En dobbel Humanisert BLT-mus modell med en stabil human-like gut Mikrobiomet og Human immun system
Summary
Vi beskriver en ny metode for å generere dobbelt humanisert BLT-mus som har en funksjonell menneskelig immunsystem og en stabil engrafted menneske-lignende gut mikrobiomet. Denne protokollen kan følges uten bakteriefrie mus eller gnotobiotic fasiliteter.
Abstract
Humanisert mus (Hu-mus) som har en funksjonell menneskelig immunsystem har fundamentalt endret studiet av menneskelige patogener og sykdom. De kan brukes til å modellere sykdommer som ellers er vanskelige eller umulige å studere hos mennesker eller andre dyremodeller. Tarmen mikrobiomet kan ha en dyp innvirkning på menneskers helse og sykdom. Imidlertid er murine gut mikrobiomet svært annerledes enn den som finnes i mennesker. Det er behov for forbedrede pre-kliniske Hu-mus modeller som har en engrafted menneskelig gut mikrobiomet. Derfor skapte vi doble Hu-mus som har både en menneskelig immunsystem og stabilt menneske-lignende gut mikrobiomet. Nikk. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (nsg) mus er en av de beste dyrene for menneskeliggjøring på grunn av deres høye immunsvikt. Men bakteriefrie NSG-mus og diverse andre viktige bakteriefrie mus modeller er ikke tilgjengelig for øyeblikket. Videre har mange forsknings innstillinger ikke tilgang til gnotobiotic fasiliteter, og arbeid under gnotobiotic forhold kan ofte være kostbart og tidkrevende. Viktigere, bakteriefri mus har flere uimottakelig mangler som eksisterer selv etter engraftment av mikrober. Derfor har vi utviklet en protokoll som ikke krever bakteriefrie dyr eller gnotobiotic fasiliteter. For å generere doble Hu-mus, ble NSG-mus behandlet med stråling før kirurgi for å skape Ben-marg, lever, thymus-humanisert (Hu-BLT) mus. Musene ble deretter behandlet med bredt spekter antibiotika for å tømme eksisterende murine gut mikrobiomet. Etter antibiotika behandling, ble musene gitt avføring med friske menneskelige donor prøver via oral gavage. Double Hu-BLT mus hadde unike 16S rRNA gen profiler basert på den enkelte menneskelige donor prøven som ble transplantert. Viktigere, den transplanterte menneske-lignende mikrobiomet var stabil i den doble Hu-BLT mus for varigheten av studien opp til 14,5 uker etter transplantasjon.
Introduction
Humanisert mus (Hu-mus) har forvandlet studiet av mange aspekter av menneskers helse og sykdom, inkludert hematopoiesen, immunitet, kreft, autoimmune sykdommer, og smittsomme sykdommer1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Disse Hu-mus har den klare fordelen over andre musemodeller i at de har en funksjonell menneskelig immunsystem og kan bli smittet med menneskelige spesifikke patogener. Likevel, viktigheten av tarmen mikrobiomet har blitt demonstrert av sin rolle i mange menneskelige sykdommer som fedme, Metabolsk syndrom, inflammatoriske sykdommer, og kreft10,11,12, 13 i år. Slimhinnene immunsystem og gut mikrobiomet er gjensidig regulert for å opprettholde gut og systemiske homeostase. Immunsystemet er formet av antigener presentert av tarmen mikrobiomet og gjensidig immunforsvaret spiller en viktig regulatoriske rolle i å fremme Commensal gut bakterier og eliminere patogener14,15, 16. men gut mikrobiomet av Hu-mus har ikke vært godt karakterisert og murine gut mikrobiomet skiller seg vesentlig i komposisjon og funksjon fra mennesker17. Dette skyldes evolusjonære, fysiologiske, og anatomiske forskjeller mellom murine og menneskelige tarmen samt andre viktige faktorer som kosthold, som kan påvirke de eksperimentelle resultatene av Hu-mus sykdom modeller18. Derfor, utover klassifisering av murine gut mikrobiomet av Hu-mus, en dyr modell med både en menneskelig immunsystem og menneskelig gut mikrobiomet er nødvendig for å studere komplekse interaksjoner av menneskelig sykdom in vivo.
Studiet av menneskelige sykdommer direkte i menneskelige er ofte upraktisk eller uetisk. Mange dyremodeller kan ikke brukes til å studere menneskelige patogener som humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1). Ikke-menneskelige primater modeller er genetisk outbred, veldig dyrt, og er ikke utsatt for mange menneskelige patogener. Mus som har blitt avledet som Bakteriefri (GF) og tilberedt med menneske-lignende gut microbiomes har vært mye brukt til å studere menneskers helse og sykdom19,20. Imidlertid, disse dyrene som ikke har en human immunsystem og arbeider med GF dyrene behøver spesialisert fasiliteter, prosedyrer, og ekspertise. Derfor er det behov for forbedrede pre-kliniske modeller for å studere det komplekse forholdet mellom tarmen mikrobiomet og menneskets immunsystem. Mange stammer av mus, som NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (nsg), er ikke kommersielt tilgjengelig som GF. GF dyr kan også lide av langvarige immun mangler som ikke er fullstendig reversert av engraftment av mikrober21. Derfor har vi opprettet en dobbel Hu-mus med både en funksjonell menneskelig immunsystem og stabilt menneske-lignende gut mikrobiomet under spesifikke patogen gratis (SPF) forhold. For å generere doble Hu-mus, ble kirurgi utført på NSG mus for å lage Ben-marg, lever, thymus humanisert mus (Hu-BLT). Den Hu-BLT mus ble deretter behandlet med bredt spekter antibiotika og deretter gitt avføring transplantasjon med en sunn menneskelig donor prøven. Vi preget bakteriell gut mikrobiomet av 173 avføringsprøver fra 45 doble Hu-BLT mus og 4 menneskelige avføring donor prøver. Double Hu-BLT mus har unike 16S rRNA gen profiler basert på den enkelte menneskelige donor prøven som er transplantert. Viktigere, den transplanterte menneske-lignende mikrobiomet var stabil i mus for varigheten av studien opp til 14,5 uker etter transplantasjon. I tillegg viste spådde metagenomes at doble Hu-BLT mus har forskjellig spådd funksjonell kapasitet enn Hu-mus som er mer lik den menneskelige donor prøvene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er beskrevet her er for etablering av doble Hu-BLT mus som har både en funksjonell menneskelig immunsystem og en stabil menneske-lignende gut mikrobiomet. Denne protokollen kan tilpasses andre humanisert eller ikke-humanisert mus modeller uten behov for GF dyr og gnotobiotic fasiliteter. Mens metodene beskrevet her er relativt enkle, er det flere viktige detaljer som er viktige for vellykket etablering av doble Hu-BLT mus. NSG-mus er ekstremt immunodeficient og forebygger infeksjoner er nøkkelen til lang ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Yanmin WAN, Guobin Kang, og Pallabi Kundu for deres assistanse i å generere BLT-humanisert mus. Vi ønsker å erkjenne UNMC Genomics Core Facility som mottar delvis støtte fra Nebraska Research Network i funksjonell Genomics NE-INBRE P20GM103427-14, The Molecular Biology av Nevro Systems CoBRE P30GM110768, The fred & Pamela Buffett Cancer Center-P30CA036727, The Center for root og Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, og Nebraska Research Initiative. Vi vil gjerne takke University of Nebraska-Lincoln Life Sciences Annex og deres stab for deres assistanse. Denne studien støttes delvis av National Institutes of Health (NIH) Grants R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 kronisk HIV-smitte og aldring i NEUROAIDS (Chain) Center, 1R01AI111862 til Q Li. Oppdragsgivers hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, utarbeidelse av manuskriptet eller vedtak for publisering.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
