Un modello di topi BLT a doppia umanizzata caratterizzato da un microbioma intestinale umano stabile e un sistema immunitario umano
Summary
Descriviamo un nuovo metodo per generare doppi topi BLT umani umani umani che presentano un sistema immunitario umano funzionale e un microbioma intestinale innestato stabile. Questo protocollo può essere seguito senza la necessità di topi privi di germi o strutture gnotobiotiche.
Abstract
I topi umanizzati (topi arabi) che caratterizzano un sistema immunitario umano funzionale hanno cambiato radicalmente lo studio dei patogeni umani e delle malattie. Possono essere utilizzati per modellare malattie che sono altrimenti difficili o impossibili da studiare nell’uomo o in altri modelli animali. Il microbioma intestinale può avere un profondo impatto sulla salute umana e sulle malattie. Tuttavia, il microbioma intestinale murino è molto diverso da quello trovato negli esseri umani. È necessario migliorare i modelli di hu-top preclinici che hanno un microbioma intestinale umano innestato. Pertanto, abbiamo creato due hu-topi che presentano sia un sistema immunitario umano che un microbioma intestinale umano stabile. fare cenno col capo. I topi Cg-PrkdcScidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) sono uno dei migliori animali per l’umanizzazione a causa del loro alto livello di immunodeficienza. Tuttavia, i topi NSG privi di germi e vari altri importanti modelli di topi privi di germi non sono attualmente disponibili in commercio. Inoltre, molte impostazioni di ricerca non hanno accesso a strutture gnotobiotiche, e lavorare in condizioni gnotobiotiche può spesso essere costoso e richiede molto tempo. È importante sottolineare che i topi privi di germi hanno diverse carenze immunitarie che esistono anche dopo l’innesto di microbi. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo che non richiede animali privi di germi o strutture gnotobiotiche. Per generare topi a doppio toro, i topi NSG sono stati trattati con radiazioni prima dell’intervento chirurgico per creare midollo osseo, fegato, topi timo-umanizzati (hu-BLT). I topi sono stati poi trattati con antibiotici ad ampio spettro per esaurire il microbioma dell’intestino murino preesistente. Dopo il trattamento antibiotico, i topi sono stati sottoposti a trapianti fecali con campioni di donatori umani sani tramite gavage orale. I topi a doppio hu-BLT avevano profili genetici di rRNA 16S unici basati sul campione di donatore umano singolo che è stato trapiantato. È importante sottolineare che il microbioma umano trapiantato è rimasto stabile nei topi a doppio hu-BLT per tutta la durata dello studio fino a 14,5 settimane dopo il trapianto.
Introduction
Topi umanizzati (hu-topi) hanno trasformato lo studio di molti aspetti della salute umana e della malattia tra cui ematopoiesi, immunità, e malattie infettive1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Questi hu-topi hanno il netto vantaggio rispetto ad altri modelli murini in quanto hanno un sistema immunitario umano funzionale e possono essere infettati da patogeni specifici umani. Tuttavia, l’importanza del microbioma intestinale è stata dimostrata dal suo ruolo in molte malattie umane come l’obesità, la sindrome metabolica, le malattie infiammatorie e il cancro10,11,12, 13. Il sistema immunitario mucosale e il microbioma intestinale sono reciprocamente regolati per mantenere l’omeostasi intestinale e sistemica. Il sistema immunitario è modellato da antigeni presentati dal microbioma intestinale e reciprocamente il sistema immunitario svolge un importante ruolo regolatore nella promozione dei batteri intestinali commensale ed eliminazione degli agenti patogeni14,15, 16.Tuttavia, il microbioma intestinale dei topi hu non è stato ben caratterizzato e il microbioma intestinale murino differisce sostanzialmente nella composizione e nella funzione degli esseri umani17. Ciò è dovuto alle differenze evolutive, fisiologiche e anatomiche tra il murino e l’intestino umano, nonché ad altri fattori importanti come la dieta, che possono influenzare i risultati sperimentali dei modelli di malattia hu-mice18. Pertanto, al di là della classificazione del microbioma intestinale murino dei topi hu, è necessario un modello animale caratterizzato sia da un sistema immunitario umano che da un microbioma intestinale umano per studiare le complesse interazioni della malattia umana in vivo.
Lo studio delle malattie umane direttamente nei soggetti umani è spesso impraticabile o non etico. Molti modelli animali non possono essere utilizzati per studiare patogeni umani come il virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). I modelli di primati non umani sono geneticamente obsoleti, molto costosi e non sono soggetti a molti patogeni umani. I topi che sono stati derivati come germi liberi (GF) e ricostituiti con microbiomi intestinali simili a come esseri umani sono stati ampiamente utilizzati per studiare la salute umana e la malattia19,20. Tuttavia, questi animali non hanno un sistema immunitario umano e lavorare con gli animali GF richiede strutture specializzate, procedure e competenze. Pertanto, vi è la necessità di migliori modelli preclinici per studiare la complessa relazione del microbioma intestinale e del sistema immunitario umano. Molti ceppi di topi, come NOD. Cg-Prkdcha recitatoIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), non sono disponibili in commercio come GF. Gli animali GF possono anche soffrire di carenze immunitarie di lunga durata che non sono completamente invertite dall’innesto dei microbi21. Pertanto, abbiamo creato un doppio hu-topi caratterizzato sia da un sistema immunitario umano funzionale che da un microbioma intestinale umano stabile in condizioni specifiche di senza patogeni (SPF). Per generare topi a doppio toro, è stato eseguito un intervento chirurgico su topi NSG per creare midollo osseo, fegato, timo mumanizzato topi (hu-BLT). I topi hu-BLT sono stati poi trattati con antibiotici ad ampio spettro e poi sottoposti a trapianti fecali con un campione di donatori umani sano. Abbiamo caratterizzato il microbioma intestinale batterico di 173 campioni fecali di 45 topi a doppio hu-BLT e 4 campioni di donatori fecali umani. I topi a doppia to-BLT hanno profili genici di rRNA 16S unici basati sul campione di donatore umano singolo che viene trapiantato. È importante sottolineare che il microbioma umano trapiantato è rimasto stabile nei topi per tutta la durata dello studio fino a 14,5 settimane dopo il trapianto. Inoltre, i metagenomi previsti hanno mostrato che i topi a doppio hu-BLT hanno una capacità funzionale prevista diversa rispetto ai topi umani che è più simile ai campioni di donatori umani.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è per la creazione di topi a doppia hu-BLT che presentano sia un sistema immunitario umano funzionale che un microbioma intestinale stabile simile all’uomo. Questo protocollo può essere adattato ad altri modelli di topi umanizzati o non umanizzati senza la necessità di animali GF e strutture gnotobiotiche. Mentre i metodi qui descritti sono relativamente semplici, ci sono diversi dettagli critici che sono importanti per la creazione di successo di topi a doppia hu-BLT. I topi NSG sono estre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Yanmin Wan, Guobin Kang e Pallabi Kundu per la loro assistenza nella generazione di topi umanizzati con BLT. Vorremmo riconoscere l’UNMC Genomics Core Facility che riceve un supporto parziale dal Nebraska Research Network In Genomica Funzionale NE-INBRE P20GM103427-14, La Biologia Molecolare dei Sistemi Neurosensoriali CoBRE P30GM110768, The Fred & Pamela Buffett Cancer Center – P30CA036727, Il Centro per l’innovazione radicale e rhizobiome (CRRI) 36-5150-2085-20, e l’iniziativa di ricerca del Nebraska. Ringraziamo l’Università del Nebraska – Lincoln Life Sciences Annex e il loro staff per la loro assistenza. Questo studio è supportato in parte dal National Institutes of Health (NIH) Grants R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 Chronic HIV Infection and Aging in NeuroAIDS (CHAIN) Center, 1R01AI111862 to Q Li. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell’analisi dei dati, nella preparazione del manoscritto o nella decisione per la pubblicazione.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
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