使用微X射线计算机断层扫描与磷酸制备可视化人类纤维肌组织
Summary
微型 X 射线计算机断层扫描能有效地从未受损的人体标本中获取三维信息，但在观察软组织方面成效有限。使用磷酸对比剂可以解决此问题。我们实施了这种造影剂来检查人类脆弱的纤维肌组织（双眼保留韧带）。
Abstract
人工解剖和组织学观察是研究人体组织的常见方法。然而，人工解剖会损坏精细结构，而处理和组织学观察通过横截面成像提供有限的信息。微 X 射线计算机断层扫描 （microCT） 是一种在不损坏标本的情况下获取三维信息的有效工具。然而，它显示区分软组织部分的效率有限。使用抗对比度剂，如磷酸（PTA），可以通过改善软组织对比度来解决这个问题。我们使用PTA实施微CT来研究人类双目体保持韧带（ORL），这是轨道区域的微妙结构。在这种方法中，收获的试样固定在形式素中，在串醇溶液中脱水，并沾染PTA溶液。染色后，进行微CT扫描、3D重建和分析。使用这种方法可以清楚地显示皮肤、韧带和肌肉。试样大小和染色持续时间是该方法的基本特征。合适的试样厚度约为5~7毫米，超过其工艺速度减慢，最佳持续时间为5~7天，低于该厚度时，中心区域偶尔会出现空孔。为了保持切割过程中小件的位置和方向，建议在每个零件的相同区域进行缝纫。此外，需要对解剖结构进行初步分析，以正确识别每一块。帕拉膜可用于防止干燥，但应注意防止样品变形。我们的多向观察表明，ORL是由连续板的多层网状结构，而不是如前所述的线状纤维组成。这些结果表明，使用PTA进行微CT扫描有助于检查人体组织复杂结构内的特定隔间。它可能有助于分析癌症组织、神经组织和各种器官，如心脏和肝脏。
Introduction
人工解剖和组织学观察通常用于检查人体组织，如肌肉和结缔组织。然而，人工解剖很容易损坏精细的结构，组织学观察提供了关于平面横截面表面1，2的信息有限。因此，需要改进的方法，以更精确和有效地检查组织。
传统的计算机断层扫描（CT）一般用于临床实践，但它缺乏区分小结构2，3的能力。微X射线CT（微CT）是一种有效的工具，用于在不破坏小结构的情况下获取小结构的三维（3D）信息。然而，微CT的应用有限，因为只有密集的组织才能清晰地可视化;它不能用于区分软组织。为了克服这一限制，可以使用染色剂。在扫描4、5期间，磷酸（PTA）、磷酸、磷酸和卢戈尔碘等增反剂可提高软组织对比度。比较这些制剂的几项研究表明，PTA表现出良好的性能，并且易于处理6，7，8。
食道保持韧带（ORL）是轨道周围的一个微妙的结构，在常规观测9中很容易损坏。我们使用带有PTA作为对比剂的微CT，检查并成功检索了该结构的3D信息。该方法可应用于其他人体组织的研究，如心脏和肝脏，并适当修改10，11，12。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们在人体软组织的检查中采用PTA制剂实施微CT。简单地说，标本被收获并固定在形式上几天，随后在连续乙醇溶液中脱水。在正式固定后将样品直接放入PTA溶液中，由于快速脱水，可能导致一些组织破裂。因此，在PTA染色之前需要连续脱水。接下来，使用 PTA 溶液对样品进行大约一周的染色。然后可以执行微CT扫描、3D重建和分析。我们的目标是使用此方法观察 ORL 和相邻结构。我们成功地将组织…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了延世大学医学院（6-2018-0099）的教师研究资助。作者感谢那些慷慨地将遗体捐献给延世大学医学院的人们。我们感谢金正恩和钟浩邦（延世大学医学院外科解剖教育中心的工作人员）的技术支持。我们也感谢吉诺斯有限公司在这项研究中使用的高质量微CT扫描系统。
Materials
| 12 Tungsto(Ⅵ)phosphoric acid n-hydrate Phosphotungstic acid |
Junsei | 84220-0410 | PTA powder |
| CTvox | Bruker | ver 2.7 | 3D recon software |
| Nrecon | Bruker | ver 1.7.0.4 | Reconstruction software |
| Skyscan | Bruker | 1173 | MicroCT scanner |
| Tconv | Bruker | ver 2.0 | File resizing software |
References
- Nierenberger, M., Remond, Y., Ahzi, S., Choquet, P. Assessing the three-dimensional collagen network in soft tissues using contrast agents and high resolution micro-CT: Application to porcine iliac veins. Comptes Rendus Biologies. 338 (7), 425-433 (2015).
- Vymazalová, K., Vargová, L., Zikmund, T., Kaiser, J. The possibilities of studying human embryos and foetuses using micro-CT: a technical note. Anatomical Science International. 92 (2), 299-303 (2017).
- Tesařová, M., et al. Use of micro computed-tomography and 3D printing for reverse engineering of mouse embryo nasal capsule. Journal of Instrumentation. 11 (3), 1-11 (2016).
- Nemetschek, T., Riedl, H., Jonak, R. Topochemistry of the binding of phosphotungstic acid to collagen. Journal of Molecular Biology. 133 (1), 67-83 (1979).
- Rao, R. N., Fallman, P. M., Falls, D. G., Meloan, S. N. A comparative study of PAS-phosphotungstic acid-Diamine Supra Blue FGL and immunological reactions for type I collagen. Histochemistry. 91 (4), 283-289 (1989).
- Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9 (11), (2009).
- Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Nieminen, H. J., et al. Determining collagen distribution in articular cartilage using contrastenhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 23 (9), 1613-1621 (2015).
- Kwon, O. J., Kwon, H., Choi, Y., Cho, T., Yang, H. Three-dimensional structure of the orbicularis retaining ligament: an anatomical study using micro computed tomography. Scientific Reports. 8 (1), 17042 (2018).
- Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLoS One. 12 (2), e0170597 (2017).
- Zikmund, T., et al. High-contrast differentiation resolution 3D imaging of rodent brain by X-ray computed microtomography. Journal of Instrumentation. 13 (2), 1-12 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Nieminen, H. J., et al. 3D histopathological grading of osteochondral tissue using contrast-enhanced micro-computed tomography. Osteoarthritis Cartilage. 26 (8), 1118-1126 (2018).
- Greef, D. D., Buytaert, J. A. N., Aerts, J. R. M., Hoorebeke, L. V., Dierick, M., Dirckx, J. Details of Human Middle Ear Morphology Based on Micro-CT Imaging of Phosphotungstic Acid Stained Samples. Journal of Morphology. 276 (9), 1025-1046 (2015).
- Sutter, S., et al. Contrast-Enhanced Microtomographic Characterisation of Vessels in Native Bone and Engineered Vascularised Grafts Using Ink-Gelatin Perfusion and Phosphotungstic Acid. Contrast Media & Molecular Imaging. 2017, (2017).
