Un modèle double humanisé DE BLT-souris avec un microbiome humain stable-comme l'intestin et le système immunitaire humain
Summary
Nous décrivons une nouvelle méthode pour produire des blT-souris doublehumanisées qui comportent un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome d’intestin humain-comme un homme stable. Ce protocole peut être suivi sans avoir besoin de souris exemptes de germes ou d’installations gnotobiotiques.
Abstract
Les souris humanisées (hu-mice) qui disposent d’un système immunitaire humain fonctionnel ont fondamentalement changé l’étude des agents pathogènes humains et de la maladie. Ils peuvent être utilisés pour modéliser des maladies qui sont autrement difficiles ou impossibles à étudier chez l’homme ou d’autres modèles animaux. Le microbiome intestinal peut avoir un impact profond sur la santé humaine et la maladie. Cependant, le microbiome intestinal murine est très différent de celui trouvé chez l’homme. Il est nécessaire d’améliorer les modèles précliniques hu-mice qui ont un microbiome intestinal humain greffé. Par conséquent, nous avons créé des doubles hu-mice qui comportent à la fois un système immunitaire humain et un microbiome intestinal stable ressemblant à l’homme. hocher la tête. Les souris cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) sont l’un des meilleurs animaux pour l’humanisation en raison de leur niveau élevé d’immunodéficience. Cependant, les souris Sans germe NSG, et divers autres modèles importants de souris sans germes ne sont pas actuellement disponibles dans le commerce. En outre, de nombreux milieux de recherche n’ont pas accès aux installations gnotobiotiques, et travailler dans des conditions gnotobiotiques peut souvent être coûteux et long. Fait important, les souris exemptes de germes ont plusieurs déficiences immunitaires qui existent même après l’engraftment des microbes. Par conséquent, nous avons développé un protocole qui ne nécessite pas d’animaux exempts de germes ou d’installations gnotobiotiques. Pour générer des souris doubles hu-mice, les souris DeNG ont été traitées avec la radiothérapie avant la chirurgie pour créer des souris de moelle, de foie, de thymus-humanisées (hu-BLT). Les souris ont alors été traitées avec des antibiotiques de large spectre pour épuiser le microbiome intestinal murine préexistant. Après traitement antibiotique, les souris ont été données des greffes fécales avec des échantillons sains de donneur humain par l’intermédiaire du gavage oral. Les souris doubles de hu-BLT ont eu les profils uniques de gène de 16S de rRNA basés sur l’échantillon humain individuel de donneur qui a été transplanté. Fait important, le microbiome humain transplanté était stable chez les souris doubles hu-BLT pendant la durée de l’étude jusqu’à 14,5 semaines après la transplantation.
Introduction
Les souris humanisées (hu-souris) ont transformé l’étude de nombreux aspects de la santé humaine et de la maladie, y compris l’hématopoiesis, l’immunité, le cancer, la maladie auto-immune, et la maladie infectieuse1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Ces hu-mice ont l’avantage distinct sur d’autres modèles de souris en ce qu’ils ont un système immunitaire humain fonctionnel et peuvent être infectés par des agents pathogènes spécifiques de l’homme. Néanmoins, l’importance du microbiome intestinal a été démontrée par son rôle dans de nombreuses maladies humaines telles que l’obésité, le syndrome métabolique, les maladies inflammatoires, et le cancer10,11,12, 13. Le système immunitaire muqueux et le microbiome intestinal sont régulés réciproquement pour maintenir l’homéostasie intestinale et systémique. Le système immunitaire est façonné par des antigènes présentés par le microbiome intestinal et, réciproquement, le système immunitaire joue un rôle réglementaire important dans la promotion des bactéries intestinales commensal et l’élimination des agents pathogènes14,15, 16. Cependant, le microbiome intestinal de hu-mice n’a pas été bien caractérisé et le microbiome intestinal murine diffère sensiblement dans la composition et la fonction des humains17. Ceci est dû aux différences évolutives, physiologiques et anatomiques entre le murine et l’intestin humain aussi bien que d’autres facteurs importants tels que l’alimentation, qui peuvent influencer les résultats expérimentaux des modèles de maladie de hu-souris18. Par conséquent, au-delà de la classification du microbiome intestinal murine de hu-mice, un modèle animal comportant à la fois un système immunitaire humain et le microbiome intestinal humain est nécessaire pour étudier les interactions complexes de la maladie humaine in vivo.
L’étude des maladies humaines directement chez les sujets humains est souvent peu pratique ou contraire à l’éthique. De nombreux modèles animaux ne peuvent pas être utilisés pour étudier les agents pathogènes humains comme le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Les modèles de primates non humains sont génétiquement dépassés, très coûteux, et ne sont pas sensibles à de nombreux agents pathogènes humains. Les souris qui ont été dérivées comme sans germe (GF) et reconstituées avec des microbiomes intestinaux semblables à l’homme ont été largement utilisées pour étudier la santé humaine et la maladie19,20. Cependant, ces animaux n’ont pas de système immunitaire humain et travailler avec des animaux GF nécessite des installations spécialisées, des procédures et de l’expertise. Par conséquent, il est nécessaire d’améliorer les modèles précliniques pour étudier la relation complexe du microbiome intestinal et du système immunitaire humain. Beaucoup de souches de souris, telles que NOD. Cg-PrkdccidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), ne sont pas disponibles dans le commerce comme GF. Les animaux DE GF peuvent également souffrir des insuffisances immunitaires de longue durée qui ne sont pas complètement renversées par l’engraftment des microbes21. Par conséquent, nous avons créé un double hu-mice comportant à la fois un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome intestinal stable ressemblant à l’homme dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS). Pour générer des doubles hu-mice, la chirurgie a été effectuée sur des souris NSG pour créer la moelle osseuse, le foie, les souris humanisées de thymus (hu-BLT). Les souris de hu-BLT ont été alors traitées avec des antibiotiques de large spectre et ont alors donné des greffes fécales avec un échantillon humain sain de distributeur. Nous avons caractérisé le microbiome bactérien d’intestin de 173 échantillons fécaux de 45 souris doubles de hu-BLT et de 4 échantillons humains de donneur fécal. Les souris doubles hu-BLT ont des profils génétiques uniques de 16S rRNA basés sur l’échantillon individuel de donneur humain qui est transplanté. Fait important, le microbiome humain transplanté était stable chez les souris pendant la durée de l’étude jusqu’à 14,5 semaines après la transplantation. En outre, les métagénomes prévus ont montré que les souris doubles hu-BLT ont une capacité fonctionnelle prédite différente de celle des souris hu qui est plus semblable aux échantillons de donneurs humains.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici est pour la création de souris doubles hu-BLT qui comportent à la fois un système immunitaire humain fonctionnel et un microbiome intestinal stable ressemblant à l’homme. Ce protocole peut être adapté à d’autres modèles de souris humanisées ou non humanisées sans avoir besoin d’animaux GF et d’installations gnotobiotiques. Bien que les méthodes décrites ici soient relativement simples, il y a plusieurs détails critiques qui sont importants pour la création réussie de souris doubles…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Yanmin Wan, Guobin Kang et Pallabi Kundu pour leur aide dans la génération de souris humanisées par le BLT. Nous tenons à remercier l’installation de base en génomique de l’UNMC qui reçoit un soutien partiel du Nebraska Research Network In Functional Genomics NE-INBRE P20GM103427-14, The Molecular Biology of Neurosensory Systems CoBRE P30GM110768, The Fred and Pamela Buffett Cancer Center – P30CA036727, The Center for Root and Rhizobiome Innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, et Nebraska Research Initiative. Nous tenons à remercier l’Université du Nebraska – Lincoln Life Sciences Annex et leur personnel pour leur aide. Cette étude est soutenue en partie par les Subventions R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI11862 to Q Li. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle à jouer dans la conception des études, la collecte et l’analyse des données, la préparation du manuscrit ou la décision de publication.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
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