Summary
Hier gepresenteerd is een protocol met behulp van een temperatuur gecontroleerde Microscoop fase die het mogelijk maakt een monster container te monteren op een verticale Microscoop.
Abstract
Monsters worden meestal op een horizontale Microscoop-fase geplaatst voor microscopische observatie. Echter, om de invloed van de zwaartekracht op een monster of studie drijven gedrag te observeren, is het noodzakelijk om de Microscoop fase verticaal te maken. Om dit te bereiken, is een zijwaartse omgekeerde Microscoop gekanteld met 90 ° bedacht. Om monsters met deze Microscoop te observeren, moeten Monsterhouders zoals Petri schalen of glaasjes verticaal op het podium worden vastgezet. Er is een apparaat ontwikkeld dat de Monsterhouders op een verticale Microscoop-fase kan beveiligen en hier wordt beschreven. Bevestiging van dit apparaat aan het werkgebied maakt observatie van de monster dynamiek in het verticale vlak mogelijk. De mogelijkheid om de temperatuur te reguleren met een silicone rubberen kachel maakt ook observatie van temperatuurafhankelijke monster gedragingen mogelijk. Bovendien worden de temperatuur gegevens overgebracht naar een Internet server. Temperatuurinstellingen en logboek bewaking kunnen op afstand vanaf een PC of smartphone worden bediend.
Introduction
Optische microscopie is een techniek gebruikt om observeerbare details te verhogen via vergroting van een monster met lenzen en zichtbaar licht. In optische microscopie wordt licht op een monster gericht, vervolgens overgebracht, gereflecteerd, of fluorescerende licht wordt opgevangen door vergrootglazen voor observatie. Er zijn verschillende soorten Microscoop beschikbaar die verschillen in ontwerp om tegemoet te komen aan verschillende toepassingen en observatie methoden. De verschillende ontwerpen omvatten een rechtopstaande Microscoop, die is gestructureerd om een monster van onder te verlichten voor observatie van bovenaf, en een omgekeerde Microscoop, die het monster van bovenaf verlicht voor observatie van onderen. Staande microscopen zijn het meest voorkomende en meest gebruikte ontwerp. Omgekeerde microscopen worden vaak gebruikt om monsters te observeren die een lens niet in de verte van bovenaf kunnen sluiten, zoals gekweekte cellen die zich aan de onderkant van een container hechten. Veel onderzoeksgroepen hebben waarnemingen gerapporteerd in een breed scala van velden met behulp van omgekeerde microscopen1,2,3,4,5,6,7. Veel extra apparaten zijn ook ontwikkeld die profiteren van de functies van omgekeerde microscopen8,9,10,11,12,13 .
Momenteel is de Microscoop fase in alle conventionele Microscoop ontwerpen horizontaal en ongeschikt voor het observeren van monsters die beweging in het verticale vlak produceren (door zwaartekracht, drijfvermogen, beweging, enz.). Om deze waarnemingen mogelijk te maken, moeten de Microscoop fase en het lichtpad worden gedraaid naar verticaal. De verticale trap is vereist voor het verticaal monteren van glaasjes of Monsterhouders zoals een Petri schaaltje op het podium. Om dit aan te pakken, is er al een zijwaartse omgekeerde Microscoop gekanteld met 90 ° bedacht. Het bevestigen van samples met tape of andere lijmen geeft echter niet de noodzakelijke langdurige immobiliteit. Hier beschreven is een apparaat dat de nodige stabiliteit kan bereiken. Dit apparaat maakt observatie mogelijk na verloop van tijd van de monster beweging in het verticale vlak. Het monteren van een siliconen rubberen kachel heeft het ook mogelijk gemaakt om de invloed van temperatuur variatie op het monster gedrag te observeren. Temperatuur gegevens worden via Wi-Fi overgebracht naar een Internet server en de temperatuurinstellingen en logboek bewaking kunnen op afstand vanaf een PC of smartphone worden bestuurd. Naar onze kennis is het podium bevestigd aan een zijwaartse gekantelde Microscoop, gekanteld met 90 °, nog niet gemeld in voorgaande studies.
De Microscoop fase bestaat uit drie aluminium platen. De middelste aluminium plaat is gemonteerd op de onderste aluminium plaat die aan het podium wordt bevestigd. Het Silicone rubber met de temperatuursensor is bevestigd tussen de middelste en bovenste aluminium platen. Elastiekjes worden gebruikt om het monster aan te brengen. De klauwen zijn links en rechts vier punten van de bovenste aluminium plaat bevestigd om de elastiekjes te beveiligen. Het controle circuit van de temperatuurregelaar ontvangt een signaal van de temperatuursensor ingebed in Silicone rubber en moduleert elektrische stroom door de Pulsbreedtemodulatie (PWM) methode. De temperatuur kan geleidelijk worden verhoogd tot 50 °C in stappen van 1 °C. Dit apparaat is handig voor toepassingen waarin verticale monster bewegingen afhankelijk van de temperatuur kunnen zijn.
Dit verslag geeft voorbeelden van temperatuureffecten op het drijvende fenomeen van diatomen. Als voorbeelden van diatoom observatiestudies werden metingen van sedimentatie snelheid van celclusters, bewegingsanalyses, ultrafijne structuur studies, etc. gerapporteerd14,15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. de soortelijke zwaarte van diatomen die in water met fotosynthetische organismen zweven, is iets hoger dan dat van water, zodat ze de neiging hebben om te zinken; ze zullen echter stijgen als er zelfs lichte convectie optreedt. Om dit fenomeen te bestuderen, wordt een glazen glijbaan verticaal op een Microscoop-fase aangebracht en worden de effecten van stijgende temperatuur op diatoom verticale beweging waargenomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ontwerp
- Fabricage van aluminium platen
- Snijd een gat van 101 mm in het midden van een aluminium plaat met afmetingen 150 mm x 200 mm x 2 mm om te worden gebruikt als de voorste plaat met een laser verwerkingsmachine. Machine klauwen op acht punten om twee elastiekjes over de lengte aan te brengen, of twee over de breedte van deze plaat (Zie aanvullende figuur 1a en aanvullende Figuur 2a).
- Snijd een gat van 130 mm in het midden van een andere 150 mm x 200 mm x 5 mm aluminium plaat om te worden gebruikt als de middelste bovenste plaat met een laser verwerkingsmachine. Machine acht inkepingen voor het bevestigen van elastiekjes op twee punten over de lengte, of twee over de breedte van deze plaat (Zie aanvullende figuur 1b en aanvullende figuur 2b).
- Snijd een 130 mm gat in het midden van een 150 mm x 200 mm x 4 mm aluminium plaat te gebruiken als de middelste onderste plaat met een laser verwerkingsmachine (Zie aanvullende figuur 1c en aanvullende figuur 2c).
- Snijd een gat van 30 mm in het midden van een 150 mm x 200 mm x 1,5 mm aluminium plaat die als basisplaat moet worden gebruikt (Zie aanvullende figuur 1d en aanvullend figuur 2D).
- Fabricage van twee aluminium sokkel
- Snijd een gat van 30 mm in het midden van de aluminium plaat (100 mm diameter, 3 mm dikte) en maak een inkeping van de ene kant met de afmetingen 42 mm breed x 30 mm diep (Zie aanvullende Figuur 3a).
- Snijd een gat van 30 mm in het midden van de plaat in een aluminium plaat (100 mm diameter, 4 mm dikte) en boor drie 3 mm gaten op 25 mm van het midden, op een afstand van 120 ° van elkaar (Zie aanvullende Figuur 3b).
- Fabricage van drie geperste kurk schijven
- Snijd een gat van 20 mm in het midden van de geperste kurk schijf (100 mm diameter, 2 mm dikte) met een waterstraal snijmachine. Maak een snede van 42 mm over x 30 mm diep en vervolgens een snede van 4 mm breed x 5 mm diep (Zie aanvullende figuur 4a).
- Snijd een gat van 20 mm in het midden van de geperste kurk schijf van afmetingen 100 mm diameter, 1 mm dikte met een waterstraal snijmachine. Maak een snede van 42 mm over x 30 mm diep, een snede van 4 mm breed x 40 mm diep (Zie aanvullende figuur 4b).
- Knip een geperste kurk plaat van een schijf van 100 mm diameter met een breedte van 42 mm en een diepte van 30 mm. Twee vellen met een dikte van 1 mm en een plaatdikte van 2 mm zijn vereist (Zie aanvullende figuur 4c).
- Vervaardiging van silicone rubberen kachel
- Fabriceren van een kachel met behulp van een 100 mm diameter schijf van 2,5 mm dik silicium rubber met ingebouwde Nichrome draad en snijd een gat van 20 mm in het midden van de schijf (Zie aanvullende figuur 5).
- Onderdelen monteren zoals beschreven in stap 1.1 – 1.4 door ze te stapelen zoals weergegeven in aanvullend figuur 6.
- Voor het construeren van een Microscoop fase, Zie aanvullende figuur 6, dwarsdoorsnede van de Microscoop. Bevestig
en 
, dan 
en 
met schroeven. Fixeer 
en met schroeven. Fixeer en 
, en, en, en, en en met lijm. 
en 
, dan 
en 
met schroeven. 
en met schroeven. 
, en, en, en, en en met lijm. 
2. hardware ontwerp contouren
- Maak een "voedings-en programmeer schakeling" zoals weergegeven in aanvullend figuur 7. Toevoer van 12 V DC naar de Verwarmingsregelaar vanaf de J4-aansluiting die is aangesloten op de AC-adapter. Verlaag de spanning van 12 V DC naar 3,3 V DC voor de stroomvoorziening van het circuit met behulp van een regulator omdat de CPU-voedingsspanning 3,3 V DC is.
Opmerking: USB 1 is een Terminal voor 5 V DC en seriële signaal van ontwikkeling PC. Hoewel 5 V DC niet essentieel is, wordt het gebruikt als de voedingsbron om de CPU te programmeren. Dit wordt ook omgezet in 3,3 V DC door de regulator. J1 is een controlesignaal Terminal op het moment van programmering. Dit circuit is ondergebracht in de bedieningskast die wordt weergegeven in aanvullend figuur 8. - Bereid een "verwarmingscircuit" zoals weergegeven in aanvullende figuur 7. Overschakelen naar 12 V DC met Q5 (P Channel MOS FET) en leveren aan de kachel. Q5 is een schakelelement dat 12 V DC met PWM regelt om de hoeveelheid aan de verwarming geleverde voeding aan te passen.
Opmerking: het circuit bevat een LED om visueel te bevestigen dat de spanning wordt geleverd aan de kachel. Dit aandrijf signaal (HEATER_C) is een PWM-signaal van de CPU. Wanneer een oververhittings signaal wordt gedetecteerd door het beveiligingscircuit, schakelt het ONDERBREKER signaal naar laag en de werking van de MOS-FET stopt. Dit circuit is ondergebracht in de bedieningskast die wordt weergegeven in aanvullend figuur 8. - Maak een "connector circuit voor verwarmingseenheid" zoals weergegeven in aanvullende figuur 7. Installeer een USB-aansluiting voor aansluiting op het verwarmings gedeelte.
Opmerking: dit circuit is ondergebracht in de bedieningskast die wordt weergegeven in aanvullend figuur 8. - Bereid een "connector circuit voor temperatuursensor" zoals getoond in aanvullende figuur 7. Monteer de connector (Euroblock-contactdoos 2P) om de temperatuursensor aan te sluiten.
Opmerking: dit circuit is ondergebracht in de bedieningskast die wordt weergegeven in aanvullend figuur 8. - Gebruik voor een "A/D-converter" zoals weergegeven in aanvullende afbeelding 7, advertenties 1015 als een advertentie conversie-apparaat.
Opmerking: het conversieapparaat voor advertenties converteert de waarden van de temperatuursensor en de oververhitte detectie sensor van spanning naar digitale waarden. Dit is een 12-bits multiplexer AD conversie-apparaat en is verbonden met de CPU met de I2C-interface. Dit circuit is ondergebracht in de bedieningskast die wordt weergegeven in aanvullend figuur 8. - Maak een "Bescherm circuit" zoals weergegeven in aanvullend figuur 7 door het OHS-signaal (oververhitte detectie sensor) aan te sluiten op de inverterende ingang van de op-amp. Vergelijk dit signaal met de spanning van de trimmer weerstand aangesloten op de niet-inverterende ingang.
- Zorg ervoor dat wanneer de spanning lager wordt dan de spanning van de trimmer-weerstand, de uitgang van de OP-versterker gaat hoog, de aangesloten NPN transistor Q2 wordt ingeschakeld en het ONDERBREKER signaal gaat laag.
- Zorg ervoor dat op hetzelfde moment Q4 wordt ingeschakeld en de aangesloten oververhitterindicatorled D6 brandt.
Opmerking: dit circuit is ondergebracht in de bedieningskast die wordt weergegeven in aanvullend figuur 8.
- Voor een "display sectie" zoals getoond in aanvullende afbeelding 7, gebruik 192 x 64 dots voor OLED. Verbind met de CPU via de I2C-interface.
- Reset het OLED door het scheiden van de GND van het OLED door de CPU-signaal IO0 met behulp van een NPN transistor Q1 aangesloten op de GND van het OLED.
Let op: dit OLED toont verschillende soorten informatie. Dit circuit is ondergebracht in de bedieningskast die wordt weergegeven in aanvullend figuur 8.
- Reset het OLED door het scheiden van de GND van het OLED door de CPU-signaal IO0 met behulp van een NPN transistor Q1 aangesloten op de GND van het OLED.
- Voor een "LED & Rotary Encoder met push switch" in aanvullende figuur 7, Monteer een roterende encoder door soldeer die fungeert als een push-switch en bevat twee led's.
- Sluit een LED aan op VCC voor gebruik als een voedings-LED. De andere is aangesloten op de CPU voor gebruik als een indicator tijdens het verwarmen van de werking.
- Gebruik een push-switch contact voor verwarming START/STOP die is aangesloten op de CPU. Sluit de A-en B-uitgangen van de roterende encoder aan op de i/o-ingang die is ingesteld in de CPU-interrupt.
Opmerking: dit circuit is ondergebracht in de bedieningskast die wordt weergegeven in aanvullend figuur 8.
- Voor de CPU in aanvullende figuur 7, gebruik de CPU van wroom-02d.
- Uitvoer van IO12, IO13 naar de "display unit" omdat de interface van het display I2C-standaard is. Verbind IO0 met "display unit" en reset het OLED-scherm.
- Sluit IO15 aan op "Heater Control Unit" en bedien de voeding die door PWM-uitgang aan de kachel wordt geleverd.
- Verbind IO2 met "LED & Rotary Encoder met push switch" en licht de START LED. Verbind IO4 en IO14 met "LED & roterende Encoder met push-schakelaar" en ontvang de signalen (REA en REB) van de roterende encoder om de ingestelde temperatuur te bepalen. Verbind IO5 met "LED & roterende Encoder met push-schakelaar" en start/stop de verwarming.
3. overzicht van software-ontwerpen
- Gebruik Arduino CORE voor WROOM-02D voor de CPU als de controller voor dit systeem.
Opmerking: als invoerapparaten wordt de start/stop schakelaar, roterende encoder, temperatuursensor (thermistor) gebruikt. Als uitvoerapparaten worden een LED, Character display (OLED) en verwarming gebruikt. Het communicatieapparaat maakt gebruik van Wi-Fi. - Omtrek van de bewerking
- Detecteren van de werking van de roterende encoder zoals weergegeven in de LED & roterende Encoder met de push-schakelaar in aanvullende figuur 7, opslaan als de ingestelde temperatuur, en weer te geven op het OLED. Stel de ingangs terminal van de CPU waarop de fase terminals REA en REB zijn aangesloten als een interrupt ingangs Terminal en verwerken van de rotatie (vooruit en achteruit) van de roterende encoder door interrupt. Stel deze in op + 1 voor voorwaartse rotatie en-1 voor omgekeerde rotatie. Schrijf de ingestelde temperatuur op de globale variabele en gebruik deze voor de verwarmingstemperatuur regeling. Werk tegelijkertijd de ingestelde temperatuurweergave van het OLED-scherm bij.
- Identificeer start en stop door CPU IO 5 door start/stop-schakelaar (SW-S) zoals weergegeven in de CPU van aanvullende figuur 7. De status van de start/stop-schakelaar is een timer interruptproces van elke 50 MS.
Opmerking: aangezien de schakelaar een kortstondige schakelaar is, keert deze de toestand van start/stop terug wanneer deze wordt geduwd en losgelaten. Deze status wordt opgeslagen in de globale variabele. - Gebruik een thermistor voor de temperatuursensor. Lees de gemeten waarden van de monster sensor (zie "connector circuit voor verwarmings aansluiting" in aanvullende figuur 7) in de CPU na A/d-Converter (zie "A/d Converter" in aanvullende figuur 7). Levering van de stroom aan de kachel door het inschakelen van de IO15-poort in de "CPU" van aanvullende figuur 7.
Opmerking: er zijn twee soorten temperatuursensoren. Eén wordt gebruikt om de temperatuur van het monster te meten en de kachel op de ingestelde temperatuur te regelen, en de andere is bevestigd aan een kachel en wordt gebruikt voor hitte preventie. Verbind de thermistor met 3,3 V via een weerstand en noteer de verandering in weerstand als een verandering in spanning. Verwijder een ruis met de methode zwevend gemiddelde. - Gebruik een thermistor voor temperatuur preventie temperatuursensor. Oververhitte detectie wordt uitgevoerd met behulp van een thermistor (R2) ("connector circuit voor verwarmings aansluiting" in aanvullende figuur 7), en wanneer de ingestelde waarde wordt overschreden, wordt de verwarmings stroom uitgeschakeld ("Bescherm circuit" in aanvullende figuur 7).
Opmerking: deze sensor is opgenomen in een circuit en niet via de CPU. Deze sensor is onafhankelijk van de CPU en vergeleken met de weerstandswaarde ingesteld door de weerstand trimmer door een differentiële versterker op een analoge manier. Wanneer het detecteert dat de temperatuur de ingestelde waarde heeft overschreden, grijpt het in de FET-schakelaar, die de stroom op de kachel regelt en het huidige aanbod geforceerd stopt. Het doel is om te voorkomen dat de temperatuur van de kachel een bepaald niveau overschrijdt, zelfs in een situatie waarin de CPU niet goed werkt. - Schakel de LED in de "LED & roterende Encoder met push-schakelaar" van de aanvullende figuur 7 door de CPU (in de "CPU" van aanvullende figuur 7), wanneer de apparatuur in bedrijf is.
- Toon de ingestelde temperatuur en gemeten waarde in OLED in de "display sectie" van de aanvullende figuur 7 door de CPU (in de "CPU" van aanvullende figuur 7).
- Rijd de FET-schakelaar in het "verwarmings controlecircuit" van aanvullende figuur 7 met PWM van CPU om de verwarming te regelen.
- Bedien de verwarming met PID, op basis van de gemeten temperaturen die door de temperatuursensor zijn verkregen. Gebruik de Arduino pid_v1. h Library voor PID-verwerking.
Opmerking: de CPU kalibreert de tijd, communiceert met de server, verzendt gegevens en ontvangt instructies van de server. Wanneer de temperatuur van de sensor de ingestelde temperatuur overschrijdt, wordt de stroom naar de kachel ingesteld op 0 en wordt de overschrijding onderdrukt. - Gebruik de ingebouwde Wi-Fi-verbindingsfunctie van de CPU en maak verbinding met internet. Verzenden Stel de temperatuur, verwarmingstemperatuur, etc. in op de aangewezen server via Wi-Fi.
4. systeemconfiguratie
- Bouw het systeem volgens aanvullende figuur 9.
- Rust een WiFi-verbinding uit met de controller.
- Gebruik een thermistor als sensor voor temperatuurmeting. Sluit de thermistor draad aan op de "SENSOR"-aansluiting op de bedieningskast. Het door de thermistor gemeten temperatuur signaal ontvangen.
- Sluit een Microscoop-podium met de rubberen kachel en de "kachel" van de controller behuizing met een speciale kabel. Bedien de stroom naar de rubberen kachel.
- Verander de ingestelde temperatuur met de knop op de controller.
Opmerking: temperatuur logboek bewaking, temperatuur instelling kan op afstand worden bediend vanaf een PC of smartphone. - Breng de gemeten temperatuur, ingestelde temperatuur en tijd informatie over bij meting van de controller naar de server via het internet. De cyclusduur van de gegevens meting is 5 sec. en de cyclustijd voor gegevensoverdracht naar de server is 1 minuut.
- Open de server op gezette tijden vanaf de controller zijde en zet de meetgegevens die zijn opgeslagen in de CPU van de controller over naar de server voor analyse en grafieken.
- Raadpleeg het aanvullende materiaal voor het gebruik van de server.
5. ontwerp van de zijwaartse omgekeerde Microscoop
- Bevestig twee aluminium platen van 15 mm in dikte verticaal met schroeven om een basis steun te creëren.
- Bevestig een mal (één plaats) aan het horizontale deel van de basis steun.
- Plaats het deel van de Microscoop verticaal, bevestig de jigs (twee plaatsen) aan het verticale deel van de basis standaard en bevestig de onderkant van de Microscoop aan de basis stand.
- Bevestig de Microscoop fase met schroeven.
6. wijze van gebruik
Let op: hier is het gebruikte monster een mengsel van vet gemodificeerde basale zoet water nutriënt oplossing vloeibaar kweekmedium, natrium metasilicaat, vitaminen en steriel water. 800 μL van dit monster wordt verdund in 10 mL zoet water medium.
- Observatie methode
- Injecteer 1.000 μL van het bereide monster in een zelfgemaakte glazen kamer.
Let op: de zelfgemaakte glazen kamer regelt gelijktijdig twee Slide glazen en fixeert ze met een lijm. Een normale Petri schaal heeft een grote dikte en cellen ontsnappen in de diepte richting in de kamer, waardoor het moeilijk is om te observeren met een microscoop. Om dit te voorkomen, wordt de kamer met een kleine diepte richting gemaakt, wat het mogelijk maakt om te voorkomen dat de cellen in de diepte richting in de kamer kunnen ontsnappen. Een lage temperatuur afrekbaar epoxy harslijm wordt gebruikt om te Bond rond het glas om te voorkomen dat het monster te laten vallen uit de kamer. - Bevestig een apart voorbereide videocamera aan de Microscoop. Sluit een videocamera aan met de specifieke lens adapter van de Microscoop en schiet het monster.
- Gebruik een microscoop met een 10x oculair en 200x doel.
- Bevestig de verticale Microscoop fase aan een microscoop op vier locaties met 4 mm schroeven.
Opmerking: Zie aanvullende figuur 1a en aanvullende Figuur 2a voorontwerp tekeningen van aluminium platen. In dit experiment werd een omgekeerde Microscoop gebruikt. Dit werd gekanteld met 90 °, en de gefabriceerde Microscoop fase werd met schroeven bevestigd. Zie Figuur 1. - Bevestig het monster met twee elastiekjes met behulp van de vier klauwen die in de lengte zijn gemaakt. Plaats een monster op een Microscoop-fase loodrecht op het grondoppervlak.
- Stel de temperatuur in op 40 °C met de controller getoond in aanvullend figuur 8. Draai de controller knop om de temperatuur in te stellen. Controleer de ingestelde temperatuur op het display. Druk op de knop om de temperatuurregeling te starten en de blauwe LED gaat branden. Druk nogmaals op de knop om de LED uit te schakelen en de temperatuurregeling te stoppen.
Opmerking: de gemeten temperatuur wordt in real-time weergegeven en de verwarming wordt bestuurd om de ingestelde temperatuur te bereiken. Wanneer de temperatuurregeling begint, brandt de blauwe LED en blijft deze, terwijl de kachel in bedrijf is. Wanneer de verwarming oververhit raakt, worden de rode LED-lampjes en de verwarming automatisch gestopt. - Raadpleeg ' de bedieningshandleiding van de server ' in de aanvullende informatie voor de werking van de server.
Opmerking: een server voor gegevensopslag is vereist. De database van de server maakt gebruik van My-SQL.
- Injecteer 1.000 μL van het bereide monster in een zelfgemaakte glazen kamer.
7. meting van de oppervlaktetemperatuur verdeling van de rubberen kachel
- Meet de verdeling van de temperatuur van het rubberen verwarmingsoppervlak door thermografie om de temperatuur uniformiteit te controleren.
- Bevestig de Microscoop fase die een rubberen kachel met een statief heeft ingebouwd.
- Verander de instel temperatuur van het rubberen verwarmingsoppervlak tot 35 °C, 45 °C, 55 °C en 65 °C en meet door de thermografie vanaf de voorzijde (Zie aanvullende figuur 10).
8. temperatuur reactie test
- Start de temperatuurregeling door de bemonsterings temperatuur in te stellen op 30 °C. Wacht tot de meetwaarde 30 °C bereikt en stabiliseert. Verhoog de vooringestelde temperatuur stapsgewijs met 5 °C van 30 °C tot 50 °C en wacht tot de gemeten waarde stabiliseert na de respectieve vooraf ingestelde temperatuur.
- Verlaag de ingestelde temperatuur stapsgewijs met 5 °C van 50 °C tot 30 °C en Detecteer het traceer vermogen van de gemeten waarde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 toont de temperatuurverdeling van de rubberen kachel. De oppervlaktetemperatuur van de rubberen kachel was bij elke temperatuur uniform. Figuur 3 toont de responsiviteit van de gemeten temperatuur om temperatuurveranderingen in te stellen. De oranje lijn toont de ingestelde temperatuur en de blauwe lijn toont de verandering van de monstertemperatuur. De overschrijding van de gemeten waarde naar de instelling verandering is klein en de tracking is snel.
Diatoom cellen werden waargenomen om een specifiek voorbeeld te geven van het gebruik van dit apparaat. De traject analyse van bewegende diatoom cellen is een nuttige benadering om de beweeglijkheid van diatoom cellen te evalueren. Hoewel een normale omgekeerde Microscoop het monster horizontaal observeert, is het echter niet geschikt voor waarneming van de invloed van de zwaartekracht of zwevende beweging in de verticale richting.
In dit experiment werd de Microscoop fase met temperatuurregelaar bevestigd aan een omgekeerde Microscoop die 90 ° gedraaid was. Temperatuurafhankelijke verticale beweging van diatomen werd succesvol geregistreerd. Bij deze methode werd de Locus van de verticale beweging van diatomen gedetecteerd, zoals weergegeven in Figuur 4. Als gevolg van het observeren met 100 individuen van diatomen, was de gemiddelde snelheid 7,01 μm/s bij kamertemperatuur en 470,1 μm/s bij 40 °C. De effecten van thermische convectie op het verticale zwevende fenomeen van diatoom cellen werden gevisualiseerd door directe observatie.
Figuur 1: foto van het apparaat bevestigd aan de Microscoop fase. Het uiterlijk van het apparaat dat aan de Microscoop-fase is bevestigd. Het apparaat is bevestigd aan de Microscoop-fase met vier schroeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: temperatuurverdeling van de rubberen kachel. De verdeling van de rubberen kachel zoals gemeten door thermografie. De temperatuur van de verwarming werd stapsgewijs gewijzigd van omgevingstemperatuur tot 35 °C, 45 °C, 55 °C en 65 °C. De temperatuur werd gelijkmatig verdeeld over de verwarming bij elke temperatuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: responsiviteit van het temperatuur signaal. Dit toont het antwoord wanneer de ingestelde temperatuur wordt verhoogd van 30 °C tot 50 °C en verlaagd van 50 °C tot 30 °C. De ingestelde temperatuur werd in stappen van 5 °C veranderd. In de stabiele toestand ligt de gemeten temperatuur binnen ± 1,5 °C van de ingestelde waarde. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: de Locus van de diatoom beweging. De verticale trajecten van diatoom beweging als gevolg van temperatuurveranderingen zijn uitgezet. De blauwe lijnen tonen trajecten van diatoom cellen bij 25 °C voor 27,06 s en bij 40 °C voor 0,2 s. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: ontwerp tekening van aluminium platen (met afmetingen). A) de plaat is 2 mm dik x 150 mm breed x 200 mm lang, met een gecentreerd gat van 101 mm diameter om de rubberen kachel te kunnen inbrengen. Elke plaatrand heeft twee bewerkte klauwen waaraan elastiekjes kunnen worden bevestigd om monsters op het podium te zetten. Om deze verticale fase aan een microscoop met 4 mm schroeven te bevestigen, worden 4,2 mm schroefgaten geboord op vier locaties symmetrisch rond het centrale gat. B) de plaat is 5 mm dik x 150 mm breed x 200 mm lang, met een gecentreerd gat van 130 mm diameter. Machine notch locaties om klauw locaties op de Forefront Plate aan te passen, zodat de rubberen banden in het podium kunnen worden gehesen. Voor de bevestiging van het podium op een microscoop worden vier 4,2 mm schroefgaten geboord in bijpassende locaties aan die in de voorhoede plaat. C) de plaat is 4 mm dik x 150 mm breed x 200 mm lang, met een gecentreerd gat van 130 mm diameter. Een 30 mm spanwijdte wordt afgesneden van het midden van het rechter 200 mm gezicht van de plaat, tot de diepte van het centrale gat. Dit doel van de cut-out is om bevestiging van de kachel aansluiting aan de rechterkant toe te staan. In dezelfde posities als in de voorste plaat worden vier 4,2 mm schroefgaten geboord voor bevestiging van het podium aan een microscoop. D) de plaat is 1,5 mm dik x 150 mm breed x 200 mm lang, met een gecentreerd gat van 30 mm diameter. In dezelfde posities als in de voorste plaat worden vier 4,2 mm schroefgaten geboord voor bevestiging van het podium aan een microscoop. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 2: ontwerp tekening van aluminium platen (zonder afmetingen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 3: ontwerp tekening van aluminium sokkels. (A) aan de bovenzijde te installeren: diameter is 100 mm, dikte is 3 mm. Een gat van 30 mm diameter wordt geboord in het midden en een uitsparing van 42 mm breedte x 30 mm diepte wordt aan één kant gemaakt. (B) te installeren aan de onderzijde: diameter is 100 mm, dikte is 4 mm. Een gat van 30 mm diameter wordt geboord in het midden, en drie 3 mm gaten zijn geplaatst op 120 ° aan elkaar op een afstand van 25 mm van het centrum. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 4: ontwerp tekening van geperste kurk schijven. A) op de bovenzijde tussen de siliconen rubberen kachel en de bovenste aluminium voetstuk worden geïnstalleerd: diameter is 100 mm, dikte is 2 mm. Een gat van 20 mm diameter wordt geboord in het midden, en twee sneden (42 mm breed x 30 mm diep, 4 mm breed x 40 mm) worden met rechte hoeken aan elkaar gemaakt in zijkanten van de schijf. B) aan de onderzijde tussen de siliconen rubberen kachel en de onderste aluminium voetstuk worden geïnstalleerd: diameter is 100 mm, dikte is 1 mm. Een gat van 20 mm diameter wordt geboord in het midden. C) deze steun is 42 mm breed × 30 mm diep en wordt gesneden uit de omtrek van een schijf met een diameter van 100 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 5: specificatie van silicone rubberen kachel. De diameter is 100 mm en de dikte is 2,5 mm. Een gat van 20 mm diameter wordt geboord in het midden. De voeding is 12 V, met een laadcapaciteit van 18 W. De kachel bestaat uit Nichrome draad, met een lood draad aangesloten op de elektrode. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 6: dwarsdoorsnede van de Microscoop fase. Dit is een sectionele weergave van de Microscoop fase. De aluminium voetstuk is bevestigd aan de achterzijde aluminium plaat en de rubberen kachel is geïnstalleerd op het buitenste oppervlak. De geperste kurk is geïnstalleerd voor isolatie tussen de rubberen kachel en het aluminium onderstel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 7: Details van het schakelschema. Dit geeft het circuit aan dat in de controller is ingebouwd. Het schakelschema is onderverdeeld in negen delen volgens individuele functies. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 8: ontwerp tekening van kunststof controller case. Afmetingen zijn 143,9 mm lengte x 85,3 mm diepte x 25 mm breedte. De temperatuur instelknop, het bedrijfs-/oververhittinglampje en de indicator bevinden zich op de behuizing van de plastic controller. De temperatuur kan worden ingesteld tijdens het kijken naar de indicator door de set-knop te draaien. Door deze knop te duwen start u de temperatuurregelaar. De gemeten temperatuur wordt in real-time weergegeven en de verwarming wordt gecontroleerd zodat deze de ingestelde temperatuur bereikt en vasthoudt. Wanneer de temperatuurregelaar is ingeschakeld, brandt de blauwe LED en blijft deze verlicht terwijl de verwarming in bedrijf is. Wanneer de verwarming oververhit raakt, gaat de rode LED aan en stopt de verwarming automatisch. Als u nogmaals op de temperatuurregelaar drukt, wordt de knop gestopt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 9: systeemconfiguratie. De Microscoop-fase met een ingebouwde controller is aangesloten op een rubberen kachel met een speciale kabel. Gemeten monstertemperatuur signalen worden ontvangen en de stroom naar de rubberen kachel wordt door de controller overgebracht. Gemeten signalen van de controller worden via de Internet router draadloos naar de server verzonden. De server compileert meetgegevens voor analyse en grafieken. Temperatuur logboek bewaking en temperatuurinstellingen kunnen op afstand worden bediend via een PC of smartphone. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 10: temperatuur verdelings meting door thermografie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Traject analyse van bewegende diatoom cellen is een nuttige benadering voor het evalueren van de beweeglijkheid van de diatoom. Echter, terwijl een normale omgekeerde Microscoop monsters horizontaal observeert, is het niet geschikt voor observaties van de invloed van de zwaartekracht of zwevende beweging in de verticale richting. Hier ontwikkeld en beschreven is een verticale Microscoop fase met temperatuurregeling en bevestigd aan een omgekeerde Microscoop, die is geroteerd door 90 °. Deze Microscoop fase met temperatuurregeling maakt observatie van temperatuurafhankelijke verticale beweging van diatoom cellen mogelijk.
Een kritieke stap binnen het protocol is het ontwerp van de controller circuit. Om de veiligheid te waarborgen werd een onderbreker schakeling uitgevoerd. Wanneer de sensor is losgekoppeld van het monster of de Microcontroller niet goed functioneert, wordt de stroom naar de kachel afgesneden door een ander circuit dan de microcontroller.
Omdat het besturingssysteem het PID-systeem heeft aangenomen om de stroom van de kachel te regelen, is een techniek vereist om de optimale parameter van de PID te vinden. In vergelijking met de bestaande methode zijn externe bediening en bewaking mogelijk via Wi-Fi-functie, gegevensverzameling op een server en de functie voor temperatuur instelling. Omdat de structuur van het stage-deel dat aan de Microscoop is gekoppeld ingewikkeld is, rechtvaardigt de vereenvoudiging van deze structuur een toekomstig onderzoek.
Deze apparatuur gebruikt een kachel om de temperatuur te verhogen, maar koeling wordt niet aangedreven; Daarom kan de ingestelde temperatuur niet onder kamertemperatuur liggen. Voor het koelen van monsters tot temperaturen lager dan kamertemperatuur is een ingewikkeld koelapparaat nodig, dat wordt overwogen voor toekomstig werk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten om te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30? | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A - MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W.
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM - selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields - A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A.
- Edgar, L. A.
- Edgar, L. A.
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates - potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion - An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
