En dubbel humaniserad BLT-möss modell med en stabil människa-liknande Gut Microbiome och människans immun system
Summary
Vi beskriver en ny metod för att generera dubbla humaniserade BLT-möss som har ett funktionellt humant immunförsvar och en stabil inympad människoliknande Gut microbiome. Detta protokoll kan följas utan behov av bakteriefria möss eller gnotobiotiska anläggningar.
Abstract
Humaniserade möss (HU-möss) som har ett funktionellt humant immunförsvar har i grunden förändrat studiet av mänskliga patogener och sjukdom. De kan användas för att modellera sjukdomar som annars är svåra eller omöjliga att studera hos människor eller andra djurmodeller. Tarmen mikrobiomet kan ha en djupgående inverkan på människors hälsa och sjukdom. Emellertid, den murina Gut mikrobiomet är mycket annorlunda än den som finns i människor. Det finns ett behov av förbättrade prekliniska hu-möss-modeller som har en inympad Human tarmmikrobiome. Därför skapade vi dubbla hu-möss som har både ett humant immunsystem och stabil människoliknande Gut microbiome. Nicka. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG) möss är en av de bästa djuren för humanisering på grund av deras höga nivå av immunbrist. Men bakteriefria NSG-möss och olika andra viktiga bakterie fria möss modeller är för närvarande inte kommersiellt tillgängliga. Vidare har många forsknings inställningar inte tillgång till gnotobiotiska anläggningar, och arbetar under gnotobiotiska förhållanden kan ofta vara dyrt och tidskrävande. Viktigt, bakteriefria möss har flera immunbrist som finns även efter engrafharm av mikrober. Därför utvecklade vi ett protokoll som inte kräver bakteriefria djur eller gnotobiotiska anläggningar. För att generera dubbla hu-möss, NSG-möss behandlades med strålning före operationen för att skapa benmärg, lever, thymus-humaniserad (HU-BLT) möss. Mössen behandlades sedan med bredspektrumantibiotika för att tömma den redan existerande murina Gut microbiome. Efter antibiotikabehandling fick möss fekala transplantationer med friska humana donatorprover via oral Sonat. Dubbel hu-BLT möss hade unika 16S rRNA gen profiler baserat på enskilda mänskliga givaren provet som transplanterades. Viktigt, den transplanterade människoliknande mikrobiomet var stabil i den dubbla hu-BLT möss för varaktigheten av studien upp till 14,5 veckor efter transplantation.
Introduction
Humaniserade möss (HU-möss) har förändrat studiet av många aspekter av människors hälsa och sjukdom inklusive hematopoies, immunitet, cancer, autoimmun sjukdom, och infektionssjukdom1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Dessa hu-möss har den distinkta fördelen framför andra musmodeller i att de har ett funktionellt humant immunförsvar och kan smittas med humana specifika patogener. Ändå har betydelsen av Gut mikrobiomet visats av dess roll i många mänskliga sjukdomar som fetma, metabola syndromet, inflammatoriska sjukdomar, och cancer10,11,12, 13. Slemhinnor immunsystemet och Gut mikrobiomet är ömsesidigt reglerad att upprätthålla Gut och systemisk homeostas. Immunförsvaret är formad av antigener som presenteras av tarmen mikrobiomet och ömsesidigt immunförsvaret spelar en viktig reglerande roll för att främja kommensaler tarmbakterier och eliminera patogener14,15, 16. emellertid, Gut mikrobiomet av hu-möss har inte varit väl kännetecknas och murina Gut mikrobiomet skiljer sig avsevärt i sammansättning och funktion från människor17. Detta beror på evolutionära, fysiologiska och anatomiska skillnader mellan murina och mänskliga tarmen samt andra viktiga faktorer såsom diet, som kan påverka de experimentella resultaten av hu-möss sjukdomsmodeller18. Därför, bortom klassificering av murina Gut mikrobiomet av hu-möss, en djurmodell med både ett humant immunförsvar och mänskliga Gut mikrobiomet behövs för att studera komplexa interaktioner av mänskliga sjukdomar in vivo.
Studiet av mänskliga sjukdomar direkt i mänskliga ämnen är ofta opraktiskt eller oetiskt. Många djurmodeller kan inte användas för att studera humana patogener som humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1). Icke-mänskliga primater modeller är genetiskt utavlade, mycket dyra, och är inte mottagliga för många mänskliga patogener. Möss som har framställts som bakteriefria (GF) och rekonstitueras med Human-liknande Gut microbiomes har använts i stor utsträckning för att studera människors hälsa och sjukdom19,20. Emellertid, dessa djur har inte ett humant immunförsvar och arbetar med GF djur kräver specialiserade anläggningar, förfaranden, och expertis. Därför finns det ett behov av förbättrade prekliniska modeller för att studera det komplexa sambandet mellan tarmmikrobiomen och människans immunsystem. Många stammar av möss, såsom nickar. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/szj (NSG), är inte kommersiellt tillgängliga som GF. GF djur kan också lida av långvariga immunbrist som inte är helt omvänd av engrafharm av mikrober21. Därför skapade vi en dubbel hu-möss med både ett funktionellt humant immunsystem och stabil Human-liknande Gut mikrobiomet under specifika patogenfria (SPF) villkor. För att generera dubbla hu-möss, kirurgi utfördes på NSG-möss för att skapa benmärg, lever, tymus humaniserade möss (HU-BLT). HU-BLT möss behandlades sedan med bredspektrumantibiotika och sedan ges fekal transplantationer med en hälsosam Human givare prov. Vi karakteriserade bakterien Gut mikrobiomet av 173 fekal prover från 45 dubbel hu-BLT möss och 4 mänskliga fekal givare prover. Dubbla hu-BLT möss har unika 16S rRNA gen profiler baserade på enskilda mänskliga givare prov som transplanteras. Viktigt, den transplanterade människoliknande mikrobiomet var stabil i möss för varaktigheten av studien upp till 14,5 veckor efter transplantation. Dessutom visade de förutspådda metagenomes att dubbla hu-BLT-möss har olika förväntad funktionell kapacitet än hu-möss som är mer likt de humana donatorproverna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som beskrivs här är för skapandet av dubbla hu-BLT möss som har både ett funktionellt humant immunförsvar och en stabil människoliknande Gut microbiome. Detta protokoll kan anpassas till andra humaniserade eller icke-humaniserade möss modeller utan behov av GF djur och gnobiotisk anläggningar. Medan de metoder som beskrivs här är relativt enkla, det finns flera viktiga detaljer som är viktiga för en lyckad skapandet av dubbla hu-BLT möss. NSG-möss är extremt immunbrist och förhindra infekti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Yanmin WAN, Guobin Kang, och Pallabi Kundu för deras hjälp med att generera BLT-humaniserade möss. Vi skulle vilja erkänna UNMC Genomics Core facility som får partiellt stöd från Nebraska Research Network i funktionell genomik NE-INBRE P20GM103427-14, molekylärbiologi Neurosensoriska system CoBRE P30GM110768, fred & Pamela Buffett Cancer Center-P30CA036727, centrum för root och Rhizobiome innovation (CRRI) 36-5150-2085-20, och Nebraska forskning initiativ. Vi skulle vilja tacka University of Nebraska-Lincoln Life Sciences Annex och deras personal för deras hjälp. Denna studie stöds delvis av National Institutes of Health (NIH) bidrag R01AI124804, R21AI122377-01, P30 MH062261-16A1 kronisk hiv-infektion och åldrande i NEUROAIDS (Chain) Center, 1R01AI111862 till Q Li. Finansiärer hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, förberedelse av manuskriptet eller beslut för publicering.
Materials
| Animal Feeding Needles 18G | Cadence Science | 9928B | |
| Clidox-s Activator | Pharmacal Research Laboratories | 95120F | |
| Clidox-s Base | Pharmacal Research Laboratories | 96125F | |
| DGM 108 cage rack | Techniplast | ||
| Flat Brown Grocery Bag 3-5/8"D x 6"W x 11-1/16"L | Grainger | 12R063 | |
| FMT Upper Delivery Microbiota Preparations | OpenBiome | FMP30 | |
| Grape Kool-Aid | Kraft Foods Inc. | ||
| hCD19-PE/Cy5 | Biolegend | 302209 | |
| hCD3-PE | Biolegend | 300408 | |
| hCD4-Alexa 700 | Biolegend | 300526 | |
| hCD45-FITC | Biolegend | 304006 | |
| hCD8-APC/Cy7 | Biolegend | 301016 | |
| Lactate Buffered Ringer's Solution | Boston BioProducts Inc | PY-906-500 | |
| mCD45-APC | Biolegend | 103111 | |
| Microvette 100 K3E | Microvette | 20.1278.100 | |
| Neosporin First Aid Antibiotic/Pain Relieving Ointment | Neosporin | ||
| NSG mice (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) | The Jackson Laboratory | 005557 | |
| PrecisionGlide 25 G Needle | BD | 305127 | |
| RS200 X-ray irradiator | RAD Source Technologies | ||
| Sealsafe Plus GM500 microisolator cages | Techniplast | ||
| Sterile Non-woven Gauze | Fisherbrand | 22-028-558 | |
| Teklad global 16% protein irradiated mouse chow | Teklad | 2916 |
References
- Simpson-Abelson, M. R., et al. Long-term engraftment and expansion of tumor-derived memory T cells following the implantation of non-disrupted pieces of human lung tumor into NOD-scid IL2R gamma(null) mice. Journal of Immunology. 180 (10), 7009-7018 (2008).
- Bankert, R. B., et al. Humanized Mouse Model of Ovarian Cancer Recapitulates Patient Solid Tumor Progression, Ascites Formation, and Metastasis. PLoS One. 6 (9), (2011).
- Vudattu, N. K., et al. Humanized Mice as a Model for Aberrant Responses in Human T Cell Immunotherapy. Journal of Immunology. 193 (2), 587-596 (2014).
- Whitfield-Larry, F., et al. HLA-A2 Matched Peripheral Blood Mononuclear Cells From Type 1 Diabetic Patients, but Not Nondiabetic Donors, Transfer Insulitis to NOD-scid/gamma c(null)/HLA-A2 Transgenic Mice Concurrent With the Expansion of Islet-Specific CD8(+) T cells. Diabetes. 60 (6), 1726-1733 (2011).
- Yi, G. H., et al. A DNA Vaccine Protects Human Immune Cells against Zika Virus Infection in Humanized Mice. EBioMedicine. 25, 87-94 (2017).
- Stary, G., et al. A mucosal vaccine against Chlamydia trachomatis generates two waves of protective memory T cells. Science. 348 (6241), (2015).
- Sun, Z. F., et al. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4(+) T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. Journal of Experimental Medicine. 204 (4), 705-714 (2007).
- Wang, L. X., et al. Humanized-BLT mouse model of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3146-3151 (2014).
- Ernst, W. Humanized mice in infectious diseases. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases. 49, 29-38 (2016).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444 (7122), 1027-1031 (2006).
- Gopalakrishnan, V., et al. Gut microbiome modulates response to anti-PD-1 immunotherapy in melanoma patients. Science. 359 (6371), 97-103 (2018).
- Routy, B., et al. Gut microbiome influences efficacy of PD-1-based immunotherapy against epithelial tumors. Science. 359 (6371), (2018).
- Clemente, J. C., Manasson, J., Scher, J. U. The role of the gut microbiome in systemic inflammatory disease. Bmj-British Medical Journal. 360, (2018).
- Kau, A. L., Ahern, P. P., Griffin, N. W., Goodman, A. L., Gordon, J. I. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature. 474 (7351), 327-336 (2011).
- Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions Between the Microbiota and the Immune System. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).
- Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature. 489 (7415), 231-241 (2012).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnology. 33 (10), 1103 (2015).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. The Effect of Diet on the Human Gut Microbiome: A Metagenomic Analysis in Humanized Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 1 (6), (2009).
- Hazenberg, M. P., Bakker, M., Verschoor-Burggraaf, A. Effects of the human intestinal flora on germ-free mice. Journal of Applied Bacteriology. 50 (1), 95-106 (1981).
- Hansen, C. H. F., et al. Patterns of Early Gut Colonization Shape Future Immune Responses of the Host. PLoS One. 7 (3), (2012).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S. M., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34(+) cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Li, Q. S., et al. Early Initiation of Antiretroviral Therapy Can Functionally Control Productive HIV-1 Infection in Humanized-BLT Mice. Jaids-Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 69 (5), 519-527 (2015).
- Brainard, D. M., et al. Induction of Robust Cellular and Humoral Virus-Specific Adaptive Immune Responses in Human Immunodeficiency Virus-Infected Humanized BLT Mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Greenblatt, M. B., et al. Graft versus Host Disease in the Bone Marrow, Liver and Thymus Humanized Mouse Model. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Ericsson, A. C., Personett, A. R., Turner, G., Dorfmeyer, R. A., Franklin, C. L. Variable Colonization after Reciprocal Fecal Microbiota Transfer between Mice with Low and High Richness Microbiota. Frontiers in Microbiology. 8, 1-13 (2017).
- Ellekilde, M., et al. Transfer of gut microbiota from lean and obese mice to antibiotic-treated mice. Scientific Reports. 4, (2014).
- Staley, C., et al. Stable engraftment of human microbiota into mice with a single oral gavage following antibiotic conditioning. Microbiome. 5, (2017).
- Zhou, W., Chow, K. H., Fleming, E., Oh, J. Selective colonization ability of human fecal microbes in different mouse gut environments. ISME J. , (2018).
- Lundberg, R., Toft, M. F., August, B., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Antibiotic-treated versus germ-free rodents for microbiota transplantation studies. Gut Microbes. 7 (1), 68-74 (2016).
- Wos-Oxley, M., et al. Comparative evaluation of establishing a human gut microbial community within rodent models. Gut Microbes. 3 (3), 234-249 (2012).
