Summary
微型 X 射线计算机断层扫描能有效地从未受损的人体标本中获取三维信息，但在观察软组织方面成效有限。使用磷酸对比剂可以解决此问题。我们实施了这种造影剂来检查人类脆弱的纤维肌组织（双眼保留韧带）。
Abstract
人工解剖和组织学观察是研究人体组织的常见方法。然而，人工解剖会损坏精细结构，而处理和组织学观察通过横截面成像提供有限的信息。微 X 射线计算机断层扫描 （microCT） 是一种在不损坏标本的情况下获取三维信息的有效工具。然而，它显示区分软组织部分的效率有限。使用抗对比度剂，如磷酸（PTA），可以通过改善软组织对比度来解决这个问题。我们使用PTA实施微CT来研究人类双目体保持韧带（ORL），这是轨道区域的微妙结构。在这种方法中，收获的试样固定在形式素中，在串醇溶液中脱水，并沾染PTA溶液。染色后，进行微CT扫描、3D重建和分析。使用这种方法可以清楚地显示皮肤、韧带和肌肉。试样大小和染色持续时间是该方法的基本特征。合适的试样厚度约为5~7毫米，超过其工艺速度减慢，最佳持续时间为5~7天，低于该厚度时，中心区域偶尔会出现空孔。为了保持切割过程中小件的位置和方向，建议在每个零件的相同区域进行缝纫。此外，需要对解剖结构进行初步分析，以正确识别每一块。帕拉膜可用于防止干燥，但应注意防止样品变形。我们的多向观察表明，ORL是由连续板的多层网状结构，而不是如前所述的线状纤维组成。这些结果表明，使用PTA进行微CT扫描有助于检查人体组织复杂结构内的特定隔间。它可能有助于分析癌症组织、神经组织和各种器官，如心脏和肝脏。
Introduction
人工解剖和组织学观察通常用于检查人体组织，如肌肉和结缔组织。然而，人工解剖很容易损坏精细的结构，组织学观察提供了关于平面横截面表面1，2的信息有限。因此，需要改进的方法，以更精确和有效地检查组织。
传统的计算机断层扫描（CT）一般用于临床实践，但它缺乏区分小结构2，3的能力。微X射线CT（微CT）是一种有效的工具，用于在不破坏小结构的情况下获取小结构的三维（3D）信息。然而，微CT的应用有限，因为只有密集的组织才能清晰地可视化;它不能用于区分软组织。为了克服这一限制，可以使用染色剂。在扫描4、5期间，磷酸（PTA）、磷酸、磷酸和卢戈尔碘等增反剂可提高软组织对比度。比较这些制剂的几项研究表明，PTA表现出良好的性能，并且易于处理6，7，8。
食道保持韧带（ORL）是轨道周围的一个微妙的结构，在常规观测9中很容易损坏。我们使用带有PTA作为对比剂的微CT，检查并成功检索了该结构的3D信息。该方法可应用于其他人体组织的研究，如心脏和肝脏，并适当修改10，11，12。
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Protocol
这项研究中使用的所有尸体都合法地捐赠给延世大学医学院的外科解剖教育中心。
1. 获取样品
- 用彩色铅笔在尸体上画一条切口线，以指示样品采集的切割区域。检查绘制的切口线是否从中直延伸到中侧，横向延伸到侧眼睑，优于下眼睑的上边缘，下至轨道边缘线下方 1 厘米。
注：根据微型CT设备的最大扫描尺寸考虑样本大小（我们的设备可以获取最大对象尺寸为7×7厘米的图像）。在这里，从ORL区域采集了一个宽度约1厘米、长约3厘米、重量为1.25克的样品。 - 用刀片切割切口线后的面部组织。确保切口很深，使刀刃的尖端接触骨骼。样品必须包括皮肤、皮下组织、肌肉、脂肪和骨膜。
- 立即将样品固定在10%的正位中，并在室温下保存5至7天（图1A）。
注：防腐和新鲜尸体可用于本研究。然而，尸体的固定溶液可能与生物实验中使用的溶液略有不同。因此，我们建议在从防腐尸体中获取样品后，再次用10%的形式固定样品。
2. 染色准备
- 固定后，将样品切成 3 块（厚度为 5~7 mm）。在此过程中，不要丢失每件件的位置和方向。
注：我们使用的微CT扫描仪的最大尺寸为7 cm3，但如果样品太厚，则PTA溶液无法成功穿透样品。 - 使用针和黑线缝合每块的上侧，以便以后可以检查样品的方向。
- 将样品在30%、50%和70%的溶液中脱水，每次1天。
- 将样品放入70%乙醇中，直到染色。
3. PTA准备
- 在安排微CT扫描前1周开始PTA染色过程。
- 制备 210 mL 的 70% 乙醇溶液，并加入 2.1 克 PTA 功率。在 55-60 rpm 转速下使用摇床进行良好混合。
注：PTA溶液的浓度应在乙醇中为1%。 - 为每个切片件准备三个 70 mL 塑料容器。用 PTA 解决方案填充容器。将试样浸泡到容器中，并放在摇床上，以便有效穿透。将样品留用 5~7 天（图 1B）。
- 染色完成后，将样品储存在 70% 乙醇中，准备进行扫描。
注：染色样品可以保存数月，但建议尽快扫描样品，以确保完全染色。
4. 微CT扫描
- 用副膜包装样品，以防止干燥。不要将样品包装得太紧，因为这可能导致变形。
- 打开扫描仪并将样品放在托盘上（图2）。
- 设置扫描参数如下：源电压（kV）= 70，源电流（μA）= 114，Al滤波器 = 0.5 mm，图像像素大小（μm2）= 20，像素 = 2240 × 2240，曝光（ms） = 500，旋转步长（deg） = 0.3。
注：参数可根据使用的样品和/或扫描仪进行修改。 - 开始扫描。
注：扫描需要 30 到 60 分钟，具体取决于预期的分辨率和扫描仪的速度。
5. 数据重建和优化
- 运行重建软件。在"操作"菜单上选择"打开数据集"以启动扫描的文件。
- 选择"重建"窗口上的"设置"选项卡。设置参数如下：环伪影还原 = 7，光束硬化校正 （%） = 40。
注： 参数可根据示例进行修改。 - 通过选择"开始"选项卡上的"开始"开始重建。最终数据将存储在指定的文件夹中。
- 运行文件大小调整软件。选择源数据集以启动重建的文件。
- 在"目标数据集"选项卡上选择jpg。
- 选择"调整大小"选项1/2，其质量选项为"无插值（快速）。"。
- 在"图像压缩"选项卡中将幻灯片条调整为100（最高）。
注： 调整大小选项是避免在渲染 3D 时降低计算机速度;但是，当广泛调整大小时，可能会导致较低的分辨率。我们建议将大小调整一半，以可接受的分辨率，并更好地处理。
6. 3D重建
- 运行 3D 卷呈现软件。
- 选择操作>加载体积数据以启动数据集。
- 通过在"传输函数编辑器"选项卡中修改直方图中的形状传输功能来调整亮度和对比度级别。
- 选择选项>照明。
- 选择"阴影"和"曲面照明"图标。这些效果提供了逼真的建模色调。
- 通过移动（单击和拖动）、旋转（右键单击和拖动）和放大或缩小（滚动）模型来查找最佳视图。
- 滑动平面（移位 + 单击并拖动内向） 以显示剖面图像 （图 3）。
- 打开"灯光"图标。调整照明指示栏，找到最佳照明供查看。然后，关闭图标并关闭"照明"选项卡。
- 选择选项>显示>裁剪框以隐藏最终图像的框。
- 选择"操作>保存图像"以存储图像。
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Representative Results
ORL的详细重建是通过使用PTA制备的微CT实现的（图4）。明显观察到了皮肤和骨膜之间倾斜的韧带纤维肌结构（图4A）。在日冕视图中（图4B），纤维的数量和复杂性横向增加。在水平视图（图4C）中，观察到了具有树形的精细网状物。我们观察到一种形状，其特征是连续板，而不是螺纹状纤维，如前所述。在下垂视图中（图4D），ORL纤维的厚度下降幅度较低。总体而言，这种多向观测证明ORL由连续板的多层网状结构组成，数量和厚度根据位置而变化。
图 1.样品被采集，然后用PTA溶液染色。
（A） .采集后将样品固定在 10% 的正金中.（B）样品被切成薄片，以提高穿透力，然后放入PTA溶液中。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.微型CT扫描仪。
箭头表示放置试样所在的托盘。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.3D 重建。
将平面滑入内部方向以查看内部剖面图像。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.ORL 的 3D 图像。
（A）ORL 的整体图像.（B）. 冠状视图.（C）水平视图.（D）. 射手观.S， 高级;A， 前;L，横向;P，后。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.已分析 ORL 的结构。
黄色、红色和绿色分别表示皮肤、肌肉和韧带。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1。3D 和 2D 图像之间的比较。（A）. 渲染的 3D 图像的体积。（B）. 横截面 2D 图像.比例尺 = 1 毫米。请点击此处下载图。
补充图2。片的包装和固定。（A）包装整个样品的片胶，以防止干燥。（B）. 片状胶有助于将样品牢固地固定在扫描仪上.（C）. 在微CT扫描中不可见，很容易被减除.请点击此处下载图。
补充图3。PTA 染色不足。中心的空心空间显示 PTA 解决方案未充分渗透的位置。（A）. 渲染的 3D 图像的体积。（B）. 横截面 2D 图像.比例尺 = 1 毫米。请点击此处下载图。
补充图4。新鲜尸体和防腐尸体的比较。新鲜尸体和防腐尸体在应用协议时没有差异。图片显示，另一个功能也可以由相同的方法拍摄。（A）ORL 是从一个新的尸体中获得的.（B）. 从防腐尸体中获得的鼻性折痕.请点击此处下载图。
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Discussion
我们在人体软组织的检查中采用PTA制剂实施微CT。简单地说，标本被收获并固定在形式上几天，随后在连续乙醇溶液中脱水。在正式固定后将样品直接放入PTA溶液中，由于快速脱水，可能导致一些组织破裂。因此，在PTA染色之前需要连续脱水。接下来，使用 PTA 溶液对样品进行大约一周的染色。然后可以执行微CT扫描、3D重建和分析。我们的目标是使用此方法观察 ORL 和相邻结构。我们成功地将组织作为3D模型呈现。皮肤、韧带和肌肉被清晰地可视化（图5）。
在处理样品时应考虑几点。标本的大小和染色的持续时间是主要问题。经过几次试验性研究，我们发现试样的正确厚度约为5~7毫米，染色的正确持续时间为5~7天。在这些条件下，PTA 溶液以大约 1 mm/天的速率穿透试样。如果厚度超过 7 mm，加工时间会增加。当与试样体积相比染色持续时间不足时，最终图像可能包括试样中心区域的空孔。这种情况经常发生，特别是在皮肤层，去除不必要的皮肤可以提高染色效率。当持续时间过长时，整个试样将被过度染色，因此难以识别每个隔间。进一步研究染色较大标本的最佳持续时间可能证明是有用的。
通常，标本被分成碎片，以提高穿透力;在这个过程中，记住每个试样的位置和方向是很重要的。为了保持此信息，建议在每个部件的相同区域进行缝纫。线程将在最终图像中看到，并且应小心线程不会干扰主区域。例如，在每块的超侧区域缝纫可能会有所帮助。此外，解剖结构的初步分析需要识别每个组织部分，因为它们的复杂性。
用于使用帕拉膜和其他材料来防止样品干燥。然而，包装标本时可能会出现轻微的畸形。必须尽可能保留原始形状。有时使用液体管，而不是副膜。然而，即使机器的轻微颤抖也可能在扫描过程中影响管子，并可能降低最终图像的清晰度。
此方法存在几个限制。首先，此协议不能用活体对象来完成。此外，样品大小受微CT扫描仪最大扫描尺寸的限制。在用肉眼分析渲染的图像时，可能会有错误;因此，可能需要额外的组织学实验来证实这些发现。准备过程中可能有轻微的尺寸失真;然而，我们认为，这并没有显著影响研究结果。
使用 PTA 制剂进行微CT扫描有利于检查复杂结构内的特定隔间。本研究侧重于开发一种利用PTA制备提高对比度的方法，并简要地指出了扫描和重建过程等其他特征。然而，如果读者在染色过程后使用当代的微型CT扫描仪和图像分析程序，应该能够得到相同的结果。该方法对分析癌症组织和结构、特定区域的神经贡献以及心脏和肝脏13、14、15等器官的高分辨率解剖结构都很有帮助。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了延世大学医学院（6-2018-0099）的教师研究资助。作者感谢那些慷慨地将遗体捐献给延世大学医学院的人们。我们感谢金正恩和钟浩邦（延世大学医学院外科解剖教育中心的工作人员）的技术支持。我们也感谢吉诺斯有限公司在这项研究中使用的高质量微CT扫描系统。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Tungsto(VI)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
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