Summary
نحن نصف طريقة جديدة لتوليد مزدوجة أنسنة BLT-الفئران التي تتميز نظام المناعة البشرية وظيفية ومستقرة مطعّمة الإنسان مثل ميكروبيوم الأمعاء. ويمكن اتباع هذا البروتوكول دون الحاجة إلى الفئران الخالية من الجراثيم أو مرافق الغنوبوتيك.
Abstract
الفئران الأنسنة (هو الفئران) التي تتميز نظام المناعة البشرية وظيفية قد غيرت بشكل أساسي دراسة مسببات الأمراض البشرية والمرض. ويمكن استخدامها لنمذجة الأمراض التي من الصعب أو المستحيل دراسة في البشر أو النماذج الحيوانية الأخرى. يمكن أن يكون لميكروبيوم الأمعاء تأثير عميق على صحة الإنسان والمرض. ومع ذلك، فإن ميكروبيوم الأمعاء المورين يختلف كثيرا عن تلك الموجودة في البشر. هناك حاجة إلى تحسين نماذج الفئران قبل السريرية التي لديها ميكروبيوم الأمعاء البشرية المطعمة. لذلك، أنشأنا مزدوجة هو الفئران التي تتميز على حد سواء جهاز المناعة البشرية ومستقرة الإنسان مثل ميكروبيوم الأمعاء. موافقه. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) الفئران هي واحدة من أفضل الحيوانات للأنسنة بسبب ارتفاع مستوى نقص المناعة. ومع ذلك، الفئران NSG خالية من الجراثيم، ومختلف نماذج الفئران الأخرى الهامة الخالية من الجراثيم ليست متاحة تجاريا حاليا. وعلاوة على ذلك، فإن العديد من إعدادات البحوث لا يمكن الوصول إلى مرافق الغنوتوبيوتيك، والعمل في ظل ظروف الغنوتوبية يمكن أن تكون في كثير من الأحيان مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. الأهم من ذلك، الفئران الخالية من الجراثيم لديها العديد من أوجه القصور المناعية التي توجد حتى بعد تطعيم الميكروبات. لذلك، وضعنا بروتوكولا لا يتطلب الحيوانات الخالية من الجراثيم أو مرافق gnotobiotic. لتوليد مزدوجة هو الفئران، تم التعامل مع الفئران NSG مع الإشعاع قبل الجراحة لخلق نخاع العظام والكبد والفئران الغدة الصعترية أنسنة (hu-BLT). ثم تم علاج الفئران مع المضادات الحيوية واسعة الطيف لاستنزاف ميكروبيوم الأمعاء المورين الموجودة من قبل. بعد العلاج بالمضادات الحيوية، أعطيت الفئران زرع البراز مع عينات جيدة من المتبرعين الإنسان عن طريق اللقاحات عن طريق الفم. وكان مزدوج ة الفئران HU-BLT فريدة من نوعها 16S rRNA ملامح الجينات استنادا إلى عينة المانحين البشرية الفردية التي تم زرعها. والأهم من ذلك، أن الميكروبيوم الشبيه بالإنسان المزروع كان مستقراً في فئران hu-BLT المزدوجة طوال مدة الدراسة حتى 14.5 أسبوعًا بعد الزراعة.
Introduction
الفئران أنسنة (هو الفئران) حولت دراسة العديد من جوانب صحة الإنسان والمرض بما في ذلك داء الدم،والمناعة، والسرطان، وأمراض المناعة الذاتية، والأمراض المعدية 1،2،3،4 ،5،6،7،8،9. هذه الفئران هو لديها ميزة متميزة على نماذج الماوس الأخرى في أن لديهم نظام المناعة البشرية وظيفية ويمكن أن تكون مصابة مسببات الأمراض البشرية المحددة. ومع ذلك، فقد ثبت أهمية ميكروبيوم الأمعاء من خلال دورها في العديد من الأمراض البشرية مثل السمنة، متلازمة التمثيل الغذائي، والأمراض الالتهابية، والسرطان10،11،12، 13. يتم تنظيم الجهاز المناعي المخاطي وميكروبيوم الأمعاء بشكل متبادل للحفاظ على الأمعاء والتوازن الجهازي. يتم تشكيل الجهاز المناعي من قبل المستضدات التي تقدمها ميكروبيوم الأمعاء وبشكل متبادل الجهاز المناعي يلعب دورا تنظيميا هاما في تعزيز بكتيريا الأمعاء commensal والقضاء على مسببات الأمراض14،15، 16.ومع ذلك، لم تتميز ميكروبيوم الأمعاء من الفئران هو جيدا وميكروبيوم الأمعاء المورين يختلف اختلافا كبيرا في تكوين وظيفة من البشر17. ويرجع ذلك إلى الاختلافات التطورية والفسيولوجية والتشريحية بين المورين والأمعاء البشرية، فضلا عن عوامل هامة أخرى مثل النظام الغذائي، والتي قد تؤثر على النتائج التجريبية لنماذج مرض هو الفئران18. لذلك، إلى جانب تصنيف ميكروبيوم الأمعاء المورين من الفئران هو، وهناك حاجة إلى نموذج حيواني يضم كل من جهاز المناعة البشرية وميكروبيوم الأمعاء البشرية لدراسة التفاعلات المعقدة للأمراض البشرية في الجسم الحي.
دراسة الأمراض البشرية مباشرة في البشر غالبا ما تكون غير عملية أو غير أخلاقية. لا يمكن استخدام العديد من النماذج الحيوانية لدراسة مسببات الأمراض البشرية مثل فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1). نماذج الرئيسيات غير البشرية هي ولدت وراثيا، مكلفة جدا، وليست عرضة للعديد من مسببات الأمراض البشرية. الفئران التي تم اشتقاقها كجرثومة خالية (GF) وأعيد تشكيلها مع ميكروبيومالأمعاء مثل الإنسان وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة صحة الإنسان والمرض19،20. ومع ذلك، هذه الحيوانات ليس لديها نظام المناعة البشرية والعمل مع الحيوانات GF يتطلب مرافق متخصصة، والإجراءات، والخبرة. لذلك، هناك حاجة إلى نماذج ما قبل السريرية محسنة لدراسة العلاقة المعقدة من ميكروبيوم الأمعاء والجهاز المناعي البشري. العديد من سلالات الفئران، مثل NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)، ليست متاحة تجاريا ً كفرنك غيني. قد تعاني الحيوانات GF أيضا من نقص المناعة طويلة الأمد التي لا تعكس تماما عن طريق تطعيم الميكروبات21. لذلك، أنشأنا مزدوجة هو الفئران يضم كل من نظام المناعة البشرية وظيفية ومستقرة الإنسان مثل ميكروبيوم الأمعاء في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF). لتوليد مزدوجة هو الفئران، أجريت عملية جراحية على الفئران NSG لخلق نخاع العظام والكبد والفئران الغدة الصعترية أنسنة (hu-BLT). ثم عولجت الفئران hu-BLT مع المضادات الحيوية واسعة الطيف ومن ثم إعطاء عمليات زرع البراز مع عينة من المتبرعين الإنسان صحية. لقد ميّزنا ميكروبيوم الأمعاء البكتيرية من 173 عينة برازية من 45 فأراً ثنائياً من الفئران المزدوجة و4 عينات من المتبرعين بالبراز البشري. الفئران مزدوجة hu-BLT لديها فريدة من نوعها 16S rRNA ملامح الجينات استنادا إلى عينة المانحين الإنسان الفردية التي يتم زرعها. والأهم من ذلك، كانت الميكروبيوم ة الشبيهة بالإنسان المزروعة مستقرة في الفئران طوال مدة الدراسة لمدة تصل إلى 14.5 أسبوع بعد الزراعة. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الجينومات المتوقعة أن الفئران المزدوجة hu-BLT لديها قدرة وظيفية متوقعة مختلفة عن الفئران هو التي هي أكثر مماثلة لعينات المانحين البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أجريت جميع الأساليب الموصوفة هنا وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات والبحوث في جامعة نبراسكا لينكولن. وقد وافق المجلس الدولي للدراسات المتعلقة بالفئران في الأمم المتحدة على بروتوكولين يتعلقان بتوليد واستخدام فئران هو - BLT، بما في ذلك الفئران المزدوجة. بالإضافة إلى ذلك، وافقت لجنة الرقابة على البحوث العلمية (SROC) في UNL أيضا على استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والأنسجة الجنينية، والتي يتم شراؤها من الموارد المتقدمة للعلوم الحيوية لدراسات الفئران الأنسنة (SROC# 2016-1-002).
1- إسكان الفئران وصيانتها
- شراء الفئران NSG القديمة 6-8 أسابيع (NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- منزل الفئران تحت ظروف منتدى جنوب المحيط الهادئ مع تبادل الهواء، ومرشحات prefilters، ومرشحات HEPA (0.22 درجة مئوية) في غرفة مع درجة الحرارة التي تسيطر عليها، والرطوبة، والضغط.
- منزل والحفاظ على الفئران في أقفاص microisolator الفردية الأوتوكلاف في نظام رف قادرة على إدارة تبادل الهواء مع المرشحات المسبقة ومرشحات HEPA (0.22 ميكرومتر).
- تنفيذ جميع الإجراءات والتلاعب من الفئران في الفئة الثانية نوع A2 غطاء محرك السيارة الدخان السلامة البيولوجية التي تم التعامل معها مسبقا مع الإيثانول 70٪. قبل العمل في غرفة الحيوان، دش وتغيير في الدعك نظيفة، دعوى tyvek، ويغطي التمهيد، وغطاء الشعر، قناع الوجه، والقفازات. ارتداء ثوب الجراحة على بدلة tyvek أثناء العمليات الجراحية.
ملاحظة: يفضل أيضا إزالة التلوث الضوئي فوق البنفسجية (UV) قبل الإجراءات.- الأوتوكلاف جميع الصكوك والكواشف إذا كان ذلك ممكنا ومن ثم تطهير قبل نقل إلى غطاء محرك السيارة الدخان.
- أثناء الإجراءات، قم بإزالة أقفاص الحيوانات ذات التهوية الفردية من الرف وتطهيرها قبل نقلها إلى غطاء الدخان.
- تغذية الفئران اتباع نظام غذائي مشع وتوفير المياه الأوتوكلاف. توفير الطعام المشع بـ ab libitum ومكمل غذائي إضافي مع المواد الغذائية المشعة حسب الحاجة. تغيير المياه الأوتوكلاف أسبوعيا أو حسب الحاجة.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام المياه المحمضة الأوتوكلاف. وكان النظام الغذائي المشع المقدمة مدة صلاحية لمدة 6 أشهر بعد التصنيع.
2. توليد الفئران BLT أنسنة
ملاحظة: تم وصف إنشاء الفئران hu-BLT سابقا22و23و24.
- في يوم الجراحة، إعطاء الفئران التشعيع لكامل الجسم بجرعة 12 cGy / غرام من وزن الجسم.
- إعداد الفئران لعملية جراحية.
- إعطاء كل فأر مشع خليط من الكيتامين في تركيز العمل من 100 مغ/كغ وإكسلازين بتركيز 12 مغ/كغ، والتي تراوحت بين 130-170 ميكرولتر لكل فأر على أساس وزن الجسم عن طريق الحقن داخل البريكة (IP) للتخدير. لإعداد 3 مل من خليط الكيتامين وإكسلازين، أضف 0.27 مل من الكيتامين في تركيز الأرصدة من 100 مغ/مل و0.03 مل من إكسلازين بتركيز 100 مغ/مل إلى 2.7 مل من المالحة المعقمة واخلطها جيداً. تطهير الجلد مع 70٪ إيزوبروبانول قبل الحقن.
- إعطاء كل ماوس مشع بوبرينورفين 1 ملغ / كغ من وزن الجسم (نصف لايف 72 ساعة، SR-LAB) عن طريق الحقن تحت الجلد لإدارة الألم طويلة الأمد.
- إعطاء كل فأر مشع 100 ميكرولتر (858 ميكروغرام) من سيفازولين عن طريق حقن IP للوقاية من المضادات الحيوية قبل الجراحة.
- حلاقة شعر الفئران باستخدام مقص الشعر الكهربائية حول الجانب الجانبي الأيسر والوسيط من الماوس في الموقع الجراحي في وقت لاحق تستخدم لفضح الكلى اليسرى.
- تحقق من المستوى المناسب للتخدير عن طريق دواسة رد الفعل (قرصة اصبع القدم شركة).
- إعطاء غاز الأيسوفلوران في 3-5٪ إذا كانت هناك حاجة إلى تخدير إضافي في أي وقت أثناء الجراحة.
- تطبيق مرهم العيون لكلا العينين لمنع جفاف القرنية. تطبيق علامة الأذن إذا لزم الأمر.
- إجراء عملية جراحية لزرع أنسجة الكبد والغدة الصعترية في كبسولة الكلى اليسرى.
- تطهير الجلد في الموقع الجراحي عن طريق تطبيق فرك اليود بدءا من مركز الموقع الجراحي والانتقال نحو الخارج بطريقة دائرية. كرر هذه العملية مع 70٪ إيزوبروبانول ومرة ثالثة مع اليود.
- باستخدام الملقط، أولا تحميل واحد أنسجة الكبد الجنينية البشرية جزء في تروكار. ثم باستخدام ملقط، تحميل واحد جزء من أنسجة الغدة الصعترية الجنينية البشرية في تروكار. ثم باستخدام ملقط، تحميل آخر أنسجة الكبد الجنيني ة الإنسان جزء في تروكار. يجب خفض الأنسجة إلى 1-1.6 مم3 لتناسب الأبعاد الداخلية للتروكار.
- استخدام ملقط لرفع الجلد واستخدام مقص لجعل قطع صغيرة طوليا. قم بتوسيع الخفض إلى 1.5-2 سم في الجانب الأيسر من الماوس.
- استخدام ملقط لرفع طبقة العضلات واستخدام مقص لجعل قطع صغيرة طوليا. تمديد قطع حسب الحاجة لفضح الكلى.
- كشف الكلى عن طريق استيعاب بلطف الأنسجة الدهنية المحيطة بالكلى. لا تلمس البَرَنَكة الكلوية مباشرةً.
- قم بعمل شق 1-2 مم في الطرف الخلفي من كبسولة الكلى باستخدام مشرط.
- أدخل يُحمّل ببطء من خلال الشق الموازي للمحور الطويل للكلية ويطلق الأنسجة بين كبسولة الكلى والكلى.
- إعادة الكلى والأمعاء بعناية إلى وضعها الطبيعي. استخدم الغرز القابلة للامتصاص 5/0 P-3 (P-13) مع إبرة دائرة مقاس 13 مم 3/8 لإغلاق طبقة العضلات والمواد الغذائية الجراحية لإغلاق الجلد.
- بعد الجراحة، وضع الماوس في قفص microisolator الأوتوكلاف نظيفة للتعافي.
- لتقليل فقدان الحرارة أثناء التعافي بعد الجراحة، ضع القفص الذي يحتوي على الفئران على لوحة تدفئة متصلة بمضخة مياه تدفئ المياه وتعممها.
- مراقبة الفئران حتى أنها قد استعادت الوعي الكافي للحفاظ على recumbency صارمة.
- في غضون 6 ساعة من الانتهاء من الجراحة، عن طريق الوريد الذيل، حقن CD34+ الخلايا الجذعية المكونة للدم معزولة عن أنسجة الكبد الجنينية البشرية.
- احماء الفئران بمصباح حراري تطهير الذيل مع 70٪ isopropanol ومن ثم حقن 1.5 إلى 5 × 105 الخلايا الجذعية / 200 درجة مئوية في الوريد الذيل.
- وقف أي نزيف من الحقن وعودة الفئران إلى قفص microisolator وقفص microisolator إلى رف القفص.
ملاحظة: عادة ما يتم إيواء الفئران بعد الجراحة معا، خمسة لكل قفص microisolator، أثناء وبعد الانتعاش. ومع ذلك، يتم إيواء الفئران معا فقط إذا كانوا جميعا خضعوا لعملية جراحية في نفس اليوم.
- تحقق من الفئران يوميا. مراقبة بعناية المواد الغذائية الجراحية واستبدالها حسب الحاجة. مراقبة الفئران عن كثب لأي علامة على العدوى أو عدم الراحة. توريد المواد الغذائية الأوتوكلاف على أرضية القفص microisolator لبضعة أيام بعد الجراحة.
- إزالة المواد الغذائية الجراحية 7-10 أيام بعد الجراحة. إعطاء غاز الأيسوفلوران في 3-5٪ لالتخدير الفئران. إزالة المواد الغذائية بعناية ومن ثم تطبيق المضادات الحيوية ومرهم تخفيف الألم على الموقع.
- السماح 9-12 أسابيع لإعادة تشكيل الخلايا المناعية البشرية، ثم جمع الدم المحيطي من الوريد السفينوس الوسيط من كل من الفئران أنسنة.
- كبح الفئران واعية باستخدام ضبط النفس مخروط البلاستيك الحجم بشكل مناسب مع فتحة بالقرب من رأس الماوس للتنفس وفتح بالقرب من الجزء الخلفي من الماوس لعزل ساق واحدة. وضع الفئران في رأس مخروط ضبط النفس أولا ثم سحب بلطف ساق واحدة من خلال فتح الساق.
- رش الجانب الوسيط من الساق المعزولة مع isopropanol 70٪، ثم نشر المضادات الحيوية ومرهم تخفيف الألم على نفس الموقع.
ملاحظة: مرهم يساعد على الكشف عن موقع الوريد دون الحاجة إلى إزالة الشعر ويساعد أيضا في تشكيل قطرات الدم. - باستخدام إبرة قياس 25 في زاوية 90 درجة، ثقب الوريد وجمع 50-100 درجة مئوية من الدم باستخدام أنبوب جمع الدم المغلفة EDTA. وقف النزيف عن طريق الضغط على الموقع مع الشاش المعقم. بمجرد توقف النزيف، أعد الفئران إلى قفصها.
ملاحظة: الحد الأقصى لأحجام الدم التي يتم جمعها عادة 50 ميكرولتر في الأسبوع أو 100 ميكرولتر كل أسبوعين. - استخدام الدم المحيطي التي تم جمعها لاختبار مستوى إعادة تشكيل الخلايا المناعية البشرية باستخدام قياس التدفق الخلوي مع الأجسام المضادة لhCD45، mCD45، hCD3، hCD4، hCD8، hCD19.
3. العلاج بالمضادات الحيوية
- قبل العلاج بالمضادات الحيوية، جمع عينات البراز قبل العلاج. نقل الفئران إلى قفص microisolator الأوتوكلاف جديدة.
- إعداد كوكتيل جديد من المضادات الحيوية واسعة الطيف يوميا.
- إعداد 250 مل من المياه التي تحتوي على الميترونيدازول الطازجة (1 غرام / لتر)، النيوميسين (1 غرام / لتر)، فانكوميسين (0.5 غرام / لتر)، وAmpicillin (1 غرام / لتر) لكل قفص microisolator من الفئران.
ملاحظة: استخدام المياه الأوتوكلاف أو المعقمة للمضادات الحيوية المثلى مياه الشرب. - إضافة 9.2 غرام من السكر العنب مزيج الشراب المحلاة إلى 250 مل من الماء المضادات الحيوية التكميلية.
ملاحظة: استخدام السكر العنب المحلاة مزيج الشراب يخفي طعم المر من المضادات الحيوية ويساعد على منع الجفاف في الفئران. - تغيير المضادات الحيوية والسكر العنب المحلاة مزيج الشراب التكميلية المياه ووضع الفئران في قفص الأوتوكلاف جديدة يوميا.
ملاحظة: الفئران هي coprophagic وتغيير أقفاص يوميا يمنع الفئران من إعادة تلقيح أنفسهم مع بكتيريا الأمعاء. - للتطعيم القصوى من ميكروبيوم الأمعاء مثل الإنسان، وتوفير المضادات الحيوية لمدة 14 يوما. أثناء العلاج بالمضادات الحيوية، رصد الفئران لفقدان الوزن والجفاف. ومن المتوقع فقدان الوزن خلال أول 3-4 أيام والهضاب بعد ذلك لمدة العلاج. في حالة حدوث الجفاف، قم بإعطاء الفئران المالحة أو حلول الأجراس عن طريق الحقن داخل الصفاق.
ملاحظة: بروتوكولات أنسنة ميكروبيوم الأمعاء الأخرى تدعو إلى اللقاحات عن طريق الفم من المضادات الحيوية. في حين فعالة في استنفاد بكتيريا الأمعاء المورين، وجدنا أن طريقة أقل الغازية لإضافة المضادات الحيوية إلى مياه الشرب وضع أقل الضغط على الفئران لدينا أنسنة وأدى إلى نتائج أفضل.
- إعداد 250 مل من المياه التي تحتوي على الميترونيدازول الطازجة (1 غرام / لتر)، النيوميسين (1 غرام / لتر)، فانكوميسين (0.5 غرام / لتر)، وAmpicillin (1 غرام / لتر) لكل قفص microisolator من الفئران.
4- عينات المانحين وزرع البراز
- إعداد عينات البراز من المتبرعين من البشر.
- استخدام مصادر أعدت بشكل صحيح من المواد زرع ميكروبيوتا البراز (FMT) لزراعة البراز في الفئران أنسنة.
- ذوبان الاستعدادات FMT وaliquot لهم في ظل الظروف اللاهوائية في غرفة اللاهوائية.
- إذا رغبت في ذلك، في هذه الخطوة مزيج أجزاء متساوية من عينات البراز معا لخلق عينة "الإنسان" غير متحيزة.
- الحفاظ على تجميد وذوبان المواد FMT إلى الحد الأدنى، إذا لم تكن هناك حاجة aliquoting أو خلط العينات، ذوبان فقط مباشرة قبل الإجراء.
- زراعة البراز البشري
- بعد الانتهاء من 14 يوما العلاج بالمضادات الحيوية، وتغيير مياه الشرب إلى المياه الأوتوكلاف ونقل الفئران إلى قفص الأوتوكلاف الجديد. وقف التغييرات قفص اليومية وتنفيذ مرة واحدة كل 1-2 أسابيع قفص تغيير الجدول الزمني.
- إعطاء اثنين من زرع البراز في 24 و 48 ح بعد وقف المضادات الحيوية.
- 24 ساعة بعد العلاج بالمضادات الحيوية، إذابة الكمية اللازمة من المواد FMT، وإعطاء كل ماوس 200 درجة مئوية من المواد FMT عن طريق اللقاحات عن طريق الفم. كرر الإجراء مرة أخرى في 48 ح آخر المضادات الحيوية.
- نشر أي ما تبقى أو بقايا المواد FMT إذابة على الفراء من الفئران أنسنة أو على الفراش قفص.
5. جمع عينة البراز الطازجة
- أكياس الورق الأوتوكلاف الفردية قبل نقل إلى غطاء محرك السيارة الدخان.
- في غطاء محرك السيارة الدخان، ووضع ماوس واحد في كل كيس ورقي الفردية والسماح للماوس للتغوط.
- باستخدام ملقط معقمة، وجمع عينة البراز في أنابيب بلاستيكية 1.5 مل وتجميد في -80 درجة مئوية. أعد الفئران إلى أقفاص العزل الصغيرة.
ملاحظة: تسمح هذه الطريقة لجمع عينات البراز لجمع عينة البراز الطازجة من الفئران الفردية دون أي تلاعب اتجذيب الإجهاد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 الخطوط العريضة للأساليب المستخدمة لإنشاء فئران مزدوجة من نوع hu-BLT ويصف بإيجاز عملية إضافة جهاز مناعي بشري وظيفي ومجهري مستقر يشبه الإنسان إلى فئران مجموعة موردي المواد النووية. يظهر الشكل 2 مثالاً على تحليل قياس التدفق للدم المحيطي من BLT-mouse الأنسنة بعد 10 أسابيع من الجراحة. ويبين الشكل 3 الوفرة النسبية لعينات المتبرعين بالبراز البشري المستخدمة لنقل ميكروبيوم الأمعاء لإنشاء فئران مزدوجة. ويبين الشكل 4 التغيرات الفينوتية الناجمة عن العلاج بالمضادات الحيوية للطحال والسيكوم، على غرار ما لوحظ في الحيوانات الخالية من الجراثيم. ويبين الشكل 5 رسماً لتحليل المكونات الرئيسية (PCA) لبيانات تسلسل rRNA 16S التي تكشف عن أن الفئران المزدوجة تحتوي على ميكروبيومات الأمعاء الشبيهة بالإنسان التي تنفرد بها عينة المتبرع البشري.
الشكل 1 إنشاء مزدوجة أنسنة BLT-الفئران. إنشاء الفئران hu-BLT مزدوجة عملية من خطوتين. الخطوة الأولى هي تطعيم الجهاز المناعي البشري إلى الفئران NSG. في يوم الجراحة، يتم إعطاء الفئران NSG التشعيع لخلق مكانة للخلايا الجذعية. ثم يتم زرع الفئران مع الكبد الجنيني البشري وأنسجة الغدة الصعترية وحقنها مع الخلايا الجذعية المكونة للدم البشرية. يتم فحص إعادة تشكيل الخلايا المناعية البشرية حوالي 10 أسابيع بعد الجراحة. الخطوة الثانية هي لتطعيم ميكروبيوم الأمعاء البشرية. يتم التعامل مع الفئران بالمضادات الحيوية للحد من بكتيريا الأمعاء المورين الموجودة من قبل. ثم يتم إعطاء الفئران زرع البراز لتوفير ميكروبيوم الأمعاء البشرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 اختبار إعادة تشكيل الخلايا المناعية البشرية في الفئران BLT المزدوجة أنسنة. مثال على تحليل قياس التدفق لدم محيطي بفأر BLT أنسنة بعد 10 أسابيع من الجراحة. ويبين هذا الرقم استراتيجية التغرير المستخدمة لتحديد مجموعات الخلايا الليمفاوية، والخلايا mCD45- hCD45+، وخلايا CD19+ B، وخلايا CD3+ T، وخلايا CD4+ T، وخلايا CD8+ T. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 ملامح عينة البراز المانحة البشرية. الوفرة النسبية للعينات الثلاثة للمانحين البشريين والمختلطة (جميع المانحين) المعروضة على مستوى الأسرة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 تشبه الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية الأنماط الظاهرية الخالية من الجراثيم. تم التضحية هو الفئران بعد 9 أيام من العلاج بالمضادات الحيوية (المضادات الحيوية) أو لا علاج بالمضادات الحيوية (التحكم). بعد العلاج بالمضادات الحيوية، يبدأ النمط الظاهري للفئران الأنسنة في أن تشبه تلك التي ينظر إليها في الحيوانات الخالية من الجراثيم. نتيجة للعلاج بالمضادات الحيوية هناك انخفاض في حجم الطحال (اليسار) ويتم توسيع cecum (يمين). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5 تتميز الفئران BLT المزدوجة بالبراز المانح ة ميكروبيومس الأمعاء المحددة: PCA مؤامرة من 16S rRNA تسلسل البيانات تظهر بعد زرع البراز البشري الفئران مزدوجة hu-BLT ميزة ميكروبيومات الأمعاء التي هي فريدة من نوعها للمتبرع البراز الإنسان الفردية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا هو لخلق الفئران مزدوجة hu-BLT التي تتميز على حد سواء جهاز المناعة البشرية وظيفية وميكروبيوم الأمعاء مستقرة مثل الإنسان. ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع نماذج الفئران الأخرى الأنسنة أو غير أنسنة دون الحاجة إلى الحيوانات GF ومرافق gnotobiotic. في حين أن الأساليب الموضحة هنا بسيطة نسبيا، هناك العديد من التفاصيل الحرجة التي هي مهمة للنجاح في إنشاء الفئران هو BLT مزدوجة. الفئران NSG هي نقص المناعة للغاية والوقاية من العدوى هو المفتاح لبقاء الفئران على المدى الطويل. وقد اتخذنا التدابير التالية للوقاية من العدوى. أولاً، تم إيواء الحيوانات في أقفاص فردية للعزل الصغير مع مرشحات HEPA (0.22 درجة مئوية) في نظام رف مع إدارة سعر الصرف الجوي في جناح مخصص. يحتوي معالج الهواء للرف على مرشحات مسبقة جنبا إلى جنب مع HEPA تصفية (0.22 ميكرومتر) العرض والهواء العادم، فضلا عن الرصد في الوقت الحقيقي على الانترنت من درجة حرارة الهواء العادم قفص والرطوبة النسبية. ثانيا، كل من دخل غرفة الحيوان اضطر إلى الاستحمام وارتداء الدعك نظيفة والأحذية، فضلا عن وضع على القفازات، بدلة tyvek المتاح، الجوارب، غطاء محرك السيارة الشعر، وقناع الوجه. ثالثا، تم تنفيذ جميع الإجراءات، بما في ذلك تغيير الأقفاص وإضافة الطعام والماء، داخل الفئة الثانية من النوع A2 غطاء الدخان السلامة البيولوجية التي تم تعقيمها مسبقا مع 70٪ الإيثانول والأشعة فوق البنفسجية الخفيفة. رابعاً، تم استخدام تقنية جراحية معقمة أثناء جراحة البقاء على قيد الحياة، والتي شملت الجراح والمساعدين الذين يرتدون طبقة إضافية من الحماية بما في ذلك ثوب الجراحة والقفازات. أجريت الجراحة في غطاء الدخان المطهر، وذلك باستخدام الأدوات المعقمة فقط، والشاش، ومواد إغلاق الجروح، مع الحفاظ على عقم القفازات والأدوات طوال الجراحة. وأخيرا، لمنع العدوى وضمان استقرار ميكروبيوم الأمعاء الشبيهة بالإنسان، كانت جميع المواد الغذائية والمياه التي تعطى للفئران معقمة. وينبغي أن تكون جميع المواد الغذائية مشعة وينبغي أن تكون جميع المياه الأوتوكلاف. لتقليل الألم والكرب، قمنا بإعطاء البوبرينورفين تحت الجلد لفترة طويلة للفئران قبل الجراحة. مزيج من الكيتامين وXylazine للتخدير الجراحي الماوس موثوق جدا ويمكن أن تستمر حوالي 30 دقيقة. إذا لم يكن هذا طويلاً بما فيه الكفاية، فإننا نعطي غاز الإيسوفيلورن لمزيد من التخدير للفئران. ومن المهم جدا أيضا للحفاظ على درجة حرارة الجسم الماوس بعد الجراحة. نضع القفص على لوحة الاحترار ساخنة حتى حقن الخلايا الجذعية المكونة للدم عن طريق الوريد الذيل. في ذلك الوقت، يتم استرداد الفئران من التخدير وإعادتها إلى الرف.
لاستنفاد ميكروبيوم الأمعاء المورين والاستعداد لزراعة البراز البشري، من المهم دائما استخدام المضادات الحيوية المعدة حديثا وتغيير المضادات الحيوية المثلى المياه والأقفاص التكميلية يوميا. وهذا سوف يستخدم العديد من أقفاص العزل الصغير طوال العلاج بالمضادات الحيوية لمدة 14 يوما، لكنه يضمن عدم إعادة تلقيح الفئران من خلال coprophagia. خلال العلاج بالمضادات الحيوية، من المهم أيضا لمراقبة وزن الجسم وصحة الفئران. بعد زراعة البراز، الفئران بسرعة استعادة أي فقدان الوزن. من المهم تقليل أي دورات تجميد ذوبان لمواد زرع البراز والتأكد من استخدام غرفة اللاهوائية إذا كانت هناك حاجة إلى عينات aliquoting. في حين خلق الفئران هو BLT مزدوجة من المهم تقليل المناولة والإجهاد الناجم ة على الفئران. وهذا يساعد على منع العدوى ويحسن البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل.
حاولنا في البداية لعلاج الفئران مع amphotericin المضادة للفطريات B ولكن وجدت الفئران لم تتسامح مع العلاج بشكل جيد جدا وأنه لم يعد يستخدم. كما جربنا فترات مختلفة من العلاج بالمضادات الحيوية. وجدنا أنه في حين أن غالبية بكتيريا الأمعاء المورين يبدو أن استنفدت بعد 7 أيام من المضادات الحيوية، ومستوى الطعوم المانحة أعلى بكثير بعد 14 يوما من العلاج. حاولنا أيضا إعطاء المضادات الحيوية من خلال اللقاحات عن طريق الفم مرتين يوميا. ومع ذلك، وجدنا أن هذه الطريقة كانت الغازية جدا ً لدينا هو الفئران. لقد تحولنا إلى جدول واحد يوميا ً ولكن الفئران لا تزال تبدو متوترة وغير صحية. وجدنا أن توفير المضادات الحيوية في مياه الشرب هو أفضل طريقة. أنها خفضت كمية التعامل مع والإجهاد إلى الفئران في حين لا يزال يقلل بشكل كاف من بكتيريا الأمعاء المورين. قدمنا مزيج مشروب السكر العنب المحلاة في مياه الشرب لضمان الفئران تلقي جرعة كافية من المضادات الحيوية ومنع الجفاف. الفئران لا تواجه انخفاضا في وزن الجسم خلال أول 3-4 أيام من العلاج بالمضادات الحيوية، ولكن توفير سوائل إضافية عن طريق الحقن داخل المجلس اعلى لا يزيد من وزن الجسم. بعد زراعة البراز، الفئران بسرعة استعادة الوزن المفقود.
في حين أن هذه الطريقة قادرة على توليد reproducibly الفئران hu-BLT مزدوجة، هناك بعض القيود على النموذج. أول شيء للنظر هو هو الفئران هو أن يكون أقل تنظيما هيكل اللمفاوية، بما في ذلك مركز الإنبات، مما يؤدي إلى انخفاض تحول فئة الأجسام المضادة والنضج تقارب محدود. ومع ذلك، NSG hu-BLT الفئران لديها إعادة تشكيل المناعة الجهازية والاستجابات خلية T قابلة للترجمة ويمكن استخدامها لنموذج العديد من الأمراض البشرية. وثمة مسألة أخرى هي التطور المحتمل لمرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD) في بعض الفئران بعد عدة أشهر من إعادة تشكيل المناعة البشرية المفرطة. وقد لاحظنا نحن وآخرون مظاهر GVHD مثل التهاب الجفن، الثعلبة، وفقدان الوزن، والانسداد التي يجب رصدها بعناية25.
هناك العديد من النظم الموثقة لاستنفاد بكتيريا الأمعاء في الفئران مع المضادات الحيوية26،27،28،29،30،31. اخترنا كوكتيل لدينا من المضادات الحيوية بسبب قدرتها المعروفة لاستهداف مجموعة واسعة من البكتيريا في الأمعاء ولأننا وجدنا عدة أمثلة على استنفاد البكتيريا الناجحة في الأدب. العديد من الحالات المنشورة تستخدم دورة أقل صرامة بكثير من المضادات الحيوية ولكن في دراستنا، وجدنا أن هناك حاجة إلى 14 يوما لتطعيم الأمثل من ميكروبيوم الأمعاء مثل الإنسان. في حين حاولنا في البداية بروتوكول على أساس Hintze وآخرون، وجدنا أن gavage عن طريق الفم كان الغازية جدا وأن العلاج المضاد للفطريات كان ضارا للفئران26. ونحن نعتقد أن الفئران NSG hu-BLT هي فريدة من نوعها ويفضل إجراءات أقل الغازية بالمقارنة مع الفئران الأخرى أكثر قوة. نحن لم نستخدم الحيوانات GF في دراستنا. استخدام الفئران GF لدراسة آثار ميكروبيوم الأمعاء قد تم توثيقها بشكل جيد، ومع ذلك، هذه الحيوانات ليس لديها جهاز المناعة البشرية19،32. وعلاوة على ذلك، فإننا نعترف بأن العمل مع GF NSG hu-BLT الفئران نموذج من شأنه أن يخلق فرصا مثيرة للاهتمام للبحث. أولاً، دراسة إعادة تشكيل الخلايا المناعية البشرية ومسببات الأمراض الخاصة بمسببات الأمراض البشرية مثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 دون وجود ميكروبيوم الأمعاء يمكن أن توفر نتائج مثيرة للاهتمام. وعلاوة على ذلك، قد تسمح نماذج GF بإعادة تشكيل أكثر اكتمالا ً لميكروبيوم الأمعاء الشبيه ة بالإنسان بعد زراعة البراز. ومع ذلك، الفئران GF لديها نقص المناعة طويلة الأمد، حتى بعد إعادة تشكيل ميكروبيوم الأمعاء21. نموذجنا لديه ميزة استخدام ظروف السكن SPF، والتي هي متاحة على نطاق واسع وأقل تكلفة بالمقارنة مع مرافق GF. نموذجنا لديه أيضا ميزة عدم اضطراب الإجراءات العادية للفئران هو BLT توليد جراحيا لأنه لا توجد حاجة لبيئة GF تماما.
ونحن نعتقد أن هذا النموذج الماوس هو-BLT مزدوجة فريدة من نوعها من حيث أنه لا يمكن استخدامها فقط لدراسة وظيفة المناعة البشرية والأمراض البشرية، ولكن أيضا تحديد تأثير ميكروبيوم الأمعاء على مسببات الأمراض والعلاج في الجسم الحي. مع هذا البروتوكول، يمكننا reproducibly إنشاء الفئران هو BLT مزدوجة مع المانحين البشرية ملامح ميكروبيوم الأمعاء محددة. ولذلك، نعتقد أن استخدام الفئران مزدوجة hu-BLT سوف تكون مفيدة لتطبيقات الطب الشخصية في المستقبل مصممة لاختبار تأثير ميكروبيوم الأمعاء على العلاجات لمختلف الأمراض البشرية مثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 والسرطان. وباختصار، لدينا نموذج الفئران هو-BLT مزدوجة هو نموذج مهم وجديد ما قبل السريرية التي تتميز على حد سواء جهاز المناعة البشرية وظيفية وميكروبيوم الأمعاء مستقرة مثل الإنسان لدراسة صحة الإنسان والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونود أن نشكر يانمين وان، وغوبين كانغ، وبالابي كوندو على مساعدتهم في توليد الفئران ذات الأنسنة BLT. نود أن نعربعن بالمرفق الأساسي لعلم الجينوم التابع للأمم المتحدة الذي يتلقى دعماً جزئياً من شبكة أبحاث نبراسكا في علم الجينوم الوظيفي NE-INBRE P20GM103427-14، البيولوجيا الجزيئية للأنظمة الحسية العصبية CoBRE P30GM110768، وفريد & باميلا مركز بافيت للسرطان - P30CA036727، ومركز الابتكار الجذر وجذمور (CRRI) 36-5150-2085-20، ومبادرة أبحاث نبراسكا. ونود أن نشكر جامعة نبراسكا - ملحق علوم الحياة في لينكولن وموظفيها على مساعدتهم. ويدعم هذه الدراسة جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) المنح R01AI124804، R21AI122377-01، P30 MH062261-16A1 العدوى المزمنة فيروس نقص المناعة البشرية والشيخوخة في مركز NeuroAIDS (CHAIN)، 1R01AI111862 إلى Q Li. ولم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، وإعداد المخطوطة أو اتخاذ قرار لنشرها.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W.
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
