Summary
I dette manuskriptet presenteres en protokoll for å utføre FACS-basert måling av BK-polyomavirus transcriptional aktivitet ved å bruke HEK293T celler transfekterte med en toveis reporter plasmider som uttrykker tdTomato og eGFP. Denne metoden videre gjør det mulig å kvantitativt bestemme innflytelsen av romanen forbindelser på viral transkripsjon.
Abstract
Polyomaviruses, som BK-polyomavirus (BKPyV), kan forårsake alvorlige sykdommer hos immunsupprimerte pasienter. Men, siden svært effektive antivirale midler er for øyeblikket ikke tilgjengelig, metoder måle effekten av potensielle antivirale midler er nødvendig. Her, en dual fluorescens reporter som gjør at analysen av BKPyV ikke-koding kontroll-regionen (NCCR) drevet tidlig og sent promoter aktivitet ble konstruert for å kvantifisere effekten av potensielle antivirale legemidler på viral genuttrykk via tdTomato og eGFP Uttrykk. I tillegg, ved kloning BKPyV-NCCR amplicons som i denne protokollen har blitt eksempelvis innhentet fra blod-avledet DNA av immunsupprimerte nyretransplanterte pasienter, kan virkningen av NCCR-rearrangements på viral genuttrykk bestemmes. Etter kloning av pasienten avledet amplicons, HEK293T celler ble transfekterte med reporter-plasmider, og behandlet med potensielle antivirale midler. Deretter ble celler utsatt for FACS-analyse for måling bety fluorescens intensitet 72 h post transfeksjoner. Å også teste analyse av legemidler som har en potensiell celle syklus hemmende effekt, bare transfekterte og dermed fluorescerende celler brukes. Siden denne analysen er utført i store T antigen uttrykke celler, kan virkningen av tidlig og sent uttrykk analyseres på en gjensidig uavhengig måte.
Introduction
Polyomaviruses representerer en uavhengig familie av små dobbel-strandet DNA (dsDNA) virus med Simian virus 40 (SV40) som en prototype arter. Den primære infeksjonen oppstår hovedsakelig i løpet av barndommen, som vanligvis går uten sykdomssymptomer og vanligvis forårsake latente infeksjoner i uimottakelig kompetente verter. Den BK-polyomavirus (BKPyV) hovedsakelig vedvarer i renal tubuli celler uten å forårsake nephropathologies, men i tilfelle av svekkelse av immun-kompetanse etter nyre transplantasjon viruset kan reaktivere og forårsake alvorlige skader og nedsatt pode funksjon når man når en høy viremia (1 x 104 BKPyV DNA eksemplarer/ml)1,2. I ca 10% av nyre transplantasjon mottakere, reaktivering av BK-polyomavirus (BKPyV) resulterer i en polyomavirus assosiert nefropati (PyVAN), som var opp til 80% assosiert med en høy risiko for nyres allograft svikt3,4 . Siden ingen godkjente antivirale midler er tilgjengelig, er aktuell behandling basert på reduksjon av immunsuppresjon. Interessant, mTOR hemmere synes å ha en antiviral effekt; Dermed kan det å bytte immunsuppressiv-behandlingen til mTOR-baserte immunsuppresjon representere en alternativ tilnærming for å hindre progresjon av BKPyV viremia5,6,7. Imidlertid, det mTOR-basert antiviral mekanikk er aktuelle fremdeles ufullstendig forstod. Dermed kreves metoder som måler virkningen av potensielle antivirale midler i klinisk relevante konsentrasjoner.
Den sirkulære Genova av BKPyV består av ca 5 kb harboring en ikke-koding kontroll region (NCCR) som fungerer som en opprinnelse av replikering og samtidig en toveis promoter kjører uttrykk for tidlig og sent fase mRNA transkripsjoner. Siden spontant forekommende NCCR-rearrangements, slettinger og duplikasjoner finnes i patogene BKPyV8 og signifikant akkumulert hos pasienter som lider av PVAN5,9, en sammenligning av arketypiske (WT) og re-arrangert (RR) NCCR-aktiviteter er nyttig å karakterisere viral replicative fitness.
Som oppsummert i figur 1, beskriver denne protokollen en vanlig brukt metode for å måle BKPyV NCCR transcriptional aktivitet ved kvantifisere fluorescens av to fluorophores TdTomato og eGFP uttrykt fra en reporter plasmider5, 9,10,11. Prosedyren utføres i nærvær av SV40 store T antigen (lTAg), som gjør det mulig å analysere virkningen av potensielle antivirale midler på tidlig og sent NCCR-aktivitet separat5. Denne analysen analyserer videre virkningen av rearrangements på NCCR aktivitet og sammenligning med WT-NCCRs5,9. Reporteren plasmider havner i SV40 sent polyadenylation signal nedstrøms for hver fluoroforen åpne lese ramme for å sikre sammenlignbare og effektiv behandling av både transkripsjoner for tdTomato og eGFP, henholdsvis. Sammenlignet med qRT-PCR baserte metoder5,12, denne FACS-basert tilnærming representerer en lav kostnad og høy gjennomstrømming kompatibelt alternativ siden ingen kompliserte utvinning protokoller for infiserte cellekultur og ingen dyre antistoffer for immun fluorescens farging er nødvendig. Videre, siden en definert mengde fluorescerende celler er analysert via Flow flowcytometri, analyse av celle syklus hemme agenter er også mulig i en kvantitativ måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen følger retningslinjene for menneskelig forskning som godkjent av ethic Committee av medisinsk fakultet ved Universitetet i Duisburg-Essen (14-6028-BO).
1. innsamling av blod-eller urinprøver og isolering av polyomavirus DNA
- Samle minst 3 mL blod i EDTA-rør eller urin i oppkjøpet rør.
- Sentrifuger prøven ved 2 500 x g i 15 min. Hvis nødvendig, pipette plasma inn i et nytt rør og oppbevar plasma prøvene ved 4 ° c i flere dager eller fryse ved-20 ° c for lengre lagring.
- Forbered 40 μL av proteinase K i et 1,5 mL mikrosentrifugen rør og tilsett 400 μL av plasma ved pipettering.
- Lyse prøven ved å tilsette 400 μL av lyseringsbuffer, Vortex for 15 s, og ruge i 10 minutter ved 56 ° c.
- Isolere DNA ved hjelp av en DNA blod utvinning kit som beskrevet i produsentens instruksjoner. Kort, tilsett alkohol og laste lysater på en spin kolonne som inneholder en DNA-binding silica-basert membran. Vask kolonnene flere ganger for å gi ren DNA.
- Eluere ga DNA i 30-50 til μL av TE-buffer.
2. forsterkning av ikke-koding kontroll region (NCCR)
- Utfør følgende prosedyre i fysisk separerte rom. Bruk et isolert rom til å klargjøre reagensene og fordele blandingen til PCR-rørene.
- Forbered Master mix for pre-PCR ved hjelp av primer par A (tabell 1) i et total volum på 50 μL og bruk det tidligere isolerte DNA fra trinn 1,6. Pipettering ordningen for å klargjøre Master miksen for den pre-og nestede PCR-en skrives ut i tabell 2.
- Distribuer 45 μL av Master blandingen i PCR-rørene.
- Tilsett 5 μL av isolert DNA i PCR-rørene.
Merk: Bruk et annet rom enn det for Master Mix forberedelse for å unngå forurensning. - Kjør PCR med reaksjons betingelsene som vist i tabell 3. Gjenta denaturering, annealing og utvidelse i 35 sykluser.
- For den nestede forsterkningen bruker primer par B harboring Begrensnings sider for AgeI og SpeI (tabell 1).
- Kjør den nestede PCR med reaksjons betingelsene som beskrevet i trinn 2,2 til 2,5 ved hjelp av 5 μL av pre-PCR.
- Bland 10 μL av PCR-produktet med 2 μL av 6 ganger gel lasting fargestoff. Load 10 μL av Mix på en 1,5% agarose gel, og kjøre gel for 30 min ved 60 mA.
- Visualiser gelen ved hjelp av et egnet UV-dokumentasjons system.
Merk: størrelsen på amplicon er forventet å være mellom 300-500 BP avhengig av om rearrangements (slettinger, innsettinger eller duplikasjoner) oppstod (figur 2C). - Rens PCR-amplicons ved hjelp av et PCR rensesett i henhold til produsentens anvisninger. Eluere PCR-amplicons i 30 μL av eluering buffer.
- Send amplicons for sanger sekvensering ved hjelp av primer par B.
3. kloning av NCCR i den doble fluorescens reporter
- Fordøye renset amplicons (trinn 2,10) med AgeI og SpeI for 2 timer ved 37 ° c som beskrevet i Tabell 4.
- Gjenta trinn 2,10 og rens de fordøyd amplicons.
- Parallelt, også fordøye plasmider ryggrad (1,5 μg) med AgeI og SpeI for 2 timer ved 37 ° c som beskrevet i tabell 5. Dette trinnet må bare utføres én gang. For påfølgende reaksjoner, fryse fordøyelsen ved-20 ° c.
- Analysere fordøyd plasmider ryggraden på en 0,8% lav smelte agarose gel.
Merk: ikke Kjør gelen med en strøm som er høyere enn 40 mA. Den forventede innsatsen av avstands regionen opprinnelig avledet fra plasmider pEX-K4 2-LTR CD313 er 128 BP (figur 2C). - Visualiser DNA-fragmenter ved hjelp av Langbølge UV-lys (320 NM) og skjær ut ryggraden båndet ved hjelp av en ren skalpell. Overfør den lave smelte gel fragment til en ny 1,5 mL mikrosentrifugen tube. Unngå lange UV eksponeringstider for å forhindre DNA-skade.
Merk: siden lav smelte agarose brukes, er det ikke nødvendig å rense DNA før ligation. - Heat ryggraden som inneholder den lave smelte agarose stykke i 10 min ved 65 ° c for å smelte gel stykke og bland hver 2 min med milde virvlingen. Den smeltet gel kan brukes direkte for ligation.
- Ombinde ryggraden og den fordøyd amplicon ved hjelp av T4 DNA ligase over natten ved 16 ° c ved hjelp av ordningen vist i tabell 6.
- Utfør transformasjon i E. coli ved hjelp av varme sjokk metoden, plate bakterier på lb-amp plater, og kultur på 37 ° c over natten.
- På neste dag, velge tre positive kloner og forberede over natten E. coli kulturer (5 ml lb-amp) og kultur ved 37 ° c.
- Isolere plasmider-DNA ved hjelp av standardprotokoller som beskrevet andre steder14, utføre AgeI og SpeI fordøyelsen å se etter positive kloner og visualisere kutte ut fragmenter på en 1% agarose gel. Avstands båndet (128 BP) vil bli erstattet av den større NCCR-sekvensen (300-500 BP, se ovenfor).
- Send plasmider for sanger sekvensering ved hjelp av primer EGFP-N eller primer par B (tabell 1).
- Siden mutasjoner kan spontant forekomme, sammenligner sekvensering resultatene med sekvensering resultatene oppnådd med amplicon. Bruk bare kloner som inneholder identiske sekvenser sammenlignet med amplicon.
- Bruk en molekylær arbeidsbenk programvare (f. eks freeware GENtle 1.9.4 eller andre sekvens redigering programmer) for å justere og redigere de oppnådde sekvenser (Figur 3).
- Start forsiktig 1.9.4 og importere DNA-sekvenser ved å klikke på import -knappen (grønn pil ned).
- Neste klikk på verktøyet og velg justering fra menyen (bruk CTRL + G som en snarvei) og velg DNA sekvenser for justering.
- Legg til en sekvens i justeringen ved å klikke på Legg til eller fjern en sekvens ved å klikke på Fjern. Inkluder en arketypiske NCCR konsensus sekvens som JN19243815, ikke bruk NCCR-sekvensen fra den vanlig brukte Dunlop-stamme16, siden det havner rearrangements og duplikasjoner andre enn arketypiske BKPyV Stammer.
Merk: NCCR inneholder allerede translational Start-Codon (Figur 3). - Velg en metode for justering ved å klikke på algoritmen i verktøylinjen og velg clustal W. sett justerings parametrene til match 2; gap forlengelse straff-1; gap straffen-2 og klikk på OK for å kjøre justeringen.
4. transient transfeksjoner av HEK293T celler med reporteren plasmider og behandling med potensielle antivirale midler
- For å forberede tilstrekkelige mengder plasmider DNA for påfølgende transfeksjoner eksperimenter utarbeide en 150 mL over natten kultur. Isoler plasmider DNA ved hjelp av et plasmider isolasjons sett. Alternativt kan andre plasmider rensing kits brukes.
- Seed 1 x 105 HEK293T celler i DMEM inneholder 10% FCS, penicillin og Streptomycin (1x) per brønn av en 12-brønn plate 24 h før transfeksjoner og ruge over natten ved 37 ° c og 5% co2 for å opprettholde aktiv spredning under transfeksjoner.
Merk: celler bør være omtrent 80% confluent ved transfeksjoner. - Plasser 250 μL av reduserte serum medier i et sterilt rør og tilsett 1 μg av hver reporter plasmider DNA og bland forsiktig ved pipettering.
- Tilsett 3 μL av transfeksjoner reagens til DNA-blandingen, bland forsiktig ved pipettering og ruge i 15 min. varm transfeksjoner reagens til omgivelsestemperaturen på 22 ° c og Vortex forsiktig før bruk.
- Tilsett blandingen drop-klok til brønnene og forsiktig fordele til brønnen.
- Etter 4 h, Erstatt supernatanten med friskt medium som inneholder testing agenter og løsemiddel kontroll. Ruge ved 37 ° c til analyse. I dette eksempelet ble mTOR-hemmere INK128 (100 ng/mL) og Rapamycin (100 ng/mL) brukt.
5. fluorescens mikroskopi og Flow flowcytometri
- Kontroller celler for de røde og grønne fluorescens under det fluorescens mikroskopet (Figur 4).
Merk: røde og grønne fluorescens tilsvarer henholdsvis tidlig og sen BKPyV genuttrykk. - Etter 72 h post transfeksjoner, aspirer supernatanten og vask cellene to ganger med 1 mL kald PBS.
- Legg forsiktig til 500 μL av Trypsin og snu platen litt for å unngå prematur avløsning av cellene. Dette trinnet er viktig å unngå celle doublets.
- Etter tillegg, Fjern Trypsin direkte med samme pipette spissen.
- Ruge cellene i minst 5 min ved 37 ° c.
- Resuspend trypsinized celler med 1 mL PBS inneholder 3% FCS og overføre suspensjonen i pre-merket FACS rør.
- Legg til DAPI (1 μg/mL) før FACS-analysen.
- Analyser cellene ved hjelp av en strømnings flowcytometer. For hver prøve, måle minst 10 000 levende celler, som er negative for DAPI farging.
6. data analyse
- Importer dataene til flyt flowcytometri analyseprogramvare, og Legg til eksempler ved å klikke og dra inn i arbeidsområdet.
- Dobbeltklikk på den importerte filen og lage en graf plot. Velg FSC-A versus SSC-A ved å klikke på x-og y-aksen. Gate den viktigste cellen befolkningen ved å klikke på polygon på verktøylinjen og innramming cellen befolkning (figur 5). Gi navn til den valgte celle populasjonen etter behov (for eksempel "enkeltceller"). "Enkeltceller" vises som et nytt arbeidsområde.
- Fortsett med gating "enkeltceller" for DAPI negative (dvs. "levende celler"). Å identifisere levende celler sammenligne cellen befolkning med og uten DAPI farging. I begge tomter velger FSC-A versus Stillehavet-Blue-A.
- Klikk på rektangelet og velg DAPI negativ celle befolkning, navn den valgte cellen befolkning "levende celler", og opprette en ny prikk-plot som viser FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) som beskrevet før.
- Legg til kvadranter i "levende celler" ved å velge Quad fra verktøylinjen. Gate befolkningen ved å dra midten av kvadrant til kanten av hver populasjon. Kvadranter representerer 1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM +, 3) eGFP + tdTOM-, 4) eGFP + tdTOM +.
Merk: på grunn av Spectral overlay av utslipp Spectra mellom FITC og PE, første kompensasjon er avgjørende for å skille mellom røde og grønne signaler og for å oppnå nøyaktige resultater. - Bestem bety fluorescens intensitet (mikrofinansinstitusjoner) ved å høyreklikke på kvadrant og velge Legg til statistikk. Velg Mean og klikk OK. Gjennomsnittlig MFI vises nå under populasjonen i seksjonen "statistikk". Kvadranter 2 og 4 tilsvarer tidlig uttrykk, mens kvadranter 3 og 4 representerer sen uttrykk.
- Legg til flere replikerer på samme måte for statistisk kraft.
- For data tolkning tomten MFI verdier av tidlig og sent inn i en bar Plot:
- For å sammenligne NCCR aktiviteter innhentet fra ulike givere eller virusstammer, legge til en arketypiske kontroll eller Dunlop stamme16 og sette sin relative mikrofinansinstitusjoner til 100%, og beregne den relative MFI verdier. Gjenta med hver replikere og Bestem gjennomsnitt og standardavvik.
- For å evaluere en effekt av potensielle forbindelser på transcriptional aktivitet, sette løsemiddel-kontroll til 100% og plotte MFI av behandlede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette representative eksperimentet ble BK-polyomavirus non-Coding Control region drevet transcriptional aktivitet målt via strømnings flowcytometri. I tillegg, en mTOR inhibitor, som kan brukes til å behandle pasienter etter BKPyV reaktivering, ble testet for sin hemming av viral tidlig genuttrykk. For å gjøre dette, en dual fluorescens-reporter analysen ble brukt som publisert tidligere5. Det generelle arbeidsflytoppsettet for det eksperimentelle oppsettet illustreres i Fdelig 1. For det første, blodprøver fra immunsupprimerte nyretransplanterte pasienter ble samlet inn i henhold til retningslinjene for menneskelig forskning som er godkjent av den institusjonelle etikk komiteen. Blodet ble samlet i EDTA-inneholdende rør og fasene ble separert av sentrifugering. Deretter ble 400 μL av plasma brukt til isolering av polyomavirus DNA. Den ikke-koding kontroll region (NCCR) ble forsterket ved hjelp av en nestet-PCR-protokollen som illustrert i figur 2a bruker ytre PRIMER pair BKV-CR-1FW og BKV-CR-1rv, samt den indre PRIMER pair BKV-CR-2Fw-AgeI (primer AgeI) og BKV-CR-2Rv-SpeI ( Primer SpeI)17, sistnevnte som havner begrensningen nettsteder for AgeI og SpeI. Amplicon verifisering ble utført via agarose gel elektroforese som vist i figur 2b. Mens amplicons avledet fra arketypiske NCCR sekvenser (WT) hadde en homogen størrelsesfordeling i gel, de som stammer fra omorganisert NCCRs med innsettinger (RRins) og slettinger (RRdel) forskjellig i deres størrelse (ca. 300-500 BP). Spesielt på grunn av rearrangements, Dunlop NCCR referanse sekvens16 (Dun), som ble inkludert som en kontroll, var større enn NCCR innhentet fra arketypiske virus. Siden amplicons tilsvarte spådde størrelser, renset PCR produktene ble sendt for sanger sekvensering for senere sammenligning med sekvenser klonet i reporteren plasmider for videre analyse.
For kloning av amplicons, ble fordøyelsen utført ved hjelp av to begrensning enzymer AgeI og SpeI. Etter kloning i dual fluorescens reporter, som ble utført ved hjelp av standard kloning prosedyre, utvalg av positive kloner som inneholder NCCR ble verifisert av AgeI og SpeI fordøyelsen (figur 2C). Her ble den lille avstands regionen (NC, 128 BP) erstattet av de større NCCR-fragmentene (ca. 300-500 BP) som indikerer positive kloner. Plasmider DNA isolert fra verifiserte kloner ble sendt for sanger sekvensering og sammenlignet med sekvenser innhentet fra amplicon sekvensering (ikke vist). Bare de kloner som samsvarer med amplicon sekvensen ble valgt for videre behandling. Som avbildet i Figur 3, ble resultatene av sekvensering sammenlignet med en arketypiske NCCR-SEKVENS (JN192438). I dette eksempelet ble det oppdaget en sletting i P-blokken og en erstatning i O-blokk.
For å senere teste transcriptional aktivitet av klonet NCCR sekvenser i cellekultur, HEK293T celler ble midlertidig transfekterte med de respektive reporter konstruksjoner (figur 4a). Som det ble observert i figur 4b, ble transfeksjoner effektivitet og NCCR-aktivitet overvåket via fluorescens mikroskopi. Røde og grønne fluorescens tilsvarte tidlig og sent BKPyV genuttrykk, henholdsvis5. Cellene uttrykte både fluorophores indikerer effektiv tidlig og sen Promotor aktivitet. Som illustrert av de to eksemplene, den første NCCR (NCCR1) viste et sterkt sent genuttrykk, mens det andre eksempelet (NCCR2) hadde en forholdsvis sterk tidlig, men moderat sent genuttrykk (figur 4b). Dermed ble prøvene forberedt for strømnings flowcytometri måling. Som beskrevet i protokollen § 6, DAPI negative celler var gated (figur 5a, nedre panel) og en prikk tomten ble opprettet viser EGFP versus tdTomato. Prøver som var negative (figur 5B), samt de positive for TdTomato (figur 5C) eller EGFP (fig.5D), ble inkludert i analysen. Merk, første kompensasjon ble utført, noe som er viktig å skille røde og grønne signaler og for å oppnå nøyaktige resultater18. Mean fluorescens intensitet ble avledet fra hver testing klone. Her tilsvarte tdTomato positive celler tidlig uttrykk mens eGFP positive celler representerte et sent uttrykk. I dette eksempelet behandling med dual mTOR inhibitor INK128 signifikant redusert tdTomato MFI (figur 5e-F), noe som betyr at tidlig uttrykk ble hemmet.
Figur 1 : Arbeidsflytskjema for det eksperimentelle oppsettet. 1) samling av blod (alternativt urin) prøver, 2) isolering av polyomavirus DNA 3) forsterkning av det ikke-koding kontrollområdet (NCCR) ved hjelp av en nestet-PCR-protokoll, 4) Agarose gel elektroforese og amplicon verifikasjon, 5) sanger SEKVENSERING av PCR-amplicon, 6) kloning av NCCR i dual fluorescens reporter bruker AgeI og SpeI, 7) utvalg av positive kloner, 8) sanger sekvensering av plasmider DNA, 9) Transient transfeksjoner av HEK293T celler med reporteren plasmider og tilsetning av forbindelser som skal testes, 10) fluorescens mikroskopi å verifisere effektiv transfeksjoner, 11) Flow flowcytometri analyse, 12) gating og analyse av eGFP tdTomato uttrykk, 13) data tolkning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : NESTET PCR og representativ analyse av pasient AVLEDET NCCR-amplicons. A) DNA avledet fra immunsupprimerte nyre transplantedpatients ble utsatt for HALVT nestet PCR forsterkning ved hjelp av oligonukleotid primere knyttet til restriksjons nettsteder AgeI og SpeI. Primer navn og lengde (base par) av arketypiske O, P, Q, R, og S-blokker fra BKPyV belastning JN192438 er angitt i parentes. B) Amplicons ble analysert av elektroforese i 1,5% agarose gel og visualisere ved hjelp av DNA farging. M1 = 100 BP stige, WT = wildtype (arketypiske), RR = omorganisert, ins = innsettinger, del = SLETTINGER, dun = Dunlop stamme. C) plasmider fordøyelsen med AgeI og SpeI. Fordøyd fragmenter ble analysert av elektroforese i 1,5% agarose gel og visualisere ved hjelp av DNA farging. M1 = 100 BP stige, m2 = 2-log stigen. NC = negativ kontroll (spacer). + = positiv klone. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Kloning og validering av NCCR i den doble fluorescens reporter. Representative resultater av plasmider sekvenser. Amplicons ble renset ved hjelp av en PCR rensing kit og utsatt for sanger sekvensering. De respektive sekvensene ble justert til NCCR sekvensen avledet fra arketypiske BKPyV belastning JN192438. Slettinger og erstatninger merkes med rødt. Den AgeI og SpeI begrensning nettsteder, translational starten av eGFP åpne lesing ramme (trykt i fet skrift) samt NCCR blokkene O-S er indikert. De respektive blokkene og Begrensnings stedene er uthevet i farger. Lengden på hver NCCR-blokk i basis parene skrives ut i parentes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representative fluorescens mikroskopi analyse av tidlig og sen NCCR promoter aktivitet. A) gen kart over den dobbelte fluorescens reporter under kontroll av toveis arrangøren. Som beskrevet tidligere5 i plasmider PTA-TDTOM-NCCR-eGFP (6 009 BP) havner SV40 sent polyadenylation signal nedstrøms av hver uttrykks kassett for å sikre sammenlignbare og effektiv behandling av både transkripsjoner for tdTomato (tidlig uttrykk) og eGFP (sen uttrykk), henholdsvis. NCCR er flankert av AgeI og SpeI. Vektoren inneholder en Ampicillin motstand kassett for valg under kloning prosedyre. B) HEK293T celler ble transfekterte med dual-fluorescens reporter konstruerer hver under kontroll av pasient avledet NCCR SEKVENSER (NCCR1-2). Celler ble utsatt for brightfield og fluorescens mikroskopi analyse 72 h post transfeksjoner. Filter innstillingene til mikroskopet ble brukt i følgende eksitasjon områder: grønn for tdTomato (515-560 NM) og blå for eGFP (450-490 NM). Målestokken (200 μm) er indikert nederst til høyre i hver fotografering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : REPRESENTATIVE FACS analyse. Vist er den enkle gating strategien som kreves for denne metoden. To-parameter tetthet eller prikk tomter brukes. A) først er FSC plottet mot Pacific Blue, mens bare DAPI negative (dvs. levende celler) er videre behandlet. B-F) FITC (eGFP) versus PE (tdTomato) er plottet. C-D) Legg utelukkende grønne og røde fluorescerende celler for å justere kompensasjonen på strømnings flowcytometer. E-F) I dette eksempelet mTOR hemmere INK128 og reduserer tdTomato MFI, som tilsvarer en reduksjon av BKPyV tidlige genuttrykk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Primer navn | Rekkefølge (5 ' → 3 ') |
| BK-CR-fwd1 | CCCAGGCAGCTCTTTCAAGGC |
| BK-CR-Rev1 | CCTCTAACAAAATTCCAGCAAAAGC |
| BKV-CR-2-FW-AgeI | AAAAAAACCGGTTTTTGCAAAAATTGCAAAAGAATAGG |
| BKV-CR-2-RV-SpeI | TTTTTTACTAGTCTGGCGCAGAACCATGGCCTT |
| EGFP-N | CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG |
Tabell 1: Oligonukleotider brukt i denne protokollen. De understrekede basene angir Begrensnings enzym områdene for henholdsvis AgeI og SpeI.
| Komponent | Volum/reaksjon (μL) | siste konsentrasjon |
| RNase-fritt vann | 32,8 μL | - |
| 10x PCR buffer | 5 μL | 1x |
| dNTPs (10 mM av hver) | 1 μL | 0,2 mM av hver dNTP |
| Fwd-primer (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Rev-primer (10 μM) | 3 μL | 0,3 μM |
| Taq polymerase | 0,2 μL | 2 enhet/reaksjon |
| Mal DNA | 5 μL | < 0,5 μg/50 μL reaksjon |
Tabell 2: Klargjørings protokoll for Master mix. Instruksjonen gjelder både pre-og nestede PCR-reaksjoner som beskrevet i henholdsvis trinn 2,2 og 2,7.
| Temperatur | Varighet | PCR-trinn | Sykluser |
| 95 ° c | 5 min | Første denaturering | |
| 95 ° c | 30 sek | Denaturering | |
| 55 ° c | 34 sek | Annealing | x35 |
| 72 ° c | 1 min | Forlengelsen | |
| 72 ° c | 10 min | Siste utvidelse | |
| 4 ° c | ∞ | Kjøling |
Tabell 3: PCR program som brukes for NCCR forsterkning. Instruksjonen gjelder både pre-og nestede PCR-reaksjoner.
| Reagens | Volum/reaksjon (μL) | siste konsentrasjon |
| DNase-gratis H20 | 6 | til 20 μL |
| 10x buffer | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 enheter |
| SpeI | 1 | 10 enheter |
| renset PCR-amplicon | 10 | Variabel |
Tabell 4: Amplicon fordøyelsen protokollen. Instruksjonen gjelder for samtidig fordøyelse av amplicon DNA med to restriksjon enzymer beskrevet i trinn 3,1.
| Reagens | Volum/reaksjon (μL) | siste konsentrasjon |
| DNase-gratis H20 | 14,5 for alle | til 20 μL |
| 10x buffer | 2 | 1x |
| AgeI | 1 | 10 enheter |
| SpeI | 1 | 10 enheter |
| Plasmider ryggrad (1 μg/μL) | 1,5 for alle | 1,5 μg |
Tabell 5: Plasmider fordøyelsen protokollen. Instruksjonen gjelder for samtidig fordøyelse av plasmider DNA ryggraden med to restriksjon enzymer beskrevet i trinn 3,3.
| Reagens | Volum/reaksjon (μL) | siste konsentrasjon |
| DNase-gratis H20 | 7 | til 20 μL |
| T4 DNA-ligase | 1 | 20 |
| 10x T4 DNA ligase buffer | 2 | 1x |
| Renset plasmider ryggrad Lav smelte utvannet 1/2 fra trinn 3,5 |
2 | Variabel |
| Fordøyd og renset PCR-amplicon fra trinn 2,7 | 8 | Variabel |
Tabell 6: Plasmider ligation protokoll. Instruksjonen gjelder for ligation av plasmider DNA-ryggrad med det fordøyd PCR-amplicon DNA beskrevet i trinn 3,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenteres en ofte brukt metode som gjør det mulig for analyse av BKPyV ikke-koding kontroll-region (NCCR) drevet tidlig og sent promoter aktivitet. Den NCCR aktivitet kan måles samtidig og trenger ikke lyse av transfekterte celler. Videre kan et relativt stort antall celler bli analysert og co-transfeksjoner av ekstra markører for normalisering av de fluorescens verdiene er ikke nødvendig.
En kritisk del av denne metoden er at klonet NCCR skal inneholde nøyaktig de samme sekvensene som identifisert av amplicon sekvensering, som tilsvarer de fleste variantene tilstede i pasientens plasma. For å oppnå nøyaktige resultater og minimere PCR-utsatte feil er det sterkt anbefalt å bruke en polymerase med korrektur lese aktivitet. Alternativt kan sekvenser bestilles av kommersielle gen syntese tjenester. De utpekte NCCR-sekvensene kan bestilles, inkludert flankerer AgeI-og SpeI-restriksjons områder for direkte kloning. I dette tilfellet, fordøye plasmider parallelt med ryggraden plasmider og erstatte avstands innsatsen med det tilsvarende NCCR-fragmentet fra syntetisert konstruksjon. DNA kan alternativt isoleres fra urinprøver. Men siden BKPyV er også skilles ut i urinen ved immunkompetente individer og ikke nødvendigvis reflekterer aktiv replikering, klinisk relevans er begrenset. Ideelt sett kan DNA også isoleres fra renal biopsier der tidligere PVAN kunne histologisk oppdages (Sammenlign med Korth et al., 201919).
Ved å måle gjennomsnittlig fluorescens intensitet av grønne og røde fluorescerende celler, tillater denne metoden å kvantifisere NCCR-avledet fluorescens/aktivitet uten skjevhet av transfeksjoner effektivitet og anti-proliferativ effekter av de testede agentene (f. eks, dual mTOR hemmere INK128 eller PP242)5.
En annen anvendelse av reporteren systemet er muligheten for å analysere konsekvensene av innsettinger, slettinger, eller duplikasjoner i NCCR funnet i klinisk isolerer på tidlig og sent Promotor aktivitet. I tidligere studier har immunsuppressiv agenter blitt studert for å modulere NCCR aktivitet; men ingen mutasjoner eller NCCR rearrangements ble funnet som påvirker mottakelighet. Mutasjoner kan imidlertid påvirke responsen på nye stoffer som kan bli godkjent i nær fremtid.
Dette kan være relevant siden i motsetning til koding regionene store T antigen eller VP1 kapsid protein, den NCCR som navnet antyder representerer en Noncoding regionen og dermed ikke ligger til grunn selektiv press på aminosyren nivå.
I denne protokollen, valg av positive kloner som inneholder NCCR er verifisert av AgeI og SpeI fordøyelsen. Men en koloni PCR kan representere en alternativ tilnærming til raskt skjermen for NCCR inserts direkte fra E. coli belagt på agar plater. For denne tilnærmingen, bruk primer pair BKV-CR-2-FW-AgeI og EGFP-N (tabell 1). Etter transfeksjoner kontrolleres celler for røde og grønne fluorescens ved hjelp av fluorescens mikroskopi (Figur 4). Alternativt kan celler festes ved hjelp av 3% PFA i 20 min ved 22 ° c. I dette tilfellet, vask med PBS, tilsett 0,2% ikke-ioniske vaskemiddel i PBS og ruge i 10 min. faste celler kan deretter bli farget med DAPI i PBS (1 μg/mL) i 10 min ved 22 ° c og utsettes for fluorescens mikroskopi analyse og med UV-lys (340-380 Nm).
Siden begge fluorophores havnen samme polyadenylation signaler, en effekt av polyadenylation effektivitet kan være ute styrt. Men i forhold til eGFP, tdTomato er et dimeric protein som må være tilsvarende skrives inn i en lengre mRNA (koding sekvens: 745 versus 1431 BP, henholdsvis). Men, siden aktiviteten til arrangørene fra cellene behandlet med forstyrrende stoffer er alltid sammenlignet i forhold til ubehandlet (DMSO) celler, spiller denne forskjellen liten rolle. På grunn av tilstedeværelsen av opprinnelsen til replikering, transfeksjoner av reporteren plasmider i celler stabilt uttrykker SV40PyV store T antigen tillater overføring av plasmider til datteren cellene. Det har vist seg at SV40 avledet store T antigen kan transactivate SV40 og BKPyV NCCR og viral DNA-replikering20. Men siden en stor T-antigen er også involvert i overgangen fra tidlig til sent fase av infeksjonen, en kunstig situasjon er gitt. Ved hjelp av denne analysen, må det vurderes at den mest replikering begrensende trinn er den tidlige uttrykk som fører til uttrykk for store T antigen. For å kartlegge den fullstendige replikering syklusen tidlig og sent mRNAs bør måles i infiserte celler ved qRT-PCR som beskrevet andre steder5,12.
En sammenlignbar metode har allerede blitt brukt av sveitsiske og tyske grupper for å analysere arketypiske og omorganisert BKPyV NCCR-avledet Promotor aktiviteter, om enn med uavhengig klonet vektor systemer5,9. Gosert og kolleger fra Basel brukte en lignende metode for å bestemme NCCR promoter aktivitet av BKPyV og JCPyV stammer9,10,11. Begge metodene brukes eGFP for grønn fluorescens; Imidlertid er Basel-gruppen brukes RFP mens i den nåværende protokollen tdTomato ble brukt for røde fluorescens. Fordelen av tdTomato over RFP er det mange høyere photostability; Imidlertid, det dimeric protein er kodet av en orden det er to ganger idet lang idet RFP21. Videre kan halv-livene til proteinene være forskjellige, noe som resulterer i ulik konsentrasjon 72 h post transfeksjoner. Dette problemet kan imidlertid bare være relevant når du sammenligner både fluorescens intensitet direkte. Gosert et al. anvendt BamHI og NotI idet begrensning steder stund inne det aktuelle protokollen AgeI og SpeI er flankerer det NCCR orden. Ved hjelp av begge metodene, ga referanse DUNLOP stamme16 gitt sammenlignbare fluorescens mønstre med sterk tidlig, men svak sent promoter aktivitet9,10. I ytterligere enighet resulterte NCCR-rearrangements med innsettinger i P-regionen i en betydelig økning i tidlig og sen promoter aktivitet sammenlignet med WT-NCCR5,9.
Selv om det har vist seg at SV40 avledet store T antigen kan transactivate SV40 og BKPyV avledet NCCRs20, kan det være interessant å bruke menneskelige celler som stabilt uttrykke store t antigen av BKPyV og ikke PROTOTYPEN viruset SV40 i fremtidige studier . Men i dette tilfellet cellelinjen må være lett å transfect (f. eks, HEK293).
Siden NCCR arrangører av polyomaviruses er svært like, kan denne metoden også brukes (med liten tilpasning i primer sekvenser) for å undersøke promoter aktivitet og påvirkning av potente antivirale midler på aktiviteten til JC-polyomavirus (JCPyV) avledet ikke koding kontroll regioner11. Siden JCPyV er den utløsende Agent for progressiv multifokal leukoencefalopati (PML), en sjelden sentralnervesystemet sykdom som sjelden kan forekomme hos pasienter med immunodeficiencies som resulterer i alvorlig neuropatology, er det også et presserende behov for å finne direkte fungerende antivirale stoffer for å behandle immun utsatte pasienter. Interessant, rearrangements er også funnet i JC NCCRs11. Siden JCPyV har uttalt neurotropism og dermed store mengder virus er funnet i sprit, sample oppkjøpet må justeres til brennevin-avledet DNA. Imidlertid kan etterfølgende trinn enkelt tilpasses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Johannes Korth har fått tilskudd til høyttalerens honorar og reiseutgifter fra Astellas og Novartis. Marek Widera har fått konsulent avgifter fra Novartis. Oliver Witzke har mottatt tilskudd til kliniske studier, Speaker honorar, honoraria og reiseutgifter fra Amgen, Alexion, Astellas, Basilea, Biotest, Bristol-Myers-Squibb, Correvio, Chiesi, Gilead, Hexal, Janssen, Dr. F. Köhler Chemie, MSD, Novartis, Roche, Pfizer, Sanofi og TEVA.
Acknowledgments
Forfatterne takker Barbara Bleekmann for utmerket teknisk assistanse. Disse studiene ble støttet av IFORES-programmet ved Universitetet i Duisburg-Essen Medical School og RIMUR-programmet ved University Alliance Ruhr and Mercator Research Center Ruhr (MERCUR). Forfatterne takker Jürgen-Manchot-Stiftung for doktorgrads fellesskap av Helene Sertznig og konstant støtte. Innsamling og bruk av pasient materiale har blitt godkjent av etikk komité for medisinsk fakultet ved Universitetet Duisburg-Essen (14-6028-BO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp ladder | NEB | N3231 | Any ladder with a range up to 1 kb can be substituted |
| 2-log ladder | NEB | N0550 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
| Agar-Agar, Kobe I | Carl Roth | 5210.3 | |
| AgeI-HF | NEB | R3552 | |
| Ampicillin Natriumsalz Cellpure | Carl Roth | HP62.1 | |
| Aqua ad iniectabilia | Bbraun | 2351744 | can be substituted by any manufacturer |
| BD FACSCanto™ II | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva | BD Biosciences | ||
| DAPI | Sigma | 10236276001 | |
| DFC450C camera module | Leica | Any camera can be used | |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | can be substituted by any manufacturer |
| DMIL LED microscope | Leica | Any fluorescence microscope can be used | |
| DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | can be substituted by any manufacturer |
| E.coli DH5alpha Competent Cells | Thermo Scientific | 18258012 | |
| FBS Superior | MerckMillipore | 50615 | Any FBS can be used |
| FlowJo v10.5.3 | FlowJo, LLC | Any flow cytometry software FBS can be used | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X) | NEB | B7024 | Any 6x loading dye can be substituted |
| HEK293T cells | ATCC | 11268 | These cells constitutively express the simian virus 40 (SV40) large T antigen, and clone 17 was selected specifically for its high transfectability. |
| HERAcell® 240i CO2 Incubator | Thermo Scientific | can be substituted by any manufacturer | |
| HotStar PCR kit | Qiagen | 203203 | |
| Intas Gel documentation system | Intas | Any visualisation system for stained DNA containing agarose gels can be used | |
| Low Melt Agarose | Biozym | 850081 | can be substituted by any manufacturer |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | can be substituted by any manufacturer |
| pBKV (34-2) | ATCC | 45025 | Plasmid harboring the full-length genome of BKPyV strain Dunlop; was used as a positive control; DNA Seq. Acc.: KP412983 |
| PBS | Gibco | 14190-136 | |
| PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler | Bio-Rad | discontinued product | Any thermocycler can be used |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | #C1145 | can be substituted by any manufacturer |
| PCR1 and PCR2 Primers | metabion | not applicable | Desalted. Dilute to (10 µM) with PCR grade water |
| PenStrep (100x) | Gibco | 15140-122 | can be substituted by any manufacturer |
| Roti®-GelStain | Carl Roth | 3865 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
| SpeI-HF | NEB | R3133 | |
| T4-DNA Ligase | NEB | M0202 | |
| TransIT LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| Trypsin 0.05% - EDTA | Gibco | 25300-054 | can be substituted by any manufacturer |
| ZymoPURE II Plasmid Kit | Zymo | D4201 | can be substituted by any manufacturer |
References
- Drachenberg, C. B., et al. Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load. American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).
- Korth, J., et al. Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function. Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).
- Hirsch, H. H., et al. European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation. Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).
- Masutani, K., et al. The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome. American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).
- Korth, J., et al. Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region. Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).
- Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12. Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).
- Sanchez Fructuoso, A. I., et al. Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients. Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).
- Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis. Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).
- Gosert, R., et al. Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology. Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).
- Bethge, T., et al. Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression. Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).
- Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate. Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).
- Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression. American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).
- Widera, M., et al. HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia. Medical Microbiology Immunology. , (2017).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. Journal of Visualized Experiment. (6), 247 (2007).
- Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland. Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).
- Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals. Virology. 198 (1), 59-70 (1994).
- Teutsch, K., et al. Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy. Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).
- Korth, J., et al. The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation. Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).
- Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens. Virology. 152 (2), 459-465 (1986).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
