Summary
Мы описываем новый метод генерации двойных гуманизированных BLT-мышей, которые имеют функциональную иммунную систему человека и стабильный привитый человекоподобный микрофлора кишечника. Этот протокол может быть соблюден без необходимости для зародышевых мышей или гноотобиотических объектов.
Abstract
Гуманизированные мыши (ху-мышей), которые имеют функциональную иммунную систему человека, коренным образом изменили изучение патогенов и болезней человека. Они могут быть использованы для моделирования заболеваний, которые в противном случае трудно или невозможно изучить в организме человека или других моделей животных. Микробиом кишечника может оказывать глубокое воздействие на здоровье и болезни человека. Тем не менее, микрофлора кишечника мурин сильно отличается от того, что содержится в организме человека. Существует необходимость в улучшении доклинических моделей ху-мышей, которые привиты ху-мышей микробиома. Таким образом, мы создали двойных ху-мышей, которые имеют как иммунную систему человека и стабильный человекоподобный микрофлора кишечника. Кивок. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) мыши являются одними из лучших животных для гуманизации из-за их высокого уровня иммунодефицита. Тем не менее, зародыш-свободно мышей NSG, и различные другие важные зародышевые-свободные модели мышей в настоящее время коммерчески не доступны. Кроме того, многие исследовательские настройки не имеют доступа к гнотобиотические средства, и работа в гнотобиоических условиях часто может быть дорогим и трудоемким. Важно отметить, что без микробов мышей имеют несколько иммунных недостатков, которые существуют даже после прививки микробов. Поэтому мы разработали протокол, который не требует микробов животных или гноотобиотических объектов. Для создания двойных ху-мышей, NSG мышей лечили с радиацией до операции по созданию костного мозга, печени, тимуса-гуманизированных (hu-BLT) мышей. Мышей затем лечили антибиотиками широкого спектра, чтобы истощить уже существующий микрофлору кишечника мурина. После лечения антибиотиками, мышей были даны фекальные трансплантации со здоровыми человеческими образцами донора через устные gavage. Двойные мыши hu-BLT имели уникально профили гена 16S rRNA основанные на индивидуальном людском образце дарителя который был трансплантирован. Важно отметить, что пересаженный человекоподобный микробиом был стабильным в двойных мышах hu-BLT в течение всего периода исследования до 14,5 недель после трансплантации.
Introduction
Гуманизированные мыши (ху-мышей) изменили изучение многих аспектов здоровья человека и болезней, включая гематопоезии, иммунитет, рак, аутоиммунные заболевания, и инфекционные заболевания1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Эти ху-мышей имеют явное преимущество по сравнению с другими моделями мыши в том, что они имеют функциональную иммунную систему человека и могут быть инфицированы человеческими конкретными патогенами. Тем не менее, важность микрофлоры кишечника была продемонстрирована его роль во многих человеческих заболеваний, таких как ожирение, метаболический синдром, воспалительные заболевания, и рак10,11,12, 13. Слизистая иммунная система и микрофлора кишечника взаимно регулируются для поддержания кишечника и системного гомеостаза. Иммунная система формируется антигенов, представленных микрофлоры кишечника и взаимно иммунная система играет важную регулятивную роль в содействии сопутствующих бактерий кишечника и ликвидации патогенов14,15, 16. Однако, микрофлора кишечника hu-mice не была наилучшим образом охарактеризована и микробиом кишки murine отличает существенн в составе и функции от людей17. Это связано с эволюционными, физиологическими и анатомическими различиями между мурином и кишечником человека, а также другими важными факторами, такими как диета, которые могут влиять на экспериментальные результаты моделей болезни ху-мышей18. Таким образом, помимо классификации микрофлоры кишечника мурин ху-мышей, для изучения сложных взаимодействий болезни человека in vivo необходима модель животного происхождения, включающая как иммунную систему человека, так и микробиом кишечника человека.
Изучение заболеваний человека непосредственно у людей часто непрактично или неэтично. Многие модели животных не могут быть использованы для изучения человеческих патогенов, таких как вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1). Нечеловеческие модели приматов генетически выведены, очень дороги и не подвержены многим патогенам человека. Мыши, которые были получены как микроб бесплатно (GF) и восстановлены с человеком, как кишечные микробиомы были широко использованы для изучения здоровья человека и болезни19,20. Тем не менее, эти животные не имеют иммунной системы человека и работы с GF животных требует специализированных средств, процедур и опыта. Поэтому необходимо улучшить доклинические модели для изучения сложной взаимосвязи микрофлоры кишечника и иммунной системы человека. Многие штаммы мышей, такие как NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), не являются коммерчески доступными как GF. GF животных также могут страдать от длительных иммунных недостатков, которые не полностью отменены прививки микробов21. Таким образом, мы создали двойной ху-мышей с участием как функциональной иммунной системы человека и стабильного человека, как кишечный микробиом в конкретных патогенов свободных (SPF) условиях. Для создания двойных ху-мышей, операция была проведена на мышах NSG для создания костного мозга, печени, тимуса гуманизированных мышей (hu-BLT). Hu-BLT мышей затем лечили с широким спектром антибиотиков, а затем с учетом фекальных трансплантаций со здоровым образцом донора человека. Мы охарактеризовали бактериальный микрофлорный микрофлору 173 фекальных образцов из 45 двойных мышей hu-BLT и 4 образцов человеческих фекальных доноров. Двойные мыши hu-BLT имеют уникальные профили генов 16S rRNA на основе индивидуального образца донора человека, который пересаживается. Важно отметить, что пересаженный человекоподобный микробиом был стабильным у мышей в течение всего периода после трансплантации до 14,5 недель. Кроме того, прогнозируемые метагеномы показали, что двойные мыши hu-BLT имеют различные прогнозируемые функциональные возможности, чем ху-мышей, которые больше похожи на образцы доноров человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные здесь методы были проведены в соответствии с утвержденными протоколами Институционального комитета по уходу за животными и исследованиям (IACUC) в Университете штата Небраска-Линкольн (UNL). МАКУК при UNL утвердил два протокола, связанных с генерацией и использованием мышей hu-BLT, в том числе двойных ху-мышей. Кроме того, Комитет по надзору за научными исследованиями (SROC) при UNL также одобрил использование эмбриональных стволовых клеток человека и тканей плода, которые закупаются в Расширенных бионаучных ресурсах для гуманизированных исследований мышей (SROC) 2016-1-002).
1. Мышей жилья и технического обслуживания
- Купить 6-8-недельный NSG мышей (NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- Размещать мышей в условиях SPF с воздушным обменом, фильтрами и фильтрами HEPA (0,22 м/м) в помещении с контролируемой температурой, влажностью и давлением.
- Дом и поддерживать мышей в автоклавированных отдельных микроизоляторов клетки в стойке системы, способной управлять воздухообмен с префильтрами и HEPA фильтры (0,22 мкм).
- Выполните все процедуры и манипуляции мышей в классе II типа A2 биологической безопасности дыма капот, который был предварительно обработан ы 70% этанола. Перед работой в комнате животных, душ и переодеться в чистые скрабы, tyvek костюм, загрузочные чехлы, крышка для волос, маска для лица, и перчатки. Носите хирургическое платье над костюмом tyvek во время хирургических процедур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ультрафиолетовая (УФ) обеззараживание света также предпочтительнее до процедур.- Автоклав все инструменты и реагенты, если это возможно, а затем дезинфицировать до передачи на капот дыма.
- Во время процедур удалите индивидуально вентилируемые клетки животных со стойки и дезинфицируете перед переносом на капот дыма.
- Кормите мышей облученной диетой и обеспечиваем автокловной водой. Обеспечить облученные пищевые ab libitum и дополнить дополнительными облученных продуктов питания по мере необходимости. Изменение автоматической воды еженедельно или по мере необходимости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавированная подкисленная вода также может быть использована. Облученная диета была срок годности через 6 месяцев после производства.
2. Поколение гуманизированных мышей BLT
ПРИМЕЧАНИЕ: Поколение hu-BLT мышей было описано ранее22,23,24.
- В день операции дайте мышам облучение всего тела в дозе 12 cGy/g массы тела.
- Подготовьте мышей к операции.
- Дайте каждой облученной мыши смесь кетамина при рабочей концентрации 100 мг/кг и ксилазина при концентрации 12 мг/кг, которая варьировалась от 130-170 л на мышь на основе массы тела путем интраперитонеальной (IP) инъекции для анестезии. Для приготовления 3 мл смеси кетамина и ксилазина добавьте 0,27 мл кетамина при концентрации запасов 100 мг/мл и 0,03 мл ксилазина при концентрации 100 мг/мл до 2,7 мл стерильного соила и хорошо перемешайте. Дезинфицировать кожу с 70% изопропанола до инъекции.
- Дайте каждой облученной мыши Buprenorphine 1 мг/кг массы тела (половина жизни 72 ч, SR-LAB) путем подкожной инъекции для длительного управления болью.
- Дайте каждой облученной мыши 100 л (858 мкг) Цефазолина путем инъекции IP для предоперационной антибиотикопрофилактики.
- Бритьволосы мышей с помощью электрических клиперов волос вокруг левой боковой и медиальной стороны мыши на более позднем хирургическом сайте, используемом для разоблачения левой почки.
- Проверить надлежащий уровень анестезии педали рефлекс (твердый ног щепотку).
- Дайте изофлуранский газ на 3-5%, если необходима дополнительная анестезия в любой момент во время операции.
- Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы. При необходимости нанесите на ушную бирку.
- Выполните операцию по имплантации тканей печени и тимуса в капсулу левой почки.
- Дезинфекция кожи на хирургическом сайте, применяя йодный скраб, начиная с центра хирургического участка и двигаясь наружу круговым способом. Повторите этот процесс с 70% изопропанола и в третий раз с йодом.
- Используя щипчьи, сначала загрузите один фрагмент ткани печени плода человека в трокар. Затем с помощью щипцов, загрузить один человеческий фрагмент ткани тимуса плода в trocar. Затем с помощью щипцов, загрузить другой фрагмент ткани печени плода человека в trocar. Ткани должны быть сокращены до 1-1,6 мм3, чтобы соответствовать внутренним размерам трокара.
- Используйте щипцы, чтобы поднять кожу и использовать ножницы, чтобы сделать небольшой разрез продольно. Утяните разрез до 1,5-2 см в левой части мыши.
- Используйте щипцы, чтобы поднять мышечный слой и использовать ножницы, чтобы сделать небольшой разрез продольно. Расширить разрез по мере необходимости, чтобы разоблачить почки.
- Выставляют почку, аккуратно захватывая жировую ткань, окружающую почку. Не прикасайтесь непосредственно к почечной паренхимы.
- Сделайте 1-2 мм разрез на задней части капсулы почки с помощью скальпеля.
- Медленно вставьте заранее загруженный трокар через разрез параллельно длинной оси почки и выпустите ткани между капсулой почки и почками.
- Аккуратно верните почки и кишечник в нормальное положение. Используйте абсорбируемые 5/0 P-3 (P-13) швы с 13 мм 3/8 круг иглы, чтобы закрыть мышечный слой и хирургические скобы, чтобы закрыть кожу.
- После операции, положить мышь в чистую аутоклавированную клетку микроизолататор для восстановления.
- Чтобы свести к минимуму потерю тепла во время послеоперационного восстановления, поместите клетку, содержащую мышей, на грелку, которая подключена к водяному насосу, который нагревает и циркулирует воду.
- Мониторинг мышей, пока они не пришли достаточно сознания для поддержания строгого recumbency.
- В течение 6 ч после завершения операции, через хвост вену, вводить CD34 "гематопоитические стволовые клетки, изолированные из ткани печени человека плода.
- Разогрейте мышей тепловой лампой. Дезинфицировать хвост с 70% изопропанола, а затем ввести от 1,5 до 5 и 105 стволовых клеток /200 Л в хвостовой вены.
- Остановите кровотечение из инъекций и верните мышей в клетку микроизолятора и микроизолятор клетку в клетку клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационные мыши, как правило, размещены вместе, пять в клетке микроизолятора, во время и после восстановления. Тем не менее, мышей размещаются вместе только в том случае, если все они получили операцию в тот же день.
- Проверяйте мышей ежедневно. Тщательно следите за хирургическими скобы и заменить их по мере необходимости. Внимательно следите за мышами на любых признаках инфекции или дискомфорта. Поставка autoclaved пищи на полу микроизолататор клетки в течение нескольких дней после операции.
- Удалите хирургические скобы через 7-10 дней после операции. Дайте изолюранский газ на 3-5% для обезврения мышей. Тщательно удалить скобы, а затем применить антибиотики и обезболивающие мазь на сайте.
- Разрешить 9-12 недель для восстановления иммунных клеток человека, а затем собирать периферийную кровь из медиальных сафенов с каждой из гуманизированных мышей.
- Сдержать сознательных мышей, используя соответствующий размер пластикового конуса сдержанность с отверстием возле головы мыши для дыхания и отверстие возле задней мыши, чтобы изолировать одну ногу. Положите мышей в удерживающей головке конуса, а затем осторожно вытяните одну ногу через отверстие ноги.
- Спрей медиальной стороне изолированной ноги с 70% изопропанола, а затем распространение антибиотиков и обезболивающих мазь на том же сайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мазь помогает выявить расположение вены без необходимости удаления волос, а также помогает в образовании капель крови. - Используя 25-калиберную иглу под углом 90 градусов, проколить вену и собрать 50-100 л крови с помощью трубки для сбора крови с покрытием ЭДТА. Остановите кровотечение, применяя давление на участок с помощью стерильной марли. После того, как кровотечение остановилось, вернуть мышей в клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальные объемы крови собраны, как правило, 50 Лл в неделю или 100 Л L каждые две недели. - Используйте собранную периферийную кровь для проверки уровня восстановления иммунных клеток человека с помощью цитометрии потока с антителами для hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. Лечение антибиотиками
- Перед лечением антибиотиками соберите предлечебные фекальные образцы. Переместите мышей в новую автокловную клетку микроизолататора.
- Приготовьте свежий коктейль из антибиотиков широкого спектра ежедневно.
- Приготовьте 250 мл воды, содержащей свежеприготовленный метронидазол (1 г/л), неомицин (1 г/л), ванкомицин (0,5 г/л) и ампициллин (1 г/л) для каждой микроизолятора мышей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте аутоклавированную или стерильную воду для антибиотика, дополняемого питьевой водой. - Добавьте 9,2 г подслащенного виноградного сахара напиток до 250 мл антибиотика, дополненной водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование виноградного сахара подслащенные напитки смесь маски горький вкус антибиотиков и помогает предотвратить обезвоживание у мышей. - Изменение антибиотиков и виноградного сахара подслащенные напитки смесь дополненной водой и поместить мышей в новую автоклавированную клетку ежедневно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши копрофагии и изменения клетки ежедневно предотвращает мышей от повторной прививки себя с кишечными бактериями. - Для максимального инплантирования микрофлоры кишечника человека, обеспечить антибиотики в течение 14 дней. Во время лечения антибиотиками, контролировать мышей для потери веса и обезвоживания. Потеря веса, как ожидается, в течение первых 3-4 дней и плато после этого в течение всего срока лечения. Если происходит обезвоживание, дать мышам солевой или Ringers решение с помощью интраперитонеальной инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие протоколы гуманизации микрофлоры кишечника требуют перорального газа антибиотиков. Хотя эффективным в истощении бактерий курина кишечника, мы обнаружили, что менее инвазивный метод добавления антибиотиков в питьевую воду положить меньше стресса на наших гуманизированных мышей и привело к лучшим результатам.
- Приготовьте 250 мл воды, содержащей свежеприготовленный метронидазол (1 г/л), неомицин (1 г/л), ванкомицин (0,5 г/л) и ампициллин (1 г/л) для каждой микроизолятора мышей.
4. Образцы донора и фекальная трансплантация
- Подготовьте образцы фекалий-доноров человека.
- Используйте правильно подготовленные источники фекальной трансплантации микробиоты (FMT) материала для фекальной трансплантации гуманизированным мышам.
- Оттепель FMT препаратов и aliquot их в анаэробных условиях в анаэробной камере.
- При желании на этом этапе смешайте равные части фекальных образцов вместе, чтобы создать непредвзятый «человеческий» образец.
- Свести замораживание и оттаивание материала FMT к минимуму, если не требуется алицитирование или смешивание образцов, только оттепель непосредственно перед процедурой.
- Пересадка фекальных кадров
- После завершения 14 дней лечения антибиотиками, изменить питьевую воду на автоклавированную воду и переместить мышей в новую автоклавированную клетку. Остановить ежедневные изменения клетки и реализовать один раз в 1-2 недели клетки изменения графика.
- Дайте два фекальных трансплантатов на 24 и 48 ч после прекращения антибиотиков.
- 24 ч после лечения антибиотиками, оттаивать необходимое количество материала FMT, дать каждой мыши 200 л материала FMT через устные gavage. Повторите процедуру еще раз на 48 ч после антибиотиков.
- Распространение любых оставшихся или оставшихся оттаять FMT материал на мех очеловеченных мышей или на клетку постельных принадлежностей.
5. Свежая фекальная коллекция образцов
- Автоклав отдельных бумажных пакетов до передачи на капот дыма.
- В дым капюшон, положить одну мышь в каждый отдельный бумажный мешок и позволяют мыши испражняться.
- Используя стерильные щипцы, соберите фекальные образцы в пластиковые трубки 1,5 мл и заморозьте при -80 градусов по Цельсию. Верните мышей в клетки микроизолатора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод сбора фекальных образцов позволяет для свежего фекального образца сбора из отдельных мышей без каких-либо стресс индуцирующих манипуляций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан ы наброски методов, используемых для создания двойных hu-BLT мышей и кратко описывается процесс добавления функциональной иммунной системы человека и стабильного человека, как кишечный микробиом для NSG мышей. На рисунке 2 показан пример анализа цитометрии потока периферической крови из гуманизированной BLT-мыш 10 недель после операции. На рисунке 3 показано относительное изобилие образцов человеческих фекальных доноров, используемых для передачи микрофлоры кишечника для создания двойных ху-мышей. На рисунке 4 показаны фенотипические изменения, вызванные лечением антибиотиками селезенки и цекума, аналогичные тому, что наблюдается у животных, свободных от микробов. На рисунке 5 показан основной компонент анализа (PCA) участок 16S rRNA секвенирования данных выявления двойной ху-мышей имеют человека, как кишечные микробиомы, которые являются уникальными для человека образца донора.
Рисунок 1 : Создание двойных гуманизированных BLT-мышей. Создание двойных мышей hu-BLT – это двухэтапный процесс. Первый шаг заключается в том, чтобы привить иммунную систему человека к МЫшам NSG. В день операции, NSG мышей дают облучения, чтобы создать нишу для стволовых клеток. Затем мышей имплантируют в печень плода и ткани тимуса и вводят в гематопоитические стволовые клетки человека. Восстановление иммунных клеток человека проверяется около 10 недель после операции. Второй шаг заключается в том, чтобы привить микрофлору кишечника человека. Мышей лечат антибиотиками, чтобы уменьшить уже существующие бактерии мурин кишечника. Мыши затем уделяется фекальные трансплантации, чтобы обеспечить микрофлору кишечника человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Тестирование восстановления иммунных клеток человека в двойных гуманизированных BLT-мышей. Пример цитометрии потока анализа гуманизированной периферической крови BLT-мыши 10 недель после операции. На рисунке показана стратегия gating, используемая для идентификации популяции лимфоцитов, клеток mCD45- hCD45, клеток CD19"B, Т-клеток CD3" Т, Т-клеток CD4 и Т-клеток CD8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Профили фекальных образцов донора человека. Относительное изобилие трех образцов, взятых на уровне семьи, и смешанных (всех доноров) образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Антибиотик обработанных мышей напоминают фенотипы без микробов. Hu-мышей были принесены в жертву после 9 дней лечения антибиотиками (антибиотики) или без лечения антибиотиками (Контроль). После лечения антибиотиками фенотип гуманизированных мышей начинает напоминать те, которые наблюдаются у животных, свободных от микробов. В результате лечения антибиотиками происходит уменьшение размера селезенки (слева) и увеличение цекумы (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5 : Двойной гуманизированных BLT-мышей особенность фекальных доноров конкретных микрофлоры кишечника. PCA участок 16S rRNA секвенирования данных показывают, после человека фекальной трансплантации двойной hu-BLT мышей особенность кишечных микробиомов, которые являются уникальными для отдельных человека фекального донора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь протокол предназначен для создания двойных мышей hu-BLT, которые имеют как функциональную иммунную систему человека, так и стабильный микрофлору кишечника, похожий на человека. Этот протокол может быть адаптирован к другим гуманизированным или негуманизированным моделям мышей без необходимости в GF животных и гноотобиотических объектов. Хотя методы, описанные здесь, относительно просты, есть несколько критических деталей, которые важны для успешного создания двойных мышей hu-BLT. NSG мышей являются чрезвычайно иммунодефицитных и предотвращения инфекций является ключом к долгосрочному выживанию мышей. Мы приняли следующие меры по профилактике инфекции. Во-первых, животные размещались в отдельных микроизолаторных клетках с фильтрами HEPA (0,22 мкм) в системе стеллажей с управлением обменным курсом воздуха в специальном люксе. Обработчик воздуха для стойки содержал предварительные фильтры наряду с отфильтрованным (0,22 мкм) запасом (0,22 м/м) и выхлопным воздухом, а также в режиме реального времени мониторингом температуры выхлопных газов и относительной влажности в режиме реального времени. Во-вторых, каждый, кто вошел в комнату животных должны были принять душ и носить чистые скрабы и обувь, а также надеть перчатки, одноразовый костюм tyvek, пинетки, капот для волос, и маска для лица. В-третьих, все процедуры, включая изменения в клетках и добавление продуктов питания и воды, были выполнены в рамках капюшона биологического дыма типа II типа А2, который был предварительно стерилизован с помощью 70% этанола и ультрафиолетового света. В-четвертых, асептическая хирургическая техника была использована во время операции на выживание, которая включала хирурга и помощников носить дополнительный слой защиты, включая хирургическое платье и перчатки. Операция проводилась в дезинфицирующем капоте дыма, используя только стерильные инструменты, марли и материалы для закрытия ран, сохраняя при этом стерильность перчаток и инструментов на протяжении всей операции. Наконец, для предотвращения инфекции и обеспечения стабильности привитого антропогенного микрофлоры кишечника, вся пища и вода, выдаваемые мышам, были стерильными. Вся пища должна быть облучена, и вся вода должна быть аутоклавирована. Чтобы свести к минимуму боль и страдания, мы вводили долгодействующий бупренорфин подкожно мышей перед операцией. Сочетание кетамина и ксилазина для хирургической анестезии мыши очень надежно и может длиться около 30 мин. Если это не достаточно долго, мы даем изофлуран газа для дальнейшего обезвризоживать мышей. Это также очень важно для поддержания температуры тела мыши после операции. Мы ставим клетку на подогревом разогрева площадку до гематопогетической инъекции стволовых клеток через хвоствены. В это время мышей извлекают из наркоза и возвращают в стойку.
Чтобы истощить микробиом кишечника мурина и подготовиться к пересадке фекалий человека, важно всегда использовать свежеприготовленные антибиотики и ежедневно менять антибиотики, дополняемые водой и клетками. Это будет использовать много микроизолататоров клетки в течение 14-дневного лечения антибиотиками, но это гарантирует, что мыши не повторно прививки через копрофагию. Во время лечения антибиотиками, также важно контролировать вес тела и здоровье мышей. После фекальной трансплантации мыши быстро восстанавливают потерянный вес. Важно свести к минимуму любые циклы замораживания оттепели для фекального материала трансплантации и убедиться, что использовать анаэробную камеру, если aliquoting образцов необходимо. При создании двойной hu-BLT мышей важно свести к минимуму обработки и стресса, вызванного на мышах. Это помогает предотвратить инфекцию и улучшает долгосрочное выживание.
Сначала мы пытались предварительно лечить мышей с противогрибковым амфотерицином B, но обнаружили, что мыши не переносят лечение очень хорошо, и он больше не используется. Мы также экспериментировали с различными длительности лечения антибиотиками. Мы обнаружили, что в то время как большинство бактерий крина кишечника, как представляется, исчерпаны после 7 дней антибиотиков, уровень донорской трансплантации гораздо выше после 14 дней лечения. Мы также пытались вводить антибиотики через два раза в день устные gavage. Тем не менее, мы обнаружили, что этот метод был слишком инвазивным для наших hu-мышей. Мы переключили к одиночному ежедневному план-графику gavage но мыши все еще показались, что были усилены и нездоровы. Мы обнаружили, что предоставление антибиотиков в питьевой воде является лучшим методом. Оно уменьшило обработку количества и усилие к мышам пока все еще адекватно уменьшая бактерии кишки murine. Мы предоставили виноградный сахар подслащенный напиток смесь в питьевой воде, чтобы обеспечить мышей получил адекватную дозировку антибиотиков и для предотвращения обезвоживания. Мыши действительно испытывают снижение массы тела в течение первых 3-4 дней лечения антибиотиками, но предоставление дополнительных жидкостей через интраперитонеальную инъекцию не увеличивает вес тела. После фекальной трансплантации мыши быстро восстанавливают потерянный вес.
Хотя этот метод способен воспроизвести двойной hu-BLT мышей, Есть некоторые ограничения для модели. Первое, что нужно учитывать, это ху-мышей имеют менее организованной лимфоидной структуры, в том числе зародышевого центра, что приводит к снижению антител класса переключения и ограниченное созревание сродства. Тем не менее, NSG hu-BLT мышей имеют системную иммунную реконституционную и переводимые реакции Т-клеток и могут быть использованы для моделирования многих заболеваний человека. Другой проблемой является потенциальное развитие трансплантата против хозяина болезни (GVHD) в некоторых hu-мышей после нескольких месяцев чрезмерной иммунной реконституции человека. Мы и другие наблюдали GVHD проявления, такие как блефарит, облысение, потеря веса, и malocclusion, которые должны быть тщательно проверены25.
Есть несколько документированных схем для истощения кишечных бактерий у мышей с антибиотиками26,27,28,29,30,31. Мы выбрали наш коктейль антибиотиков из-за их известной способности целевой широкий спектр бактерий в кишечнике и потому, что мы нашли несколько примеров успешного бактериального истощения в литературе. Многие опубликованные случаи используют гораздо менее строгий курс антибиотиков, но в нашем исследовании, мы обнаружили, что 14 дней, необходимых для оптимального прививок человека, как кишечный микробиом. Хотя мы первоначально пытались протокол, основанный на Hintze и др., мы обнаружили, что устные gavage был слишком инвазивным и что противогрибково лечение было вредно для мышей26. Мы считаем, что NSG hu-BLT мышей являются уникальными и менее инвазивные процедуры являются предпочтительными по сравнению с другими, более надежные мыши. Мы не использовали GF животных в нашем исследовании. Использование GF мышей для изучения воздействия микрофлоры кишечника были хорошо документированы, однако, эти животные не имеют иммунной системы человека19,32. Кроме того, мы признаем, что работа с моделью мышей GF NSG hu-BLT создаст интересные возможности для исследований. С одной целью, изучение иммунной системы человека и патогенеза человека конкретных патогенов, как ВИЧ-1 без присутствия микрофлоры кишечника может обеспечить интересные результаты. Кроме того, модели GF могут позволить более полное восстановление человеческого микробиома кишечника после фекальной трансплантации. Тем не менее, GF мышей имеют длительные иммунные недостатки, даже после кишечника микробиом восстановления21. Преимущество нашей модели в использовании жилищных условий SPF, которые широко доступны и дешевле по сравнению с объектами GF. Наша модель также имеет то преимущество, что не возмущает обычные процедуры хирургических генерации мышей hu-BLT, потому что нет необходимости в полностью GF окружающей среды.
Мы считаем, что эта двойная модель мыши hu-BLT уникальна тем, что она не только может быть использована для изучения иммунной функции человека и заболеваний человека, но и определить влияние микрофлоры кишечника на патогенез болезни и лечение in vivo. С помощью этого протокола, мы можем воспроизвести создать двойной hu-BLT мышей с человеческим донором конкретных профилей микрофлоры кишечника. Поэтому мы считаем, что использование двойных мышей hu-BLT будет полезным для будущих персонализированных приложений медицины, предназначенных для проверки влияния микрофлоры кишечника на лечение различных заболеваний человека, таких как ВИЧ-1 и рак. Таким образом, наша двойная модель мышей hu-BLT является важной и новой доклинической моделью, которая включает в себя как функциональную иммунную систему человека, так и стабильный микрофлору кишечника человека для изучения здоровья и болезней человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Янмин Ван, Гуобин Кан и Паллаби Кунду за их помощь в создании BLT-гуманизированных мышей. Мы хотели бы отметить UNMC Геномика Основной фонд, который получает частичную поддержку от Небраска научно-исследовательской сети в функциональной геномики NE-INBRE P20GM103427-14, Молекулярная биология нейросенсорных систем CoBRE P30GM110768, Фред и Памела Баффет онкологический центр - P30CA036727, Центр корней и Rhizobiome инноваций (CRRI) 36-5150-2085-20, и Небраска исследовательской инициативы. Мы хотели бы поблагодарить Университет штата Небраска - Lincoln Life Sciences Annex и их сотрудников за их помощь. Это исследование частично поддерживается Национальными институтами здравоохранения (NIH) Гранты R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Хроническая ВИЧ-инфекция и старение в НейроСПИД (CHAIN) Центр, 1R01AI111862 до Ли. Спонсоры не принимали никакого значения в разработке, сборе и анализе данных, подготовке рукописи или принятии решения для публикации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W.
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
