Formålet med denne protokol er at beskrive et modificeret parallel plade flow kammer til brug ved efterforskning af realtids aktivering af mekanifølsomme Ionkanaler ved hjælp af forskydningsbelastning.
Fluid shear stress er velkendt for at spille en stor rolle i endotelfunktion. I de fleste vaskulære senge, forhøjet shear stress fra akutte stigninger i blodgennemstrømningen udløser en signalering kaskade resulterer i vasodilatation derved lindre mekanisk stress på vaskulære væggen. Mønsteret af shear stress er også velkendt for at være en kritisk faktor i udviklingen af åreforkalkning med laminar shear stress er atheroprotective og forstyrret shear stress er Pro-atherogenic. Mens vi har en detaljeret forståelse af de forskellige mellemliggende celle signalerings veje, er de receptorer, der først oversætter den mekaniske stimulus til kemiske mediatorer, ikke helt forstået. Mekanisk følsomme Ionkanaler er afgørende for reaktionen til at forskyde og regulere forskydnings induceret celle signalering og dermed kontrollere produktionen af vasoaktive mediatorer. Disse kanaler er blandt de tidligste aktiverede signalerings komponenter til forskydning og har været forbundet med forskydnings induceret vasodilatation ved at fremme nitrogenoxid produktion (f. eks. indadtil rektificere K+ [KIR] og forbigående receptor potentiale [TRP] og endotelet hyperpolariserende faktor (f. eks. Kir-og Calcium aktiverede K+ [KCA]-kanaler) og forskydnings induceret vasokonstriktion gennem en ikke-fastlagt mekanisme, der involverer piezo-kanaler. Forståelse af den biofysiske mekanisme, hvormed disse kanaler aktiveres af forskydningskræfter (dvs. direkte eller gennem en primær mechano-receptor) kunne give potentielle nye mål for at løse Patofysiologi forbundet med endoteldysfunktion og atherogenesis. Det er stadig en stor udfordring at registrere flow-induceret aktivering af ion-kanaler i realtid ved hjælp af Elektrofysiologi. De standardmetoder til at eksponere celler til veldefinerede shear stress, såsom kegle og plade rheometer og lukket parallel plade flow kammer tillader ikke real time undersøgelse af ion kanal aktivering. Formålet med denne protokol er at beskrive et modificeret parallel plade flow kammer, der giver mulighed for realtids elektrofysiologisk optagelse af mekaniske følsomme Ionkanaler under veldefinerede forskydnings belastninger.
Hemodynamic kræfter genereret af blodgennemstrømningen er velkendte at spille store roller i endotelog vaskulære funktion1,2. Det er også velkendt, at flere typer Ionkanaler reagerer akut på ændringer i forskydnings stress3,4,5 , hvilket fører til hypotesen om, at ion-kanaler kan være primære forskydnings sensorer. For nylig viste vi og andre, at mekanisk følsomme ion-kanaler spiller kritiske roller i flere forskydnings følsomme vaskulære funktioner, herunder vasoaktiv respons til forskydnings stress6,7,8 og udviklingsmæssige angiogenese9. Mekanismerne i den shear-stress følsomhed af ion-kanaler, dog, er næsten helt ukendt. Denne mangel på viden vil sandsynligvis skyldes de tekniske vanskeligheder ved at udføre elektrofysiologiske optagelser under veldefinerede forskydnings stress. I denne artikel, derfor, vi giver en trin for trin detaljeret protokol rutinemæssigt udføres i vores laboratorium for at nå dette mål6,7,10,11.
Det overordnede mål med denne metode er at tillade realtids undersøgelse af ionkanal mekaniaktivering under veldefinerede forskydnings belastninger i det fysiologiske område. Dette opnås ved at ændre en standard parallel plade flow kammer for at tillade en elektrofysiologisk pipette, der skal sænkes ind i kammeret og adgang celler dyrket på bundpladen i realtid eksponering for flow, hvilket giver en unik tilgang til at opnå dette mål6,7,11. I modsætning hertil kan standard parallelle plade strømnings kamre, der er beskrevet i tidligere publikationer, anvendes til analyse af realtidsbilleder af celler, som eksponeres for forskydningskræfter12 eller andre ikke-invasive tilgange13,14 , men ikke til Elektrofysiologi. Tilsvarende, kegle og plade apparat, en anden kraftfuld tilgang til at udsætte celler til at forskyde stress15,16 er heller ikke egnet til elektrofysiologiske optagelser. Således, disse flow-anordninger tillader ikke undersøgelse af shear stress følsomhed af ion-kanaler. Vanskeligheden ved at udføre elektrofysiologiske optagelser under flow er hovedårsagen til den manglende information om de mekanismer, der er ansvarlige for disse afgørende virkninger.
Med hensyn til de alternative tilgange til at nå det samme mål, er der ingen, der er så nøjagtige eller kontrollerede. Nogle tidligere undersøgelser forsøgte at registrere ion kanal aktivitet under flow ved at udsætte cellerne for en strøm af væske, der kommer fra en anden pipette bragt i nærheden af en celle fra over17,18. Dette er meget ikke-fysiologisk, som de mekaniske kræfter genereret under disse betingelser har lidt til fælles med de fysiologiske profiler af shear stress i blodkarrene. Lignende betænkeligheder gælder for forsøg på at simulere fysiologiske forskydnings stress ved perfusion af åbne kamre. Som diskuteret i detaljer i vores tidligere undersøgelse10, en åben væske-luft interface skaber flere forstyrrelser og recirkulation, som er ikke-fysiologiske. For at imødegå alle disse bekymringer, har vi designet en modificeret parallel plade (MPP) flow kammer, også kaldet “minimalt invasiv flow anordning” i vores tidligere undersøgelser6,7,10,11, lavet fra akryl og flittigt brugt i vores laboratorium. Men på trods af det faktum, at den oprindelige beskrivelse af designet er blevet offentliggjort for næsten 20 år siden, og er den eneste flow anordning, der tillader udførelse elektrofysiologiske optagelser under veldefinerede shear stress, denne metode er ikke blevet vedtaget af andre laboratorier, og der er kun meget få undersøgelser, der forsøger at optage strømme under flow. Vi mener derfor, at give en detaljeret beskrivelse til brug af MPP flow kammer vil være en stor hjælp til forsker, der er interesseret i mekanifølsomme ion-kanaler og vaskulær biologi.
Det vaskulære system er konstant udsat for aktive hæodynamiske kræfter, som aktiverer mekanisk følsomme ion kanaler3,22 men de fysiologiske roller af disse kanaler i shear stress-induceret mekanisotransduktion er kun begynder at dukke4,6,8. De mekanismer, der er ansvarlige for mekanisk følsomhed af shear stress-aktiverede kanaler forbliver ukendte. Den protokol, som…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af national Heart, Lung og Blood Institute (R01 HL073965, IL) og (T32 HL007829-24, ISF). Forfatterne vil også gerne anerkende den videnskabelige maskine butik ved University of Illinois i Chicago for at generere vores nyeste MPP flow kamre.
0.2 µm sterile syringe filters | VWR | 28145-501 | Used for filtering electrophysiolgoical pipette solution |
5 grade forceps | Fine Scientific Tools | 1252-30 | Used for transferring digested arteries to fresh solution |
9" Pasteur Pipet | Fisher Scientifc | 13-678-20D | Used for mechanically disrupting digested arteries and transferring freshly isolated endohtelial cells |
12 mm diameter Cover glass circles | Fisher Scientifc | 12-545-80 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments. Cells adhered to the cover glass are used for patch clamp analyses |
24 x 40 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975224 | Cover glass to be added to MPP flow chamber pieces C (Figure 1) |
24 x 50 mm Rectangluar Cover glass | Sigma-Aldrich | CLS2975245 | Cover glass to be added to MPP flow chamber E (Figure 1) |
20 gauge syringe needles | Becton Dickinson and Co | 305175 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
35 mm Petri dish | Genesee Scientific | 32-103 | For use in mechanical disruption of digested mesenteric arteries |
Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528-50MG | Used for generating the perforated whole-cell patch configuration. |
collagenase, type I | Worthington Biochemical | 100 mg – LS004194 | Enzyme used in our laboratory as a brief digestion following the initial cocktail of neutral protease and elastase |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientifc | 67-68-5 | Solvent for Amphotericin B used in perforated whole-cell patch clamp |
elastase, lyophilized | Worthington Biochemical | 25 mg – LS002290 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with neutral protease/dispase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation. |
Falcon Tissue culture Plate, 6-well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Corning | 353046 | For use with studies involving cultured cells and multiple treatments |
neutral protease/dispase | Worthington Biochemical | 10 mg- LS02100 50 mg – LS02104 | Enzyme used in our laboratory in a cocktail with elastase to begin digestion of arteries for endothelial cell isolation |
SylGard | World Precision Instruments | SYLG184 | Silicone elastomer for adhering the rectangular cover slip to the MPP flow chamber pieces C and E (Figure 1) |
Tygon ND 10-80 tubing | Microbore Tubing | AAQ04133 | ID: 0.05 in, OD: 0.09 in, inlet perfusion tubing for adminsitering flow to the chamber |