نموذج مزدوج أنسنة BLT-الفئران يضم مستقرة الإنسان مثل الأمعاء ميكروبيوم والجهاز المناعي البشري
Summary
نحن نصف طريقة جديدة لتوليد مزدوجة أنسنة BLT-الفئران التي تتميز نظام المناعة البشرية وظيفية ومستقرة مطعّمة الإنسان مثل ميكروبيوم الأمعاء. ويمكن اتباع هذا البروتوكول دون الحاجة إلى الفئران الخالية من الجراثيم أو مرافق الغنوبوتيك.
Abstract
الفئران الأنسنة (هو الفئران) التي تتميز نظام المناعة البشرية وظيفية قد غيرت بشكل أساسي دراسة مسببات الأمراض البشرية والمرض. ويمكن استخدامها لنمذجة الأمراض التي من الصعب أو المستحيل دراسة في البشر أو النماذج الحيوانية الأخرى. يمكن أن يكون لميكروبيوم الأمعاء تأثير عميق على صحة الإنسان والمرض. ومع ذلك، فإن ميكروبيوم الأمعاء المورين يختلف كثيرا عن تلك الموجودة في البشر. هناك حاجة إلى تحسين نماذج الفئران قبل السريرية التي لديها ميكروبيوم الأمعاء البشرية المطعمة. لذلك، أنشأنا مزدوجة هو الفئران التي تتميز على حد سواء جهاز المناعة البشرية ومستقرة الإنسان مثل ميكروبيوم الأمعاء. موافقه. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) الفئران هي واحدة من أفضل الحيوانات للأنسنة بسبب ارتفاع مستوى نقص المناعة. ومع ذلك، الفئران NSG خالية من الجراثيم، ومختلف نماذج الفئران الأخرى الهامة الخالية من الجراثيم ليست متاحة تجاريا حاليا. وعلاوة على ذلك، فإن العديد من إعدادات البحوث لا يمكن الوصول إلى مرافق الغنوتوبيوتيك، والعمل في ظل ظروف الغنوتوبية يمكن أن تكون في كثير من الأحيان مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. الأهم من ذلك، الفئران الخالية من الجراثيم لديها العديد من أوجه القصور المناعية التي توجد حتى بعد تطعيم الميكروبات. لذلك، وضعنا بروتوكولا لا يتطلب الحيوانات الخالية من الجراثيم أو مرافق gnotobiotic. لتوليد مزدوجة هو الفئران، تم التعامل مع الفئران NSG مع الإشعاع قبل الجراحة لخلق نخاع العظام والكبد والفئران الغدة الصعترية أنسنة (hu-BLT). ثم تم علاج الفئران مع المضادات الحيوية واسعة الطيف لاستنزاف ميكروبيوم الأمعاء المورين الموجودة من قبل. بعد العلاج بالمضادات الحيوية، أعطيت الفئران زرع البراز مع عينات جيدة من المتبرعين الإنسان عن طريق اللقاحات عن طريق الفم. وكان مزدوج ة الفئران HU-BLT فريدة من نوعها 16S rRNA ملامح الجينات استنادا إلى عينة المانحين البشرية الفردية التي تم زرعها. والأهم من ذلك، أن الميكروبيوم الشبيه بالإنسان المزروع كان مستقراً في فئران hu-BLT المزدوجة طوال مدة الدراسة حتى 14.5 أسبوعًا بعد الزراعة.
Introduction
الفئران أنسنة (هو الفئران) حولت دراسة العديد من جوانب صحة الإنسان والمرض بما في ذلك داء الدم،والمناعة، والسرطان، وأمراض المناعة الذاتية، والأمراض المعدية 1،2،3،4 ،5،6،7،8،9. هذه الفئران هو لديها ميزة متميزة على نماذج الماوس الأخرى في أن لديهم نظام المناعة البشرية وظيفية ويمكن أن تكون مصابة مسببات الأمراض البشرية المحددة. ومع ذلك، فقد ثبت أهمية ميكروبيوم الأمعاء من خلال دورها في العديد من الأمراض البشرية مثل السمنة، متلازمة التمثيل الغذائي، والأمراض الالتهابية، والسرطان10،11،12، 13. يتم تنظيم الجهاز المناعي المخاطي وميكروبيوم الأمعاء بشكل متبادل للحفاظ على الأمعاء والتوازن الجهازي. يتم تشكيل الجهاز المناعي من قبل المستضدات التي تقدمها ميكروبيوم الأمعاء وبشكل متبادل الجهاز المناعي يلعب دورا تنظيميا هاما في تعزيز بكتيريا الأمعاء commensal والقضاء على مسببات الأمراض14،15، 16.ومع ذلك، لم تتميز ميكروبيوم الأمعاء من الفئران هو جيدا وميكروبيوم الأمعاء المورين يختلف اختلافا كبيرا في تكوين وظيفة من البشر17. ويرجع ذلك إلى الاختلافات التطورية والفسيولوجية والتشريحية بين المورين والأمعاء البشرية، فضلا عن عوامل هامة أخرى مثل النظام الغذائي، والتي قد تؤثر على النتائج التجريبية لنماذج مرض هو الفئران18. لذلك، إلى جانب تصنيف ميكروبيوم الأمعاء المورين من الفئران هو، وهناك حاجة إلى نموذج حيواني يضم كل من جهاز المناعة البشرية وميكروبيوم الأمعاء البشرية لدراسة التفاعلات المعقدة للأمراض البشرية في الجسم الحي.
دراسة الأمراض البشرية مباشرة في البشر غالبا ما تكون غير عملية أو غير أخلاقية. لا يمكن استخدام العديد من النماذج الحيوانية لدراسة مسببات الأمراض البشرية مثل فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (HIV-1). نماذج الرئيسيات غير البشرية هي ولدت وراثيا، مكلفة جدا، وليست عرضة للعديد من مسببات الأمراض البشرية. الفئران التي تم اشتقاقها كجرثومة خالية (GF) وأعيد تشكيلها مع ميكروبيومالأمعاء مثل الإنسان وقد استخدمت على نطاق واسع لدراسة صحة الإنسان والمرض19،20. ومع ذلك، هذه الحيوانات ليس لديها نظام المناعة البشرية والعمل مع الحيوانات GF يتطلب مرافق متخصصة، والإجراءات، والخبرة. لذلك، هناك حاجة إلى نماذج ما قبل السريرية محسنة لدراسة العلاقة المعقدة من ميكروبيوم الأمعاء والجهاز المناعي البشري. العديد من سلالات الفئران، مثل NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)، ليست متاحة تجاريا ً كفرنك غيني. قد تعاني الحيوانات GF أيضا من نقص المناعة طويلة الأمد التي لا تعكس تماما عن طريق تطعيم الميكروبات21. لذلك، أنشأنا مزدوجة هو الفئران يضم كل من نظام المناعة البشرية وظيفية ومستقرة الإنسان مثل ميكروبيوم الأمعاء في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF). لتوليد مزدوجة هو الفئران، أجريت عملية جراحية على الفئران NSG لخلق نخاع العظام والكبد والفئران الغدة الصعترية أنسنة (hu-BLT). ثم عولجت الفئران hu-BLT مع المضادات الحيوية واسعة الطيف ومن ثم إعطاء عمليات زرع البراز مع عينة من المتبرعين الإنسان صحية. لقد ميّزنا ميكروبيوم الأمعاء البكتيرية من 173 عينة برازية من 45 فأراً ثنائياً من الفئران المزدوجة و4 عينات من المتبرعين بالبراز البشري. الفئران مزدوجة hu-BLT لديها فريدة من نوعها 16S rRNA ملامح الجينات استنادا إلى عينة المانحين الإنسان الفردية التي يتم زرعها. والأهم من ذلك، كانت الميكروبيوم ة الشبيهة بالإنسان المزروعة مستقرة في الفئران طوال مدة الدراسة لمدة تصل إلى 14.5 أسبوع بعد الزراعة. وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت الجينومات المتوقعة أن الفئران المزدوجة hu-BLT لديها قدرة وظيفية متوقعة مختلفة عن الفئران هو التي هي أكثر مماثلة لعينات المانحين البشرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوف هنا هو لخلق الفئران مزدوجة hu-BLT التي تتميز على حد سواء جهاز المناعة البشرية وظيفية وميكروبيوم الأمعاء مستقرة مثل الإنسان. ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع نماذج الفئران الأخرى الأنسنة أو غير أنسنة دون الحاجة إلى الحيوانات GF ومرافق gnotobiotic. في حين أن الأساليب الموضحة هنا بسي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر يانمين وان، وغوبين كانغ، وبالابي كوندو على مساعدتهم في توليد الفئران ذات الأنسنة BLT. نود أن نعربعن بالمرفق الأساسي لعلم الجينوم التابع للأمم المتحدة الذي يتلقى دعماً جزئياً من شبكة أبحاث نبراسكا في علم الجينوم الوظيفي NE-INBRE P20GM103427-14، البيولوجيا الجزيئية للأنظمة الحسية العصبية CoBRE P30GM110768، وفريد & باميلا مركز بافيت للسرطان – P30CA036727، ومركز الابتكار الجذر وجذمور (CRRI) 36-5150-2085-20، ومبادرة أبحاث نبراسكا. ونود أن نشكر جامعة نبراسكا – ملحق علوم الحياة في لينكولن وموظفيها على مساعدتهم. ويدعم هذه الدراسة جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) المنح R01AI124804، R21AI122377-01، P30 MH062261-16A1 العدوى المزمنة فيروس نقص المناعة البشرية والشيخوخة في مركز NeuroAIDS (CHAIN)، 1R01AI111862 إلى Q Li. ولم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، وإعداد المخطوطة أو اتخاذ قرار لنشرها.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
