Summary
基于平板脉冲激光二极管的桌面光声层析成像 (LDD-PAT) 系统被证明用于小动物皮质血管的高速动态体内成像。
Abstract
光声 (PA) 断层扫描 (pat) 成像是一种新兴的生物医学成像模式, 适用于各种临床前和临床应用。定制的基于圆形环阵列的传感器和传统的笨重 Nd: YAG/OPO 激光器抑制了 PAT 系统的转换到诊所。超紧凑型脉冲激光二极管 (Pld) 目前正被用作 PA 成像的近红外激发的替代来源。高速动态体内成像已被证明使用了紧凑型基于 pld 的桌面 PAT 系统 (PLD-PAT)。本文提出了一种利用桌面 PLD-PAT 系统进行动态脑成像的可视化实验方案。该协议描述了桌面 PLD-PAT 系统配置、脑血管成像动物的制备以及大鼠皮质血管中肌内腺绿色 (ICG) 染料吸收和清除过程的动态成像过程。
Introduction
光声计算机断层扫描 (pactse-pat) 是一种很有前途的非侵入性生物医学成像方式, 它结合了丰富的光学对比度和高超声分辨率1,2,3, 4,5. 当纳秒脉冲激光将能量沉积到任何生物组织内的吸光色相中时, 局部温度升高, 导致组织的热弹性膨胀和收缩, 从而产生压力波。这些压力波被称为超声波或光声 (PA) 波, 可以通过样品周围的超声波传感器检测到。利用各种重建算法6、7、8、9对检测到的 pa 信号进行重构, 生成横截面 pa 图像。PA 成像提供结构和功能信息, 从宏观器官到微观细胞器, 由于存在于体内10的内源性色母象的波长依赖性。PAT 成像已成功地用于乳腺癌检测1, 前哨淋巴结成像11, 氧血红蛋白 (hbo2) 的映射, 脱氧血红蛋白 (HbO), 总血红蛋白浓度 (HbO), 氧饱和度 (so2)12,13、肿瘤血管生成14例, 小动物全身成像15例, 等应用。
Nd:yag/opo 激光器是第一代 PAT 系统的常规激发源, 广泛应用于光声界的小动物成像和深层组织成像16。这些激光器在 ~ 10-100 Hz 的低重复率下提供 ~ 100 mJ 能量脉冲。由于脉冲重复率有限, 使用这些昂贵且笨重的激光的 PAT 成像系统不适合使用单元素超声传感器 (Sut) 进行高速成像。这就抑制了对动物体内高速发生的生理变化的实时监测。使用基于阵列的传感器, 如带有 nd:yag 激光激发的线性、半圆、圆形和体积阵列, 可以进行高速成像。然而, 这些阵列传感器价格昂贵, 与 Sut 相比, 它们的灵敏度较低;然而, 成像速度受到激光低重复率的限制。最先进的单脉冲 PACT 系统与定制的全环阵列传感器获得 PA 数据在 50 Hz 帧速率17.这些阵列传感器需要复杂的后端接收电子和信号放大器, 使整个系统更加昂贵, 临床使用更加困难。
其紧凑的尺寸、较低的成本要求和较高的脉冲重复率 (KHz 顺序) 使脉冲激光二极管 (Pld) 更有前途, 适用于实时成像。由于这些优点, 在第二代 PAT 系统中, Pld 被积极用作备用励磁源。基于pld 的 pat 系统已成功地证明, 高帧率成像使用阵列传感器 18, 深组织和大脑成像19,20,21, 心血管疾病诊断22和风湿病诊断23。由于与阵列传感器相比, Sut 具有高度敏感和更低的成本, 因此它们仍被广泛用于 PAT 成像。基于光纤的 PLD 系统已被证明用于幻象成像 24。以前通过将 PLD 安装在 PAT 扫描仪25内, 已经演示了便携式 pld-pat 系统。使用一个 SUT 圆形扫描仪, 在3次扫描时间内进行幻影成像, 并在5维使用 PLD-PAT 系统19在5个时间内进行大鼠脑成像。
此外, 还对该 pld-pat 系统进行了改进, 使其更加紧凑, 并使用8个基于声学反射的单元素超声波传感器 (subr)26、27创建桌面模型。在这里, Sut 被放置在一个垂直的, 而不是水平的方向, 在90°声学反射器28的帮助下。该系统可用于组织成像和体内小动物大脑成像中的扫描时间高达 0.5 s 和约3厘米深。在这项工作中, 这个桌面 PLD-PAT 系统用于提供实验的视觉演示, 用于在小动物的体内大脑成像和动态可视化的吸收和清除过程的食品和药物管理局 (FDA) 批准的碘苯胺大鼠大脑中的绿色染料 (ICG)。
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Protocol
所有动物实验都是根据新加坡南洋理工大学动物护理和使用机构委员会批准的指导方针和条例 (动物议定书编号 ARF-SBS/NIE-0331) 进行的。
1. 系统描述
- 将 PLD 激光安装到圆形扫描仪中, 并将光学扩散器 (OD) 安装在 PLD 出口窗口的前面, 以使输出光束均匀, 如图 1a 所示。将 PLD 连接到激光驱动器单元 (LDU)。
注: PLD 产生 ~ 816 nm 波长脉冲, 脉冲持续时间约 107-10千, 最大脉冲能量约 3.4 Mj, 重复速率高达 2 Khz。LDU 由冷水机组、12 V 电源、控制激光功率的可变高压电源和改变脉冲重复率的功能发生器组成。 - 将所有 8个 Sutr 逐个安装在每个 SUTR 支架上, 使每个声学反射器的表面朝向扫描区域的中心, 如图 1 b 所示。借助连接电缆, 将每根 SUTR 电缆连接到低噪声信号放大器。
注: 超声波传感器的中心频率为 5 MHz, 具有13毫米直径的活动区域。每个通道的 24 dB 增益中的两个放大器串联在一起。 - 打开冷水机组的电源, 然后打开冷水机组的开关, 将温度设置在20°c 至25°c 之间。
- 打开低压电源的电源, 慢慢地打开电流控制, 将电流限制设置为 0.3 A. 将电压设置为 12 v, 验证电流不超过 0.1 A。
- 打开高压电源的电源。按下 "预设" 按钮, 将电流设置为 1 A, 将电压设置为 0 V. 启用 "输出" 按钮: 0 V/0 A。
- 打开功能发生器的电源。按下 "召回" 按钮, 并选择一个 2 KHz 配置, 以产生激光脉冲在这种重复率。
- 如图 1 a所示, 将丙烯酸罐放入扫描仪内, 并将水箱灌满水, 使 sur 的检测表面完全浸入水中。
- 确保所有的 Sutr 检测表面都在水介质内。打开低噪声信号放大器的电源。
2. 大鼠脑成像的动物准备
注: 健康的雌性大鼠 (见材料表) 被用来演示上述桌面 pld-pat 系统, 用于小动物皮质血管成像。
- 通过停止头部和身体的运动, 将动物抱在其背上。通过腹腔注射2毫升氯胺酮 (100 Mg/ml)、2毫升木氨酸 (20 Mg/ml) 和1毫升盐水 (用量为 0.2 ml·100克) 的混合物对动物进行麻醉。
注: 注射后, 动物的脚趾被挤压, 以测试任何积极的反射, 如腿部或身体运动, 发声, 或呼吸明显增加。没有这种反射作用证实了动物的成功麻醉。 - 为了防止因麻醉和激光照射而干燥, 非常小心地将人工泪液膏涂在大鼠眼睛上。将动物放置在工作台上的俯卧位置, 用修剪头发的方法去除动物头皮上的皮毛, 轻轻地将脱毛霜涂在剃光区域, 完全取出皮草。
- 4-5分钟后, 用棉签取下应用的奶油。
- 将配备呼吸面罩 (见材料表) 的定制动物支架安装在实验室插孔上。
- 将动物放置在支架上的俯卧位置, 使头部停留在支架的水平平台上。使用手术胶带将动物固定在支架上。
- 确保呼吸面罩覆盖大鼠的鼻子和嘴巴, 以提供麻醉混合物。呼吸面罩是根据成像窗口量身定制的。10% 的商业上可获得的鼻锥被切割, 然后连接到一块手套。
- 在打开之前, 将呼吸面罩连接到麻醉机。
- 打开麻醉机, 将其设置为将含有 1.0 lmmin 氧气的麻醉混合物与0.75 异氟醚输送到动物呼吸面罩。
- 将脉搏血氧仪夹紧动物的后腿之一, 以监测其生理状况。
- 使用棉尖施药器将一层无色超声波凝胶涂在大鼠的头皮上。将实验室插孔位置调整到扫描仪的中心, 并手动调整实验室插孔的高度, 使成像平面位于声学反射器的中心。
3. 大鼠脑系统中导航卫星委员会吸收和清除过程的动态体内成像
- 在数据采集软件 (参见材料表) 中设置用于360°采集扫描的参数。
- 通过启用函数发生器的输出 (将开始发射激光) 来打开 PLD 激光发射。然后, 慢慢地将可变高压电源的电压提高到 120 V, 以实现最大的每脉冲能量。
- 运行数据采集软件 (参见材料表) 程序, 在4秒的扫描时间内360°旋转所有8个子 tr。
注: 例如, 如果 Subr 旋转 4 s, PLD 将提供 8, 000个 (= 4 x 2, 000) 脉冲, 并且每个 SUTR 收集 8000 a 线。这 8 000条 a 线通过平均超过20个信号减少到 400条 (平均 a 线 = 8000/20 = 400)。利用基于延迟和和回投影算法的重建程序, 找出了每个 SUTR 的扫描半径。 - 禁用函数发生器的输出以关闭激光发射。
- 利用数据处理软件中的重建算法 (见材料表), 利用反投影算法, 通过试错法找出所有 8个 sutr 的扫描半径。
- 在数据采集软件 (参见材料表) 中设置参数, 以便在0.5秒的扫描时间内进行45°采集。
注: 例如, 如果 Sutr 旋转 0.5 s, PLD 将提供 1, 000个 (= 0.5 x 2, 000) 脉冲, 并且每个 SUTR 收集 1000 a 线。这 1, 000条 a 线通过平均超过20个信号 (在平均 a 线 = 1000/20 = 50 后) 减少到 400条)。 - 使函数发生器的输出能够打开激光发射。
- 运行数据采集软件 (见材料表) 程序, 在45°范围内旋转所有8个子 tr, 以获得初始控制数据, 然后再管理 icg。
- 禁用函数发生器的输出以关闭激光发射。
- 识别动物的尾静脉, 并将0.3 毫升的 ICG (见材料表) (323 μm) 注入大鼠的尾静脉。
4. 我的工作是什么?
注: 使用微型称重机称重1.25 毫克 ICG 粉末, 并与5毫升蒸馏水混合, 使 ICG 溶液的浓度为323微米。
- 使函数发生器的输出能够打开激光发射。
- 运行数据采集软件 (参见材料表) 程序, 在45°旋转的0.5秒扫描时间内获取 a 线。
5。
注: 在0.5秒扫描时间内获得的 a 线用于生成一张横截面图像。每次扫描之间的时间间隔约为0.4–0.6秒。
- 数据采集结束后, 利用数据处理软件中的反投影算法 (参见材料表), 从保存的 a 线重建横截面大脑图像。
- 关闭激光, 然后关闭麻醉机, 降低实验室插孔, 并将动物从舞台上移开。将动物送回笼子和监视器, 直到它恢复意识。
图 1: 桌面 pld-pat 系统的原理图.(A) 桌面 PLD-PAT 的原理图。PLD: 脉冲激光二极管, OD: 光学扩散器, SUTR: 基于声学反射器的单元素超声换能器, AM: 麻醉机, CSP: 圆形扫描板, SM: 步进电机, LDU: 激光驱动单元, AMP: 放大器, DAQ: 数据采集卡。(B) 扫描中心周围有 8个 ttr 的圆形排列。请点击这里查看此图的较大版本.
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Representative Results
该协议展示了所描述的桌面 PLD-PAT 系统在体内动态脑成像中的潜力, 并给出了相应的结果。通过对健康雌性大鼠进行体内脑成像, 证明了桌面 PLD-PAT 系统的高速成像能力。PA 信号是使用 8个 SUTRs 在360°和45°周围的大鼠大脑中旋转收集的, 扫描速度分别为4秒和0.5秒。图 2A. b 显示了一只雌性大鼠 (98 克) 的大脑图像, 扫描速度分别为4秒和0.5秒。在这两个图像中都可以清楚地看到矢状窦 (SS) 和横向窦 (TS)。图 2C, D显示大鼠大脑在大脑区域切除头皮前后的照片。PAT 成像是在皮肤和头骨完整的情况下非侵入性的。
图 2: 无创的体内桌面 pld-pat 图像.在 (a) 4 s 和 (b) 0.5 s. s:矢状窦, ts: 横向窦的扫描时间皮质血管的体内图像。(C) 和 (d) 分别是大鼠大脑在切除头皮前后的照片。请点击这里查看此图的较大版本.
在将 ICG 注入同一大鼠的尾静脉之前, 获得了控制数据。注入 ICG 后, 在0.5 扫描时间内连续采集前5分钟的 PA 数据。然后, 在大约2-3分钟的时间间隔内获得 PA 数据, 每秒0.5秒的扫描时间. 图3显示了由于 ICG 在 816 nm 时光学吸收增加而导致矢状窦 (SS) 平均 PA 信号增加的图3波长, 并随后, 随着时间的推移而减少。
图 3: ICG 的药代动力学.ICG 的药代动力学显示了吸收和清除过程。红色箭头标记显示 ICG 注入尾静脉的时间。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
这项工作提出了一个协议, 使用桌面 PLD-PAT 系统进行实验小动物, 如老鼠体内大脑成像和动态快速吸收和清除过程的造影剂, 如 ICG。笨重、昂贵的 OPO-PAT 系统需要几分钟 (2-5) 才能获得体内单个横截面图像。紧凑、低成本、第一代便携式 PLD-PAT 系统可在5秒内提供单个体内横截面图像。相比之下, 高速、紧凑、低成本的台式机 PLD-PAT 系统仅在 0.5秒26中呈现高质量的2D 横截面体内图像。在这里, 相同的桌面 PLD-PAT 系统被证明用于快速的体内动态脑成像。使用该系统, 可在小动物体内持续监测迅速变化的生理现象, 以便在 ICG 吸收和清除过程中快速上升和下降 pa 信号。但是, Pld 有一些限制, 如单波长生成, 这禁止功能成像。此外, 需要多波长照明来获取功能信息。此外, 由于 PLD 的每脉冲能量较低, 成像深度受到限制, 因此可以使用外源光声学造影剂来规避, 从而提高成像深度。
在使用台式 PLD-PAT 系统进行实验时, 需要采取某些预防措施: (a) 由于 PLD 激光的光束轮廓不均匀, 应在激光输出窗口使用光学扩散器; (b) 应确保 PLD 激光束是在扫描中心, 所有 SUTRs 都朝向 PAT 扫描仪的中心, (c) 在麻醉注射过程中, 应注意, 以便周围的器官, 如膀胱, 肾脏和肠道不受影响, (d) 适当的量麻醉混合物必须根据动物的重量注射, (e) 在修剪动物头部头发的过程中, 必须避免头皮上的划痕, (f) 必须确保大鼠大脑的成像平面位于阿库斯蒂的中心点审报告的 c 反射器。如果图像质量较低, 可能需要进行故障排除。该系统的主要应用包括高帧率成像 (1 帧 0.5)、小动物脑肿瘤成像、皮下肿瘤成像以及研究生物材料的潜在 pa 造影剂和治疗应用。
体内成像的最大允许接触 (MPE) 安全限制由美国国家标准协会 (ANSI) 激光安全标准29 规定.这些安全限制取决于激光脉冲宽度、照明区域、曝光时间和照明波长, 以及其他几个因素。高于 700-1050 nm 波长范围和皮肤表面每脉冲能量密度的最大值不应超过 20 x 102 (-700)/1000 mjcm 2,其中 (nm) 是照明波长。因此, 使用的 PLD 激光器 816 nm 波长的 MPE 安全极限为 ~ 34.12 mjcm 2.对于在 t = 0.5秒期间连续照射的激光, MPE 安全限制为 1.1 x10 2 (-700)/1000x0.25 j/cm2 (= 1.58 j/cm2)。在所有实验中, PLD 的脉冲重复率保持在2000赫兹。在0.5秒的扫描过程中, 总共向样本输送了 1, 000个 (0.5 x 2, 000) 脉冲。这意味着, 每个脉冲, MPE 是 1.58 mjcm2。台式机 PLD-PAT 系统提供的每脉冲能量约 3.4 mJ。当激光束在 ~ 20 厘米2区展开时, 大脑区域的激光能量密度保持在 ~ 0.17 mjcm 2.在0.5秒的时间内, 这种激光能量密度远低于 ANSI 安全极限。通过降低脉冲重复率、降低激光功率或扩展激光束, 可以改变桌面 PLD-PAT 系统的 ANSI 激光安全极限。
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Disclosures
作者没有相关的经济利益或潜在的利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项研究得到了新加坡卫生部国家医学研究委员会 (NMRC/OFIRGY000/2016:M4062012) 的支持。作者要感谢周伟宏博比先生对机器车间的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12 V power supply | Voltcraft | PPS-11810 | To supply operating voltage for PLD |
Acoustic reflector | Olympus | F102 | 45 degree reflector augmented to the ultrasound transducer |
Acrylic water tank | NTU workshop | Custom-made | It is used to hold water that acts as an acoustic coupling medium between animal brain and detector |
Anesthetic Machine | Medical plus pte ltd | Non-Rebreathing Anaesthesia machine with oxygen concentrator. | Supplies oxygen and isoflurane to animal |
Animal distributor | In Vivos Pte Ltd, Singapore | Animal distributor that supplies small animals for research purpose | |
Animal holder | NTU workshop | Custom-made | Used for holding animal on its abdomen |
Breathing mask | NTU workshop | Custom-made | Used along with animal holder to supply anesthesia mixture to the animal |
Circular Scanner | NTU workshop | Custom-made | Scanner is made out of aluminum |
DAQ (Data acquisition) Card | Spectrum | M2i.4932-exp | 16 bit, 30 Ms/s, 8 channels, 1 Gs, PCIe |
Data acqusition software | National Instruments Corporation,Austin,TX,USA) | NI LabVIEW 2015 SP1 (32 bit) | LabVIEW based program developed in our laboratory for controlling the stepper motor and acquring the PA singnals from the detector |
Data processing software | Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA) | Matlab R2015b | Matlab code developed in our laboratory for reconstructing cross-sectional PA images |
Function generator | RIGOL | DG1022 | To change the repetition rate of the PLD. It will provide TTL signal to synchronize the DAQ with the laser excitation. |
Low noise signal amplifier | Genetron | Custom-made using Mini-circuits, ZFL-500LN-BNC | To receive, and amplify the PA signal from SUTR. Its gain is 24 dB. |
Optical diffuser | Thorlabs | DG-120 | Used to to make the laser beam homogeneous |
Pulsed laser diode | Quantel, France | QD-Q1924-ILO-WATER | It is the excitation laser source with specifications of 816 nm wavelength, 3.4 mJ per pulse energy, 107 ns pulse width, 2 KHz maximum pulse repitition rate, dimensions : 13.0 x 7.6 x 5.0 cm |
Rats | In Vivos Pte Ltd, Singapore | NTac:SD, Sprague Dawley / SD | Female, weight 100±10g, strain of rats: Sprague Dawley, age: 4-5 weeks |
Stepper motor with gearbox | LIN Engineering (Servo Dynamics) | Motor: CO-5718L-01P-RO, Gearbox: DPL64/1; Power supply PW-100-24 | To move the detector holder in a circular geometry. Torque: 2.08 N-m, Rotor inertia: 2.6 kg-cm2 |
Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Clear ultrasound gel |
Ultrasound Transducer | Olympus | V309-SU/ U8423013 | Ultrasonic sensors used for photoacoustic detection. Central freqency 5 MHz, 0.5 in |
Variable high voltage power supply | Elektro-Automatik | EA-PS 8160-04 T | To change the laser output power |
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