garantire la colorazione completa.
4. Scansione MicroCT
- Avvolgere il campione con parafilm per evitare l'essiccazione. Non avvolgere i campioni troppo stretti, in quanto ciò può portare a deformazione.
- Aprire lo scanner e posizionare il campione sul vassoio (Figura 2).
- Impostare i parametri di scansione come segue: tensione di origine (kV) - 70, corrente di sorgente (A) - 114, filtro Al - 0,5 mm, dimensione del pixel dell'immagine (m2) , 20, pixel , 2240 x 2240, esposizione (ms) , 500, passo di rotazione (deg) - 0,3.
NOTA: i parametri possono essere modificati in base ai campioni e/o agli scanner utilizzati. - Avviare la scansione.
NOTA: la scansione richiede da 30 a 60 min a seconda della risoluzione desiderata e della velocità dello scanner.
5. Ricostruzione e ottimizzazione dei dati
- Eseguire il software di ricostruzione. Selezionare Apri set di dati dal menu Azioni per avviare i file analizzati.
- Selezionare la scheda Impostazioni nella finestra Ricostruzione. Impostare i parametri come segue: Riduzione degli artefatti dell'anello : 7, correzione dell'indurimento del fascio (%) - 40.
NOTA: i parametri possono essere modificati in base al campione. - Iniziare la ricostruzione selezionando Avvia nella scheda Inizio. I dati finali verranno memorizzati nella cartella designata.
- Eseguire il software di ridimensionamento dei file. Selezionare Set di dati di origine per avviare i file ricostruiti.
- Selezionare jpg nella scheda Set di dati di destinazione.
- Scegliete l'opzione Ridimensionamento 1/2 con l'opzione Qualità Nessuna interpolazione (veloce).
- Regolare la barra di scorrimento su 100 (più alto) nella scheda Compressione immagine.
NOTA: L'opzione di ridimensionamento consiste nell'evitare di rallentare la velocità del computer durante il rendering 3D; tuttavia, può comportare una risoluzione inferiore quando viene ridimensionato in modo estensibile. Suggeriamo il ridimensionamento a metà per una risoluzione accettabile con una migliore gestione.
6. Ricostruzione 3D
- Eseguire il software di rendering del volume 3D.
- Selezionare Azioni > Carica dati volume per avviare il set di dati.
- Regolare la luminosità e il livello di contrasto modificando la funzione di trasferimento della forma nell'istogramma nella scheda Editor funzioni di trasferimento.
- Selezionare Opzioni > Illuminazione.
- Selezionare Le icone Ombre e Illuminazione superficie. Questi effetti forniscono un tono di modellazione realistico.
- Trovare la vista migliore spostando (fare clic e trascinare), ruotando ( fare clic con il pulsantedestro del mouse e trascinare) e ingrandire o ridurre (scorrere) il modello.
- Far scorrere il piano(maiusc, fare clic e trascinare nella direzione interna) per visualizzare le immagini sezionali (Figura 3).
- Attivare l'icona Luce. Regolare la barra di indicazione dell'illuminazione e trovare la migliore illuminazione per la visualizzazione. Quindi, disattivare l'icona e chiudere la scheda Illuminazione.
- Selezionare Opzioni > Mostra > Riquadro di ritaglio per nascondere la casella per l'immagine finale.
- Selezionare Azioni > Salva immagine per memorizzare l'immagine.
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Representative Results
La ricostruzione dettagliata dell'ORL è stata realizzata mediante microCT con preparazione PTA (Figura 4). La struttura fibromuscolare ligesi che si estende obliquamente tra il derma e il periosteo è stata distintamente osservata (Figura 4A). Nella vista coronale (Figura 4B), la quantità e la complessità delle fibre sono aumentate lateralmente. Nella vista orizzontale (Figura 4C), è stata osservata un'elaborata rete con una formazione arborizzata. Abbiamo osservato una forma caratterizzata da piastre continue, piuttosto che da fibre filo-come, come riportato in precedenza. Nella vista sagittale (Figura 4D), gli spessori delle fibre ORL sono diminuiti in modo inferiore. Nel complesso, questa osservazione multidirezionale ha dimostrato che l'ORL è costituito da una rete multistrato di piastre continue con variazione nel numero e nello spessore a seconda della posizione.
come illustrato nella Figura 1. I campioni sono stati raccolti e poi macchiati con soluzione PTA.
(A). I campioni sono stati fissati in formalina del 10% dopo la raccolta. (B). I campioni sono stati tagliati in pezzi più sottili per migliorare la penetrazione e poi collocati nella soluzione PTA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 2. Lo scanner microCT.
La freccia indica il vassoio in cui è posizionato il campione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella figura 3. Ricostruzione 3D.
Far scorrere il piano nella direzione interna per visualizzare le immagini sezionali all'interno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 4. Immagini 3D dell'ORL.
(A). L'immagine complessiva dell'ORL. (B). Vista coronale. (C). Vista orizzontale. (D). Vista sagittale. S, superiore; A, anteriore; L, laterale; P, posteriore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
come illustrato nella Figura 5. Strutture analizzate dell'ORL.
Giallo, rosso e verde indicano rispettivamente la pelle, il muscolo e il legamento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1. Confronto tra immagini 3D e 2D. (A). Volume ha reso immagine 3D. (B). Immagine 2D sezionale trasversale. Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per scaricare la figura.
Figura supplementare 2. Avvolgimento e fissaggio del parafilm. (A). Avvolgendo il parafilm su tutto il campione per evitare l'essiccazione. (B). Parafilm aiuta a fissare il campione saldamente sullo scanner. (C). Parafilm non è visibile sulla scansione microCT e potrebbe essere sottratto facilmente. Clicca qui per scaricare la figura.
Figura supplementare 3. Insufficiente colorazione di PTA. Uno spazio vuoto al centro mostra dove la soluzione PTA non è penetrata sufficientemente. (A). Volume ha reso immagine 3D. (B). Immagine 2D sezionale trasversale. Barra di scala : 1 mm. Fare clic qui per scaricare la figura.
Figura supplementare 4. Confronto tra cadaveri freschi e imbalsamati. Non sono state riscontrate differenze tra cadaveri freschi e imbalsamati per applicare il protocollo. L'immagine mostra un'altra caratteristica potrebbe essere presa con lo stesso metodo pure. (A). L'ORL ottenuto da un cadavere fresco. (B). La piega nasolabiale ottenuta da un cadavere imbalsamato. Clicca qui per scaricare la figura.
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Discussion
Abbiamo implementato microCT con preparazione PTA nell'esame dei tessuti molli umani. In breve, i campioni vengono raccolti e fissati in formalina per alcuni giorni, seguiti dalla disidratazione nelle soluzioni di etanolo seriale. L'inserimento del campione nella soluzione PTA direttamente dopo la fissazione della formalina può provocare alcune crepe dei tessuti a causa della rapida disidratazione. Pertanto, la disidratazione seriale è necessaria prima della colorazione PTA. Successivamente, gli esempi vengono macchiati utilizzando la soluzione PTA per circa una settimana. È quindi possibile eseguire la scansione MicroCT, la ricostruzione 3D e l'analisi. Il nostro obiettivo era quello di osservare l'ORL e le strutture adiacenti utilizzando questo metodo. Abbiamo presentato con successo il tessuto come un modello 3D. La pelle, i legamenti e i muscoli sono stati visualizzati distintamente (Figura 5).
Durante l'elaborazione dei campioni devono essere presi in considerazione diversi punti. Le dimensioni di un campione e la durata della colorazione sono preoccupazioni principali. Dopo diversi studi pilota, abbiamo scoperto che lo spessore corretto di un campione è di circa 5-7 mm e la durata corretta della colorazione è di 5-7 giorni. In queste condizioni, la soluzione PTA penetra il campione ad una velocità di circa 1 mm/giorno. Se lo spessore supera i 7 mm, il tempo di lavorazione aumenta. Quando la durata della colorazione è insufficiente rispetto al volume di un campione, l'immagine finale può includere un foro vuoto nell'area centrale del campione. Questo si verifica spesso, soprattutto a livello della pelle, e la rimozione della pelle non necessaria può migliorare l'efficienza di colorazione. Quando la durata è troppo lunga, l'intero campione sarà sovracolorato, rendendo difficile l'identificazione di ogni compartimento. Un ulteriore studio sulla durata ottimale per la colorazione di campioni più grandi potrebbe rivelarsi utile.
Di solito, il campione è diviso in pezzi per migliorare la penetrazione; è importante ricordare la posizione e la direzione di ogni campione durante questo processo. Per mantenere queste informazioni, si consiglia di cucire sulla stessa regione di ogni parte. Il filo sarà visto nell'immagine finale, e si dovrebbe fare attenzione che il filo non interferisca con l'area principale. Ad esempio, cucire sulla regione superolaterale di ogni pezzo potrebbe essere utile. Inoltre, sono necessarie analisi preliminari di una struttura anatomica per riconoscere ogni parte del tessuto a causa della loro complessità.
Parafilm e altri materiali vengono utilizzati per evitare che i campioni si asciughino. Tuttavia, lievi deformità possono verificarsi quando si avvolgono campioni. È importante preservare la forma originale nella massima misura possibile. A volte viene utilizzato un tubo liquido, invece di parafilm. Tuttavia, anche il minimo tremore di una macchina ha il potenziale di influenzare il tubo durante la scansione e potrebbe ridurre la chiarezza dell'immagine finale.
Questo approccio prevede diverse limitazioni. In primo luogo, questo protocollo non può essere fatto con un oggetto vivente. Inoltre, la dimensione del campione è limitata dalla dimensione massima di scansione dello scanner microCT. Potrebbero esserci errori durante l'analisi dell'immagine renderizzata ad occhio nudo; pertanto, potrebbero essere necessari ulteriori esperimenti istologici per confermare i risultati. Ci potrebbe essere una leggera distorsione dimensionale durante la preparazione; tuttavia, riteniamo che ciò non influisca in modo significativo sul risultato dello studio.
La scansione microCT con preparazione PTA è vantaggiosa per l'esame di compartimenti specifici all'interno di una struttura complessa. Questo studio si è concentrato sullo sviluppo di un metodo per migliorare il tasso di contrasto utilizzando la preparazione del PTA, e altre caratteristiche, come i processi di scansione e ricostruzione, sono state indicate brevemente. Tuttavia, i lettori dovrebbero essere in grado di ottenere lo stesso risultato se utilizzano scanner microCT contemporanei e programmi di analisi delle immagini dopo il processo di colorazione. Questo metodo potrebbe rivelarsi utile nelle analisi dei tessuti e delle strutture del cancro, del contributo dei nervi in aree specifiche e delle strutture anatomiche ad alta risoluzione degli organi, come il cuore e il fegato13,14,15.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da una borsa di ricerca facoltà di Yonsei University College of Medicine (6-2018-0099). Gli autori ringraziano le persone che hanno generosamente donato i loro corpi allo Yonsei University College of Medicine. Siamo grati a Jun Ho Kim e Jong Ho Bang per il loro supporto tecnico (membri del personale del Centro di educazione all'anatomia chirurgica presso lo Yonsei University College of Medicine). Siamo anche grati a Geoss Co., Ltd. per il sistema di scansione microCT di alta qualità utilizzato in questa ricerca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
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