Summary
Nous présentons un protocole pour évaluer efficacement la perfusion d'anévrisme et la patency de navire de l'aneurysm latéral chez les rats et les lapins, utilisant l'angiographie vidéo fluorescence fluorécéine à base de fluorénémine (FVA). Avec une valeur prédictive positive de 92,6 %, il s'agit d'une méthode simple mais très efficace et économique, sans équipement spécial requis.
Abstract
Le traitement de l'anévrisme cérébral se concentre sur la réalisation de l'occlusion complète, ainsi que la préservation du flux sanguin dans l'artère parente. Fluorescein sodium et vert endocyanine sont utilisés pour permettre l'observation de la circulation sanguine et l'état de perfusion des vaisseaux, respectivement. L'objectif de cette étude est d'appliquer fVA pour vérifier le flux sanguin en temps réel, l'état de perfusion des vaisseaux et l'occlusion des anévrismes après l'induction d'anévrismes latéraux chez les lapins et les rats, ainsi que de valider la procédure chez ces espèces.
Vingt aneurysms de paroi latérale ont été créés dans 10 lapins en suçant une poche décellularisée de récipient artérielle sur l'artère carotide d'un lapin de distributeur. En outre, 48 aneurysms microchirurgicaux de paroi latérale ont été créés chez 48 rats. Pendant le suivi à un mois après la création, le complexe d'artère/aneurysm de parent a été disséqué et FVA a été exécuté utilisant une injection intraveineuse de fluorescein (10%, 1 ml) par l'intermédiaire d'un cathéterization de veine d'oreille chez des lapins et d'une cathérisation fémorale de veine chez les rats. Des aneurysms ont alors été moissonnés, et la patency a été évaluée macroscopiquement.
Macroscopiquement, 14 aneurysms sur 16 chez les lapins n'ont indiqué aucune perfusion résiduelle d'artère parente avec le luminae totalement occluded, cependant 11 (79%) ont été détectés par FVA. Quatre anévrismes ont été exclus en raison de problèmes techniques. Chez les rats, la perfusion résiduelle d'anévrisme a été macroscopiquement observée dans 25 des 48 cas. Des 23 preuves macroscopiques de perfusion, FVA a confirmé l'incidence de 22 aneurysms (96%). Il n'y avait aucun événement défavorable lié à FVA. La fluorescéine est facilement applicable et aucun équipement spécial n'est nécessaire. Il s'agit d'une méthode sûre et extrêmement efficace pour évaluer l'intégrité de l'artère parente et la patence de l'anévrisme / perfusion résiduelle dans un cadre expérimental avec des lapins et des rats. FVA utilisant la fluorescéine comme agent de contraste semble être efficace en contrôlant la patency des aneurysms et du vaisseau sous-jacent et peut même être adapté à la chirurgie de déviation.
Introduction
L'évidence de l'oblitération complète d'aneurysm et de l'intégrité d'artère de parent est de la plus haute importance dans la chirurgie d'aneurysm. Il y a plusieurs options pour confirmer la patency d'artère de parent et l'occlusion d'aneurysm, telle que l'échographie de Doppler, l'angiographie cérébrale conventionnelle (DSA), l'angiographie calculée de tomographie (CTA) ou l'angiographie de résonance magnétique (MRA) 1,, 2. Cependant, il s'agit de méthodes coûteuses et longues qui ne sont souvent pas disponibles en laboratoire. En outre, ils peuvent avoir des effets secondaires pertinents tels que l'exposition aux radiations ou le besoin d'une sédation supplémentaire des animaux expérimentaux pour éviter l'artefact de mouvement.
Avec l'émergence d'un nombre croissant de nouveaux dispositifs endovasculaires, il y a un besoin consécutif d'essais précliniques de tels dispositifs. Cependant, ces études s'appuient souvent sur l'analyse post mortem (p. ex., macropathologie et histologie) et manquent d'information sur la perfusion dynamique. En outre, pour le chercheur, il peut être crucial d'obtenir des informations immédiates et fiables au cours d'une intervention chirurgicale expérimentale. L'angiographie fluorescence est une technique de visualisation rentable et facile à réaliser1,3,4.
En tant que tel, l'angiographie vidéo en vert endocyanine (ICG) est souvent utilisée dans les procédures neurochirurgicales cliniques et a été largement étudiée5,6. L'angiographie vidéo fluorescéine (FVA) est une technique alternative, avec l'avantage supplémentaire de créer un signal de fluorescence qui est dans la plage de longueur d'onde de la vision humaine, et peut donc être vu à l'œil nu sans une caméra infrarouge à spectre étendu 7. L'angiographie vidéo de fluorescein est moins souvent employée dans la chirurgie cérébrovasculaire clinique et les rapports sur FVA dans les arrangements expérimentaux sont rares1,4.
L'objectif de ce rapport est de démontrer la faisabilité et la portée des applications de l'AVA dans la recherche cérébrovasculaire préclinique de rat et de lapin.
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Protocol
Les rongeurs ont été logés dans un établissement de soins aux animaux et des expériences ont été examinées et approuvées par le Comité pour le bien-être des animaux de l'Université de Berne, en Suisse (BE 108/16) et (BE65/16). Tous les animaux ont été maintenus sur un régime standard de laboratoire avec l'accès libre à la nourriture et à l'eau. Toutes les expériences sur les animaux ont été menées dans le cadre d'un examen minutieux des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Dix femelles néo-zélandaises lapins blancs et 48 rats mâles Wistar ont été inclus. Les directives de l'ARRIVE ont été suivies strictement8.
REMARQUE : Vingt aneurysms de parois latérales ont été créés dans 10 lapins en suçant une poche décellularisée de récipient d'artère sur l'artère carotide d'un lapin de distributeur. En outre, 48 aneurysms microchirurgicaux de paroi latérale ont été créés dans 48 rats comme décrit avant4,9. La procédure de formation image et l'analyse macroscopique a été exécutée 4 semaines après la création d'aneurysm.
1. Préparation du matériel nécessaire à l'angiographie vidéo à la fluorescéine
- Modifier la lampe de poche en tapant sur un filtre bandpass bleu (voir la Table des Matériaux), qui fonctionnera comme un filtre d'excitation. La torche ne doit alors émettre que de la lumière bleue. Utilisez du ruban adhésif noir pour éviter toute fuite de lumière non filtrée.
- Équipez la caméra (p. ex., attachée au microscope) d'un filtre vert de passage de bande (voir le tableau des matériaux),qui fonctionnera comme filtre de lumière d'émission. Seul le feu vert devrait maintenant pouvoir passer à travers.
2. Préparation du lieu de travail et du matériel
- Désinfecter l'espace de travail avec solution désinfectante.
- Couvrir la table de rideaux stériles pour éviter la contamination.
- Utilisez des instruments stériles pour la chirurgie.
3. Préparation des animaux pour la chirurgie
- Pesez les animaux.
- Induire l'anesthésie et ajuster la dose en fonction du poids.
- Pour les lapins,commencer l'anesthésie équilibrée. Protégez leurs yeux d'une main pendant l'injection pour réduire leur réaction d'effroi. Couvrir la cage d'une feuille pour aider à calmer les animaux.
- Anesthésiez les rats dans une chambre à gaz avec 4% d'isoflurane et 96% d'oxygène avant l'injection.
- Surveillez la profondeur de l'anesthésie. Pincez entre leurs orteils pour s'assurer que les animaux dorment.
- Repositionnez les lapins sur leur dos. Ils ne devraient pas réagir.
- Pour lesrats, pincez leur queue et assurez-vous qu'aucune réaction n'est observée.
- Appliquer de la pommade sur les yeux des rongeurs pour prévenir la sécheresse. Sortez les langues des rats pour éviter toute chance d'avaler.
- Commencez par la préservation de l'anesthésie.
- Pour les lapins,cathéterize (22 G protégé cathéter IV avec port d'injection, voir la Table des Matériaux) la veine de l'oreille. Maintenir une anesthésie équilibrée. Utilisez un stopcock à trois voies pour permettre plusieurs injections simultanées.
- Pour les rats, injectez 50 mg/kg d'hydrochlorure de kétamine et 0,5 mg/kg d'hydrochlorure de médetomidine intrapéritoyonne. Surveiller l'anesthésie avec une pincée d'orteil nocif pendant la chirurgie. Dans le cas d'une réaction, administrer un anesthésique supplémentaire.
- Enregistrez les animaux sur la planche en position de supine et raassez de près l'emplacement de l'incision. Désinfecter la zone avec Betaseptic.
- Pour les lapins,désinfecter le cou, en particulier autour du muscle sternocleidomastoid.
- Pour lesrats, désinfecter la zone de la vessie à transversal du côlon.
- Administrer l'oxygène à travers un masque tout au long de la chirurgie et maintenir la température du corps avec un coussin chauffant.
4. Préparation de l'artère
- Pour de meilleurs résultats, disséquer complètement le vaisseau choisi du tissu environnant9,10.
- Pour les rats, identifier la veine de la queue (moins invasive, de préférence utilisée pour les animaux survivants) ou disséquer une veine fémorale pour l'injection de fluorescéine4,11.
REMARQUE: Pour les lapins,aucune dissection supplémentaire des vaisseaux n'est nécessaire pour l'injection de fluorescéine que la veine de l'oreille est déjà utilisé pour l'anesthésie.
- Pour les rats, identifier la veine de la queue (moins invasive, de préférence utilisée pour les animaux survivants) ou disséquer une veine fémorale pour l'injection de fluorescéine4,11.
- Placez un tampon blanc sous le récipient choisi pour augmenter le contraste avec le tissu environnant.
- Concentrez la caméra montée sur le microscope sur l'artère disséquée.
5. Angiographie vidéo de fluorescein
- Couvrir la seringue de 5 ml remplie de fluorescéine de sodium (100 mg/mL, voir le tableau des matériaux) de papier d'aluminium pour se protéger de l'exposition de la lumière. Éteignez les lumières (autant que possible) et injectez de la fluorescéine de sodium par voie intraveineuse. Injecter dans l'obscurité pour éviter le photoblanchiment.
- Pour les lapins,injectez 0,3 mL/kg de fluorescéine de sodium par le triple-stopcock dans la veine cathéterisée de l'oreille.
- Pour les rats, injecter 0,4 mL/kg de fluorescéine de sodium dans la veine fémorale par l'intermédiaire d'un cathéter ou d'une aiguille de 25 G.
- Rincer l'aiguille ou le cathéter avec une solution saline de 0,5 ml pour s'assurer que tout le colorant est injecté.
- Illuminez le champ chirurgical avec la lampe de poche modifiée.
- Commencez le tournage avec la caméra modifiée. Le flux sanguin devrait être visible quelques secondes après l'injection (Figure 1).
REMARQUE : Ici, nous avons utilisé la fréquence d'image de 50 images/s, la longueur focale de 70 mm et le F3.4.
6. Analyse macroscopique
- Reséquez les anévrismes et le complexe de l'artère parente, et évaluez la patency macroscopiquement en ouvrant l'artère parente avec des micro-ciseaux et évaluez le lumen de l'artère parente et de l'orifice de l'anérisme (voir Figure 1, 2)9. Mesurer la taille des anévrismes. Le complexe anévrisme-parent-artère peut alors être stocké pour une analyse plus approfondie (par exemple, histologie).
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Representative Results
La fréquence cardiaque et la tension artérielle ont été surveillées pendant la chirurgie. La fréquence cardiaque moyenne était de 193/min chez les lapins et de 196/min chez les rats. Le poids corporel des lapins variait de 3,05 à 4,18 kg, et les rats pesaient de 335 à 690 g.
Nous avons été en mesure d'effectuer FVA dans huit lapins sur dix (Figure 1). Quatre examens d'anévrisme chez deux lapins n'ont pas été enregistrés avec la caméra en raison de difficultés techniques. Aucune difficulté technique impliquant FVA chez les rats n'a été rapportée. Cependant, FVA n'a pas pu être exécuté dans un rat dû aux difficultés perforant la veine fémorale.
De 16 aneurysms dans huit lapins, deux aneurysms ont montré la perfusion persistante de l'artère parente (confirmée macroscopiquement) (voir le tableau 1) tandis que FVA a identifié cinq cas avec perfusion résiduelle. 14 anévrismes de lapin n'ont montré aucune perfusion résiduelle macroscopique, cependant 11 (79%) ont ensuite été détectés à l'aide de l'AF. La perfusion résiduelle a été observée macroscopiquement chez 25 des 48 rats (tableau 1), et les 23 autres rats n'ont montré aucun signe macroscopique de perfusion résiduelle (Figure 2). 22 de ces 23 anévrismes ont ensuite été confirmés à l'aide de FVA (96%). Au total, 25 des 27 cas ont pu être confirmés, ce qui a donné une valeur prédictive positive de 92,6 %, un taux de sensibilité de 100 % et une spécificité de 94,1 %. (Tableau 2).
En résumé, 25 aneurysms ont montré la perfusion résiduelle, 53 artères de parent étaient patentes et 11 ont été occluded comme macroscopiquement confirmé et sur l'angiographie vidéo. Il n'y avait que des complications mineures associées à l'AF chez les lapins; comme la perforation de la veine d'oreille marginale pendant le cathétérisation. Aucun autre événement indésirable n'a été connu. Aucune mortalité et aucune morbidité due à FVA n'a été rapportée.
Figure 1 : Visualisation de la patency dans un lapin. (A) La patenité de l'artère parente est clairement visible sur l'image de fluorescence (émission verte de fluorescéine sont vus). (B) Cette artère est occluded (image de fluorescence). Les deux artères ont été inspectées macroscopiquement (C-D). Panneau (C) montre dans l'artère du panneau A; le lumen est ouvert. Le panneau (D) montre l'artère du panneau B où l'occlusion peut être vue macroscopiquement. Les lignes pointillées oranges marquent les bordures de l'artère parente. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Visualisation de perfusion chez un rat. (A) Ce panneau montre un anévrisme perfus résiduellement perfused (ligne pointillée rouge marque la perfusion résiduelle). (B) Aucune perfusion ne peut être détectée. Le panneau (C) montre l'artère du panneau A pendant l'examen macroscopique ; l'orifice d'anévrisme est ouvert. (D) Vue macroscopique de la néointima sur un anévrisme occluded. Les lignes pointillées oranges marquent l'artère parente et le dôme de l'anévrisme. Les panneaux (A) et (B) sont des images à fluorescence seulement et la couleur verte montre l'émission de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Patency/Perfusion résiduelle | ||||
| Macroscopical - États-Unis | Macroscopical - | Fluorescein - États-Unis | Fluorescéine - | |
| Lapins | 2 (en) | 14 (en) | 5 Annonces | 11 Ans, états-unis ( |
| Rats | 23 Ans, états-unis | 25 Annonces | 22 Ans | 21 Ans, états-unis |
| total | 25 Annonces | 39 Ans et plus qu'ils | 27 Annonces | 32 Ans, états-unis ( |
Tableau 1 : Test de patency. La patency de l'artère parente n'a été testée que chez les lapins et est illustrée ici. Fluorescein détecté plus de patencies des artères parentes que l'évaluation macroscopical. (Tous les rats dans ce cadre ont eu une artère parente ouverte, car des anévrismes ont été suturedsur sur l'aorte abdominale.) La patency des anévrismes a été testée chez les rats seulement. Vingt-deux des 23 patencies macroscopiquement détectées ont été confirmées utilisant FVA. Vingt-et-un sur 25 n'ont montré aucune patency sur FVA.
| Macroscopique positif | Négatif macroscopique | total | |
| Fluorescein positif | 25 Annonces | 2 (en) | 27 Annonces |
| Fluorescein négatif | 0 (en) | 32 Ans, états-unis ( | 32 Ans, états-unis ( |
| total | 25 Annonces | 34 Ans, états-unis ( |
Tableau 2 : Tableau deux par deux utilisé pour calculer la spécificité et la sensibilité de l'AVA.
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Discussion
FVA est une méthode prometteuse et simple pour examiner les navires chez les rongeurs et peut être effectuée avec des dispositifs commerciaux et de l'équipement sur le marché. FVA peut être mis en œuvre au cours de toute chirurgie où l'évaluation peropératoire de l'intégrité des navires est nécessaire que les vaisseaux ont besoin d'une dissection appropriée d'abord.
Les auteurs ont préféré l'injection veineuse à l'injection artérielle due au plus faible risque d'événements par inadvertance tels que l'infection, l'ischémie et le syndrome de compartiment12. L'injection intraveineuse permet une coloration fiable, spatialement limitée, très concentrée, et nécessite de petites doses de colorant13,14. En outre, l'injection veineuse permet un dégagement rapide de la fluorescéine14,15. Une autre méthode consiste à injecter l'agent de contraste directement dans l'artère choisie. Cette méthode n'a pas été utilisée dans ces expériences car les chercheurs voulaient empêcher de contaminer le champ chirurgical avec du sang et de la fluorescéine. Afin de réduire ce risque, l'injection périphérique d'agent de contraste veineux est recommandée13.
Les avantages de l'AVA sont à fort contraste (facilement détectable avec l'œil humain), haute sensibilité comme indiqué ci-dessus (tableau 2), faible coût et manipulation facile16. Fluorescein sodium était l'agent de contraste choisi pour examiner la perfusion. La lumière visible seule peut être utilisée pour l'excitation du colorant et l'émission de la lumière verte typique. Néanmoins, cet agent de contraste fonctionne mieux avec la lumière bleue (environ 480 nm) et émet une forte lumière verte (longueur d'onde d'environ 530 nm)15. Selon Yoshioka et autres, la fluorescéine colore l'artère très rapidement14. En outre, le flux de sang enrichi en fluorescéine peut être observé en temps réel15,17. Le peu de temps nécessaire pour FVA présente un autre avantage; dans cette série, il a fallu une moyenne de 2 min (1 min) pour effectuer un FVA.
L'inconvénient de l'utilisation de la fluorescéine comme un agent de contraste, c'est qu'il fonctionne bien avec seulement les parois des artères minces qui exigent une dissection très prudente. Ichikawa et coll. ont montré l'extinction de la teinture due à l'émission contrariée de lumière à travers des parois plus épaisses par calcification ou artères non disséquées15. Après l'injection, la fluorescéine est métabolisée au glucuronide fluorescent de fluorescein dans le foie. Dans les 30 minutes après l'injection, la concentration de glucuronide de fluorescéine dépasse la concentration de fluorescéine18. La fluorescéine nécessite un long temps de dégagement. Une réinjection immédiate après injection intraveineuse de fluorescéine n'est pas recommandée car l'artère et l'anévrisme sont déjà fluorescents dès la première injection17.
Le poids moléculaire de la fluorescéine est seulement 376 kDa qui permet la fuite du colorant. La paroi vasculaire devient également fluorescente qui pourrait mener à de fausses évaluations positives de flux (augmentant avec le temps après application). Une coloration inégale de la paroi du navire a été observée à partir d'environ 5 min après injection de fluorescéine14. La coloration inégale, cependant, a été seulement observée dans de plus grandes artères. Les petites et moyennes artères n'ont pas montré cette structure de coloration17. Il est recommandé d'évaluer l'anévrisme immédiatement afin de détecter le remplissage résiduel.
Bien qu'il y ait un risque très faible de toxicité, certains cas de fluorescéine menant aux réactions cardiaques et respiratoires ont été décrits14. Dans cette étude, aucun événement indésirable grave ne s'est produit; les seules complications étaient 2 cas de perforation de veine d'oreille. Selon Lane et coll., la fluorescéine de sodium n'est pas nocive même lorsqu'elle est utilisée chez l'homme17. D'autre part, la fluorescéine est assez instable et ne doit pas être exposée à la lumière blanche16 - une source de lumière rouge peut être utilisé à la place.
Afin de choisir la concentration de fluorescéine pour les lapins, les chercheurs ont commencé avec la dose de travail la plus faible connue chez les rats (0,2 ml de 100 mg/mL de fluorescéine de sodium) et l'ont augmentée progressivement à 1 ml. Un signal de fluorescence fort a été enregistré à cette dose. La dose a été augmentée progressivement pour tester si la fluorescence s'améliore - ce qui n'était pas le cas. Les auteurs ont décidé de continuer avec 1 ml de fluorescéine13mg/mL.
Un autre colorant disponible pour examiner des navires peropératoirement est ICG. Sa taille est 775 kDa et tel pénètre à peine les tissus environnants14. En raison de ses longueurs d'onde d'émission plus longues, le tissu est pénétré plus facilement parce que les tissus sont plus transparents à 800 nm19 et les structures plus profondes deviennent visibles14,16. La longueur d'onde d'excitation dans le 750-800 nm sont exigées16,20 et la longueur d'onde d'émission de l'agent de contraste est approximativement 800 nm16,rendant les deux invisibles à l'oeil humain. En raison de sa courte demi-vie dans le plasma sanguin, le colorant peut être injecté et réutilisé à plusieurs reprises16. Les limites à l'utilisation de ce colorant comprennent des problèmes avec les artères à parois épaisses20 et la nécessité de la lumière en dehors du spectre visible13. Par conséquent, iCG dépend d'équipements coûteux et ne s'applique pas facilement dans tous les laboratoires.
En conclusion, FVA est une méthode rapide, peu coûteuse et fiable avec une sensibilité élevée à la patency d'écran des aneurysms et des artères parentes dans les modèles d'anévrisme de rongeur. Elle n'est pratiquement associée à aucune morbidité et mortalité. Il permet une surveillance du flux sanguin en temps réel pendant la chirurgie et le suivi. Pour améliorer son efficacité, l'injection doit être effectuée dans l'obscurité et est mieux effectuée sur des vaisseaux méticuleusement disséqués. Cette méthode peut être facilement et en toute sécurité mise en œuvre dans un laboratoire cérébrovasculaire, et peut minimiser les coûts d'expérience.
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Disclosures
Tous les auteurs ne confirment aucun conflit d'intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue en partie par une subvention de recherche du Kantonsspital Aarau, en Suisse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For rabbits | |||
| Aluminium foil | |||
| Animal shaver | |||
| Black tape | |||
| Blue filter | Thorlabs MF475-35 | ||
| Body warm plate | |||
| Camera | Sony NEX-5R | ||
| Catheter | 22G Vasofix Safety | ||
| Disinfictant | |||
| Fluorescein sodium | Fluorescein Faure 10% | ||
| Glas plate | |||
| Green filter | Thorlabs MF539-43 | ||
| Incontinence pad | |||
| Infusion pump | Perfusor Secura | ||
| Ketamine hydrochloride | any generic products | ||
| Needle | 25G | ||
| Oxygen | |||
| Ringer's Solution | |||
| Sterile sheets | |||
| Surgical instruments | micro forceps, micro scissor, blunt surgical scissor | ||
| Surgical microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Syringe 2ml, 5ml, 50ml | |||
| Tape | |||
| Three-way-stopcock | |||
| Torch light | |||
| Xylazin | any generic products | ||
| For rats | |||
| Aluminium foil | |||
| Animal shaver | |||
| Black tape | |||
| Blue filter | Thorlabs MF475-35 | ||
| Body warm plate | |||
| Camera | Sony NEX-5R | ||
| Disinfictant | |||
| Fluorescein sodium | Fluorescein Faure 10% | ||
| Green filter | Thorlabs MF539-43 | ||
| Incontinence pad | |||
| Isoflurane | |||
| Ketamine hydrochloride | any generic products | ||
| Medetomidine hydrochloride | any generic products | ||
| Needle | 25G | ||
| Oxygen | |||
| Plate | |||
| Ringer's Solution | |||
| Sterile sheets | |||
| Surgical instruments | micro forceps, micro scissor, blunt surgical scissor | ||
| Surgical microscope | OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany | ||
| Syringe 2ml, 5ml | |||
| Tape | |||
| Torch light |
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