Summary

Un modèle double humanisé DE BLT-souris avec un microbiome humain stable-comme l'intestin et le système immunitaire humain

Published: August 30, 2019
doi:

Summary

Nous décrivons une nouvelle méthode pour produire des blT-souris doublehumanisées qui comportent un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome d’intestin humain-comme un homme stable. Ce protocole peut être suivi sans avoir besoin de souris exemptes de germes ou d’installations gnotobiotiques.

Abstract

Les souris humanisées (hu-mice) qui disposent d’un système immunitaire humain fonctionnel ont fondamentalement changé l’étude des agents pathogènes humains et de la maladie. Ils peuvent être utilisés pour modéliser des maladies qui sont autrement difficiles ou impossibles à étudier chez l’homme ou d’autres modèles animaux. Le microbiome intestinal peut avoir un impact profond sur la santé humaine et la maladie. Cependant, le microbiome intestinal murine est très différent de celui trouvé chez l’homme.  Il est nécessaire d’améliorer les modèles précliniques hu-mice qui ont un microbiome intestinal humain greffé. Par conséquent, nous avons créé des doubles hu-mice qui comportent à la fois un système immunitaire humain et un microbiome intestinal stable ressemblant à l’homme. hocher la tête. Les souris cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) sont l’un des meilleurs animaux pour l’humanisation en raison de leur niveau élevé d’immunodéficience. Cependant, les souris Sans germe NSG, et divers autres modèles importants de souris sans germes ne sont pas actuellement disponibles dans le commerce. En outre, de nombreux milieux de recherche n’ont pas accès aux installations gnotobiotiques, et travailler dans des conditions gnotobiotiques peut souvent être coûteux et long. Fait important, les souris exemptes de germes ont plusieurs déficiences immunitaires qui existent même après l’engraftment des microbes. Par conséquent, nous avons développé un protocole qui ne nécessite pas d’animaux exempts de germes ou d’installations gnotobiotiques. Pour générer des souris doubles hu-mice, les souris DeNG ont été traitées avec la radiothérapie avant la chirurgie pour créer des souris de moelle, de foie, de thymus-humanisées (hu-BLT). Les souris ont alors été traitées avec des antibiotiques de large spectre pour épuiser le microbiome intestinal murine préexistant. Après traitement antibiotique, les souris ont été données des greffes fécales avec des échantillons sains de donneur humain par l’intermédiaire du gavage oral. Les souris doubles de hu-BLT ont eu les profils uniques de gène de 16S de rRNA basés sur l’échantillon humain individuel de donneur qui a été transplanté. Fait important, le microbiome humain transplanté était stable chez les souris doubles hu-BLT pendant la durée de l’étude jusqu’à 14,5 semaines après la transplantation.

Introduction

Les souris humanisées (hu-souris) ont transformé l’étude de nombreux aspects de la santé humaine et de la maladie, y compris l’hématopoiesis, l’immunité, le cancer, la maladie auto-immune, et la maladie infectieuse1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Ces hu-mice ont l’avantage distinct sur d’autres modèles de souris en ce qu’ils ont un système immunitaire humain fonctionnel et peuvent être infectés par des agents pathogènes spécifiques de l’homme. Néanmoins, l’importance du microbiome intestinal a été démontrée par son rôle dans de nombreuses maladies humaines telles que l’obésité, le syndrome métabolique, les maladies inflammatoires, et le cancer10,11,12, 13. Le système immunitaire muqueux et le microbiome intestinal sont régulés réciproquement pour maintenir l’homéostasie intestinale et systémique. Le système immunitaire est façonné par des antigènes présentés par le microbiome intestinal et, réciproquement, le système immunitaire joue un rôle réglementaire important dans la promotion des bactéries intestinales commensal et l’élimination des agents pathogènes14,15, 16. Cependant, le microbiome intestinal de hu-mice n’a pas été bien caractérisé et le microbiome intestinal murine diffère sensiblement dans la composition et la fonction des humains17. Ceci est dû aux différences évolutives, physiologiques et anatomiques entre le murine et l’intestin humain aussi bien que d’autres facteurs importants tels que l’alimentation, qui peuvent influencer les résultats expérimentaux des modèles de maladie de hu-souris18. Par conséquent, au-delà de la classification du microbiome intestinal murine de hu-mice, un modèle animal comportant à la fois un système immunitaire humain et le microbiome intestinal humain est nécessaire pour étudier les interactions complexes de la maladie humaine in vivo.

L’étude des maladies humaines directement chez les sujets humains est souvent peu pratique ou contraire à l’éthique. De nombreux modèles animaux ne peuvent pas être utilisés pour étudier les agents pathogènes humains comme le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Les modèles de primates non humains sont génétiquement dépassés, très coûteux, et ne sont pas sensibles à de nombreux agents pathogènes humains. Les souris qui ont été dérivées comme sans germe (GF) et reconstituées avec des microbiomes intestinaux semblables à l’homme ont été largement utilisées pour étudier la santé humaine et la maladie19,20. Cependant, ces animaux n’ont pas de système immunitaire humain et travailler avec des animaux GF nécessite des installations spécialisées, des procédures et de l’expertise. Par conséquent, il est nécessaire d’améliorer les modèles précliniques pour étudier la relation complexe du microbiome intestinal et du système immunitaire humain. Beaucoup de souches de souris, telles que NOD. Cg-PrkdccidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), ne sont pas disponibles dans le commerce comme GF. Les animaux DE GF peuvent également souffrir des insuffisances immunitaires de longue durée qui ne sont pas complètement renversées par l’engraftment des microbes21. Par conséquent, nous avons créé un double hu-mice comportant à la fois un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome intestinal stable ressemblant à l’homme dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS). Pour générer des doubles hu-mice, la chirurgie a été effectuée sur des souris NSG pour créer la moelle osseuse, le foie, les souris humanisées de thymus (hu-BLT). Les souris de hu-BLT ont été alors traitées avec des antibiotiques de large spectre et ont alors donné des greffes fécales avec un échantillon humain sain de distributeur. Nous avons caractérisé le microbiome bactérien d’intestin de 173 échantillons fécaux de 45 souris doubles de hu-BLT et de 4 échantillons humains de donneur fécal. Les souris doubles hu-BLT ont des profils génétiques uniques de 16S rRNA basés sur l’échantillon individuel de donneur humain qui est transplanté. Fait important, le microbiome humain transplanté était stable chez les souris pendant la durée de l’étude jusqu’à 14,5 semaines après la transplantation. En outre, les métagénomes prévus ont montré que les souris doubles hu-BLT ont une capacité fonctionnelle prédite différente de celle des souris hu qui est plus semblable aux échantillons de donneurs humains.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été menées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et de recherche sur les animaux (IACUC) à l’Université du Nebraska-Lincoln (UNL). L’IACUC de l’UNL a approuvé deux protocoles liés à la génération et à l’utilisation de souris hu-BLT, y compris des souris doubles. De plus, le Comité de surveillance de la recherche scientifique (CSCO) de l’UNL a également approuvé l’utilisation de cellules souches embryonnaires humaines et de tissu…

Representative Results

La figure 1 montre un aperçu des méthodes utilisées pour créer des souris doubles hu-BLT et décrit brièvement le processus d’ajout d’un système immunitaire humain fonctionnel et d’un microbiome intestinal stable ressemblant à l’homme aux souris NSG. La figure 2 montre un exemple d’analyse de cytométrie de flux du sang périphérique d’une souris BLT humanisée 10 semaines après la chirurgie. La figure 3 montre l’abondance …

Discussion

Le protocole décrit ici est pour la création de souris doubles hu-BLT qui comportent à la fois un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome intestinal stable ressemblant à l’homme. Ce protocole peut être adapté à d’autres modèles de souris humanisées ou non humanisées sans avoir besoin d’animaux GF et d’installations gnotobiotiques. Bien que les méthodes décrites ici soient relativement simples, il y a plusieurs détails critiques qui sont importants pour la création réussie de souris doubles…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Yanmin Wan, Guobin Kang et Pallabi Kundu pour leur aide dans la génération de souris humanisées par le BLT. Nous tenons à remercier l’installation de base en génomique de l’UNMC qui reçoit un soutien partiel du Nebraska Research Network In Functional Genomics NE-INBRE P20GM103427-14, The Molecular Biology of Neurosensory Systems CoBRE P30GM110768, The Fred and Pamela Buffett Cancer Center – P30CA036727, The Center for Root and Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, et Nebraska Research Initiative. Nous tenons à remercier l’Université du Nebraska – Lincoln Life Sciences Annex et leur personnel pour leur aide. Cette étude est soutenue en partie par les Subventions R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI11862 to Q Li.  Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle à jouer dans la conception des études, la collecte et l’analyse des données, la préparation du manuscrit ou la décision de publication.

Materials

Animal Feeding Needles 18G Cadence Science 9928B
Clidox-s Activator Pharmacal Research Laboratories 95120F
Clidox-s Base Pharmacal Research Laboratories 96125F
DGM 108 cage rack Techniplast
Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L  Grainger 12R063
FMT Upper Delivery Microbiota Preparations  OpenBiome FMP30
Grape Kool-Aid Kraft Foods Inc.
hCD19-PE/Cy5 Biolegend 302209
hCD3-PE Biolegend 300408
hCD4-Alexa 700 Biolegend 300526
hCD45-FITC Biolegend 304006
hCD8-APC/Cy7 Biolegend 301016
Lactate Buffered Ringer's Solution Boston BioProducts Inc  PY-906-500 
mCD45-APC Biolegend 103111
Microvette 100 K3E Microvette 20.1278.100
Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment Neosporin
NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) The Jackson Laboratory 005557
PrecisionGlide 25 G Needle BD 305127
RS200 X-ray irradiator RAD Source Technologies
Sealsafe Plus GM500 microisolator cages Techniplast
Sterile Non-woven Gauze Fisherbrand 22-028-558
Teklad global 16% protein irradiated mouse chow Teklad 2916

References

  1. Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
  2. Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
  3. Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
  4. Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
  5. Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
  6. Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
  7. Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
  8. Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
  9. Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
  10. Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
  11. Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
  12. Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
  13. Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
  14. Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
  15. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
  16. Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
  17. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
  18. Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  19. Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
  20. Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
  21. Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
  22. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  23. Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
  24. Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  25. Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
  26. Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
  27. Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
  28. Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
  29. Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
  30. Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
  31. Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
  32. Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).

Play Video

Cite This Article
Daharsh, L., Zhang, J., Ramer-Tait, A., Li, Q. A Double Humanized BLT-mice Model Featuring a Stable Human-Like Gut Microbiome and Human Immune System. J. Vis. Exp. (150), e59773, doi:10.3791/59773 (2019).

View Video