Summary
Præsenteret her er en protokol ved hjælp af en temperatur-kontrollerede mikroskop fase, der gør det muligt at montere en prøve container på et vertikalt mikroskop.
Abstract
Prøverne anbringes normalt på et horisontalt mikroskop stadie for mikroskopisk observation. Men for at observere indflydelsen af tyngdekraften på en prøve eller studere flydende adfærd, er det nødvendigt at gøre mikroskopet etape lodret. For at opnå dette, en sidelæns inverteret mikroskop vippes af 90 ° er blevet udtænkt. For at observere prøver med dette mikroskop skal prøvebeholdere som Petri skåle eller glas skred fastgøres til scenen lodret. En anordning, der kan sikre prøvebeholdere på plads på et vertikalt mikroskop stadie, er udviklet og beskrevet her. Fastgørelse af denne enhed til scenen tillader observation af prøve dynamik i det lodrette plan. Evnen til at regulere temperaturen ved hjælp af en silikone gummi varmer også tillader observation af temperaturafhængige prøve adfærd. Desuden overføres temperaturdataene til en Internet Server. Temperaturindstillinger og logovervågning kan fjernstyres fra en PC eller smartphone.
Introduction
Optisk mikroskopi er en teknik, der anvendes til at øge observerbare detaljer via forstørrelse af en prøve med linser og synligt lys. I Optisk mikroskopi, lys er rettet ind på en prøve, derefter transmitteres, afspejles, eller fluorescerende lys er fanget af Forstørrelsesglas linser til observation. Forskellige typer af mikroskop er tilgængelige, der adskiller sig i design til at rumme forskellige anvendelser og observation metoder. De forskellige designs omfatter et opretstående mikroskop, som er struktureret til at belyse en prøve nedefra for observation ovenfra og et inverteret mikroskop, som belyser prøven ovenfra for observation nedefra. Opretstående mikroskoper er den mest almindeligt og udbredte design. Inverterede mikroskoper bruges ofte til at observere prøver, der ikke kan tillade en linse tæt på afstand fra oven, såsom dyrkede celler klædes til bunden af en container. Mange forskergrupper har rapporteret observationer på en lang række områder ved hjælp af inverterede mikroskoper1,2,3,4,5,6,7. Mange ekstra enheder er også blevet udviklet, der udnytter funktionerne i inverterede mikroskoper8,9,10,11,12,13 .
I øjeblikket er mikroskop stadiet i alle konventionelle mikroskop konstruktioner vandret og er derfor uegnet til observation af prøver, der producerer bevægelse i det lodrette plan (på grund af tyngdekraft, flydeevne, bevægelse osv.). For at gøre disse observationer mulige, skal mikroskop scenen og lysstien drejes til lodret. Den lodrette fase er forpligtet til lodret montere glas skred eller prøvebeholdere såsom en Petri skåle til scenen. For at løse dette, en sidelæns inverteret mikroskop vippes af 90 ° er allerede blevet udtænkt. Fastgørelse af prøver med tape eller andre klæbemidler giver dog ikke den nødvendige langvarige immobilitet. Beskrevet her er en anordning, der kan opnå den nødvendige stabilitet. Denne anordning tillader observation over tid af prøve bevægelse i det lodrette plan. Montering af en silikone gummi varmer har også gjort det muligt at observere indflydelsen af temperatur variation på prøve adfærd. Temperatur data overføres til en Internet Server via Wi-Fi, og temperaturindstillinger og logovervågning kan fjernstyres fra en PC eller smartphone. Til vores viden, er scenen knyttet til en sidelæns vippes mikroskop vippes af 90 ° endnu ikke blevet rapporteret i tidligere undersøgelser.
Mikroskop scenen består af tre aluminiumsplader. Den midterste aluminiumsplade er monteret på den nederste aluminiumsplade, der bindes til scenen. Silikone gummiet, der indeholder temperatursensoren, er fastgjort mellem de midterste og øvre aluminiumsplader. Gummibånd anvendes til at anbringe prøven. Kløer er fastgjort i venstre og højre fire punkter i den øvre aluminiumsplade for at sikre gummibåndene. Temperatur regulatorens kontrolkredsløb modtager et signal fra Temperaturføleren indlejret i silikone gummi og modulerer elektrisk strøm ved at metoden Pulse width modulation (PWM). Temperaturen kan gradvist øges til 50 °C i intervaller på 1 °C. Denne enhed er nyttig til applikationer, hvor lodrette prøve bevægelser kan være temperaturafhængige.
Denne rapport giver eksempler på temperatur effekter på det flydende fænomen af diatomer. Som eksempler på Diatom observation undersøgelser, målinger af sedimentering hastighed af celle klynger, motion analyser, ultrafine strukturundersøgelser, etc. er blevet rapporteret14,15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. den specifikke tyngdekraft af diatomer flyder i vand med fotosyntetiske organismer er lidt højere end for vand, så de har tendens til at synke; Men, de vil stige, hvis selv let konvektion er forekommende. For at studere dette fænomen, er en glas slide anbringes lodret til et mikroskop fase, og virkningerne af stigende temperatur på Diatom lodrette bevægelse observeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design
- Fabrikation af aluminiumsplader
- Skær et 101 mm hul i midten af en aluminiumsplade af dimensioner 150 mm x 200 mm x 2 mm, der skal bruges som forkant plade med en laser forarbejdnings maskine. Maskin kløer på otte punkter for at anbringe to gummibånd på tværs af længden, eller to på tværs af bredden af denne plade (Se supplerende figur 1a og supplerende figur 2a).
- Skær et 130 mm hul i midten af en anden 150 mm x 200 mm x 5 mm aluminiumsplade, der skal bruges som den midterste øverste plade med en laser forarbejdnings maskine. Maskine otte hak til fastgørelse af elastikker på to punkter på tværs af længden, eller to på tværs af bredden af denne plade (Se supplerende figur 1b og supplerende figur 2b).
- Skær et 130 mm hul i midten af en 150 mm x 200 mm x 4 mm aluminiumsplade, der skal bruges som den midterste nedre plade med en laser forarbejdnings maskine (Se supplerende figur 1c og supplerende figur 2c).
- Skær et 30 mm hul i midten af en 150 mm x 200 mm x 1,5 mm aluminiumsplade, der skal bruges som bundplade (Se supplerende figur 1d og supplerende figur 2D).
- Fabrikation af to aluminiums piedestal
- Skær et 30 mm hul i midten af aluminiumspladen (100 mm diameter, 3 mm tykkelse) og lav et hak fra den ene side med dimensionerne 42 mm bred x 30 mm dyb (Se supplerende figur 3a).
- Skær et 30 mm hul i midten af pladen i en aluminiumsplade (100 mm diameter, 4 mm tykkelse) og bore tre 3 mm huller placeret 25 mm fra midten, fordelt 120 ° fra hinanden (Se supplerende figur 3b).
- Fabrikation af tre pressede kork skiver
- Skær et 20 mm hul i midten af den pressede kork Skive (100 mm diameter, 2 mm tykkelse) med en vandstråle skæremaskine. Lav et snit 42 mm på tværs af x 30 mm dyb, så en skåret 4 mm bred x 5 mm dyb (Se supplerende figur 4a).
- Skær et 20 mm hul i midten af den pressede kork skive af dimensioner 100 mm diameter, 1 mm tykkelse med en vandstråle skæremaskine. Lav en udskæring 42 mm på tværs af x 30 mm dyb, en skåret 4 mm bred x 40 mm dyb (Se supplerende figur 4b).
- Skær en presset kork plade fra en 100 mm diameter skive med en 42 mm bredde og 30 mm dybde. Der kræves to ark med en tykkelse på 1 mm og et ark med en tykkelse på 2 mm (Se supplerende figur 4c).
- Fabrikation af silikone gummi varmer
- Fabrikere et varmelegeme ved hjælp af en 100 mm diameter skive 2,5 mm tyk silicium gummi med indbygget Nikrom ledning og skær et 20 mm hul i midten af skiven (Se supplerende figur 5).
- Saml de dele, der er beskrevet i trin 1.1 – 1.4, ved at stable dem som vist i supplerende figur 6.
- Hvis du vil konstruere et mikroskop stadie, skal du se supplerende figur 6, tværsnit af mikroskopet. Fix
og 
derefter 
og 
med skruer. Fix og 
med skruer. Fix og , 
og , 
og, og og og 
med klæbemiddel. 
og 
derefter 
og 
med skruer. Fix 
med skruer. Fix 
og 
med klæbemiddel. 
2. skitse til hardware design
- Forbered en "strømforsyning og programmering kredsløb" som vist i supplerende figur 7. Levering 12 V DC til varmelegeme controlleren fra J4 terminalen tilsluttet vekselstrømsadapteren. Reducer spændingen fra 12 V DC til 3,3 V DC for kredsløbs strømforsyningen ved hjælp af en regulator, fordi CPU-forsyningsspændingen er 3,3 V DC.
Bemærk: USB 1 er en Terminal til 5 V DC og seriel signal af udvikling PC. Selvom 5 V DC ikke er afgørende, bruges den som strømkilde til at programmere CPU'en. Dette er også konverteret til 3,3 V DC af regulatoren. J1 er en kontrolsignal Terminal på tidspunktet for programmeringen. Dette kredsløb er anbragt i controlleren tilfælde vist i supplerende figur 8. - Forbered et "radiator kontrolkredsløb" som vist i supplerende figur 7. Skift til 12 V DC med Q5 (P Channel MOS FET), og Indstil det til varmelegemet. Q5 er et koblings element, som styrer 12 V DC med PWM for at justere den mængde strøm, der tilføres varmeapparatet.
Bemærk: kredsløbet indeholder en lysdiode til visuelt at bekræfte, at spændingen er ved at blive leveret til varmelegeme. Dette drev signal (HEATER_C) er et PWM-signal fra CPU'en. Når et overophednings signal registreres af beskyttelseskredsløbet, skifter afbryder signalet til lavt, og driften af MOS-FET standser. Dette kredsløb er anbragt i controlleren tilfælde vist i supplerende figur 8. - Forbered et "tilslutningskredsløb til varmelegeme" som vist i supplerende figur 7. Installer et USB-stik til tilslutning til afsnittet varmelegeme.
Bemærk: dette kredsløb er anbragt i controlleren tilfælde vist i supplerende figur 8. - Forbered et "tilslutningskredsløb til temperatursensor" som vist i supplerende figur 7. Monter stikket (Euroblock-beholderen 2P) for at tilslutte temperatursensoren.
Bemærk: dette kredsløb er anbragt i controlleren tilfælde vist i supplerende figur 8. - For en "A/D-Konverter" som vist i supplerende figur 7skal du bruge ads 1015 som en annonce konverteringsenhed.
Bemærk: annonce konverteringsenheden konverterer værdierne af temperatursensoren og overophedningsanvisnings sensoren fra spænding til digitale værdier. Dette er en 12-bit multiplexer annonce konverteringsenhed og er forbundet til CPU'en med I2C-grænsefladen. Dette kredsløb er anbragt i controlleren tilfælde vist i supplerende figur 8. - Lav en "Beskyt kredsløb" som vist i supplerende figur 7 ved at tilslutte overophede Detection sensor (OHS) signal til den inverterende indgang på op amp. Sammenlign dette signal med den spænding, som trimmer-modstanden har forbundet med den ikke-inverterende indgang.
- Sørg for, at når spændingen bliver lavere end spændingen på trimmer-modstanden, går OP-forstærkeren højt, den tilsluttede NPN transistor Q2 tændes, og afbryder signalet går lavt.
- Sørg for, at Q4 tændes på samme tid, og at den tilsluttede overophedede indikator LED D6 lyser.
Bemærk: dette kredsløb er anbragt i controlleren tilfælde vist i supplerende figur 8.
- For en "display sektion" som vist i supplerende figur 7, brug 192 x 64 PRIKKER til OLED. Forbind med CPU'en via I2C-grænsefladen.
- Nulstil OLED ved at adskille GND af OLED ved CPU-signalet IO0 ved hjælp af en NPN transistor Q1 forbundet til GND af OLED.
Bemærk: denne OLED viser forskellige typer af information. Dette kredsløb er anbragt i controlleren tilfælde vist i supplerende figur 8.
- Nulstil OLED ved at adskille GND af OLED ved CPU-signalet IO0 ved hjælp af en NPN transistor Q1 forbundet til GND af OLED.
- For en "LED & roterende encoder med push-switch" i supplerende figur 7, Monter en rotations encoder ved lodde, der fungerer som en trykafbryder og inkorporerer to lysdioder.
- Tilslut en lysdiode til VCC til brug som strøm lysdiode. Den anden er forbundet til CPU til brug som en indikator under varmelegeme drift.
- Brug en push switch kontakt til varmelegeme START/STOP, der er tilsluttet CPU. Tilslut A-og B-udgangene på rotations koderen til IO-indgangs sættet i CPU-interrupt.
Bemærk: dette kredsløb er anbragt i controlleren tilfælde vist i supplerende figur 8.
- For CPU i supplerende figur 7, bruge CPU af wroom-02d.
- Output fra IO12, IO13 til "displayenhed", fordi grænsefladen af displayet er I2C standard. Forbind IO0 til "display Unit" og Nulstil OLED.
- Tilslut IO15 til "radiator Control Unit" og styre den strøm, der leveres til varmelegeme ved PWM udgang.
- Tilslut IO2 til "LED & roterende encoder med push-switch", og tænd for START-LED'en. Tilslut IO4 og IO14 til "LED & roterende encoder med push-switch", og modtag signalerne (REA og REB) fra rotations koderen for at bestemme den indstillede temperatur. Tilslut IO5 til "LED & roterende encoder med push switch" og start/stop varmelegeme.
3. skitse til software design
- Brug Arduino CORE til WROOM-02D til CPU'en som controller til dette system.
Bemærk: som inputenheder anvendes start/stop-kontakten, roterende encoder, temperatursensor (thermistor). Som output-enheder, en LED, tegndisplay (OLED), og varmelegeme anvendes. Kommunikationsenheden bruger Wi-Fi. - Disposition for operationen
- Detektér drejekoderen som vist i LED-& roterende encoder med push-kontakten i supplerende figur 7, Opbevar den som den indstillede temperatur, og Vis den på OLED. Indstil indgangsterminalen for den CPU, som fase terminalerne REA og REB er tilsluttet som en interrupt-indgangsterminal, og Behandl rotationen (frem og tilbage) af rotations koderen ved afbrydelse. Indstil den til + 1 for forlæns rotation og-1 for omvendt rotation. Skriv den indstillede temperatur til den globale variabel og bruge den til varmelegeme temperaturkontrol. På samme tid, opdatere den indstillede temperaturvisning af OLED.
- Identificer start og stop ved CPU IO 5 ved start/stop switch (SW-S) som vist i CPU af supplerende figur 7. Tilstanden af start/stop-kontakten er en timer interrupt-proces hver 50 MS.
Bemærk: da kontakten er en momentan switch, vender den tilstand af start/stop, når den er skubbet og frigivet. Denne tilstand er gemt i den globale variabel. - Brug en termistor til Temperaturføleren. Læs de målte værdier fra prøve sensoren (Se "tilslutningskredsløb for tilslutning af varmelegeme" i supplerende figur 7) i CPU'en efter A/d-konverteren (Se "a/d-Konverter" i supplerende figur 7). Levere strømmen til varmelegeme ved at tænde for IO15 port i "CPU" af supplerende figur 7.
Bemærk: der er to typer temperatursensorer. Den ene bruges til at måle temperaturen af prøven og styre varmelegeme på den indstillede temperatur, og den anden er fastgjort til et varmelegeme og bruges til varme forebyggelse. Tilslut termistor til 3,3 V via en modstand og registrere ændringen i resistens som en ændring i spænding. Fjern en støj med den glidende gennemsnit-metode. - Brug en termistor til temperatur forebyggelse temperatursensor. Overophednings detektering udføres ved hjælp af en termistor (R2) ("tilslutnings kreds til tilslutning af varmelegeme" i supplerende figur 7), og når den indstillede værdi overskrides, slukkes varmelegeme strømmen ("Beskyt kredsløb" i supplerende figur 7).
Bemærk: denne sensor er indarbejdet i et kredsløb og ikke gennem CPU'en. Denne sensor er uafhængig af CPU'en og sammenlignes med den modstandsværdi, der er indstillet af modstand trimmer af en differentialforstærker på en analog måde. Når den opdager, at temperaturen har overskredet den indstillede værdi, griber den ind i FET-kontakten, som styrer strømmen til varmelegemet og med magt standser den aktuelle forsyning. Formålet er at forhindre temperaturen af varmelegeme fra at overskride et vist niveau selv i en situation, hvor CPU'en ikke fungerer korrekt. - Tænd for LED-indikatoren i "LED & Rotary encoder with push switch" i det supplerende figur 7 af CPU'en (i "CPU'en" i det supplerende figur 7), når udstyret er i drift.
- Vis den indstillede temperatur og målte værdi til OLED i "display sektion" af den supplerende figur 7 af CPU (i "CPU" af supplerende figur 7).
- Kør FET-kontakten i "radiator Control Circuit" i supplerende figur 7 med PWM fra CPU til styring af varmelegeme.
- Kontrol af varmelegeme ved PID, baseret på målte temperaturer erhvervet af Temperaturføleren. Brug Arduinos pid_v1. h-bibliotek til PID-behandling.
Bemærk: CPU'en kalibrerer tiden, kommunikerer med serveren, overfører data og modtager instruktioner fra serveren. Når sensor temperaturen overskrider den indstillede temperatur, indstilles strømmen til varmelegemet til 0, og overskuddet undertrykkes. - Brug den indbyggede Wi-Fi-forbindelsesfunktion i CPU'en, og Opret forbindelse til internettet. Sende indstille temperatur, varmelegeme temperatur, etc. til den udpegede server ved Wi-Fi.
4. system konfiguration
- Byg systemet i henhold til supplerende figur 9.
- Udstyre en Wi-Fi med controlleren.
- Brug en termistor som sensor til temperaturmåling. Tilslut termistor-ledningen til "sensor"-terminalen på controller-etuiet. Modtage det temperatur signal, som er målt ved thermistor.
- Tilslut et mikroskop stadie, der inkorporerer gummi varmer og "varmer" af controller-etuiet med et dedikeret kabel. Styr strømmen til gummi varmer.
- Skift den indstillede temperatur med knappen på controlleren.
Bemærk: overvågning af temperaturloggen, temperaturindstilling kan fjernbetjenes fra en PC eller smartphone. - Overfør den målte temperatur, den indstillede temperatur og tidsoplysningerne ved målingen fra controlleren til serveren via internettet. Data målings cyklussens tid er 5 s og cyklustid for dataoverførsel til serveren er 1 min.
- Få adgang til serveren fra controlleren side med jævne mellemrum og overføre måledata lagret i CPU af controlleren til serveren til analyse og graftegning.
- Se det supplerende materiale for, hvordan du betjener serveren.
5. design af sidelæns inverteret mikroskop
- Fastgør to aluminiumsplader med en tykkelse på 15 mm lodret med skruer for at skabe et grundlæggende beslag.
- Fastgør en Jig (ét sted) til den vandrette del af bund holderen.
- Placer mikroskopet fase lodret, fastgør jigs (to steder) til den lodrette del af basen stativ og fastgør bunden af mikroskopet til basen stativ.
- Fastgør mikroskop stadiet med skruer.
6. driftsmåde
Bemærk: her er den anvendte prøve en blanding af fed modificeret basal ferskvands Næringsstofopløsning flydende kulturmedium, natriummetasilicat, vitaminer og sterilt vand. 800 μL af denne prøve fortyndes i 10 mL ferskvand medium.
- Observations metode
- 1.000 μL af den forberedte prøve indsprøjtes i et selv lavet glas kammer.
Bemærk: det selv lavede glas kammer arrangerer to glide briller parallelt og løser dem med et klæbemiddel. En normal Petri skål har en stor tykkelse og celler undslippe i dybden retning i kammeret, hvilket gør det vanskeligt at observere med et mikroskop. For at forhindre dette, er kammeret med en lille dybde retning lavet, hvilket gør det muligt at forhindre cellerne i at undslippe i dybden retning i kammeret. En lavtemperaturs helbredelig epoxyharpiks lim bruges til at binde rundt om glasset for at forhindre, at prøven falder fra kammeret. - Vedhæft et separat forberedt videokamera til mikroskopet. Tilslut et videokamera ved hjælp af mikroskopens dedikerede linse adapter og skyd prøven.
- Brug et mikroskop med et 10x okular og 200x mål.
- Fastgør det lodrette mikroskop stadie til et mikroskop på fire steder med 4 mm skruer.
Bemærk: Se supplerende figur 1a og supplerende figur 2a for design tegninger af aluminiumsplader. I dette eksperiment blev der anvendt et inverteret mikroskop. Dette blev vippes af 90 °, og den fabrikerede mikroskop fase blev fastgjort med skruer. Se figur 1. - Fastgør prøven med to gummibånd ved hjælp af de fire kløer, der er gjort i længderetningen. Anbring en prøve på et mikroskop trin vinkelret på jordoverfladen.
- Indstil temperaturen til 40 °C med controlleren vist i supplerende figur 8. Drej på controller knappen for at indstille temperaturen. Kontroller den indstillede temperatur på displayet. Tryk på knappen for at starte temperaturstyringen, og den blå lysdiode lyser. Tryk på knappen igen for at slukke for LED-og stop temperaturstyringen.
Bemærk: den målte temperatur vises i realtid, og varmelegemet styres for at nå den indstillede temperatur. Når temperaturstyringen starter, lyser den blå LED op og forbliver så, mens varmeapparatet er i drift. Når varmelegeme overophedet, den røde LED lyser, og varmelegeme automatisk stopper. - Se "betjeningsvejledningen til serveren" i de supplerende oplysninger til serverdrift.
Bemærk: der kræves en server til datalagring. Serverens database bruger My-SQL.
- 1.000 μL af den forberedte prøve indsprøjtes i et selv lavet glas kammer.
7. måling af overfladetemperatur fordeling af gummi varmer
- Mål fordelingen af gummi varmer overfladetemperatur ved termo grafi for at kontrollere temperaturen ensartethed.
- Fastgør mikroskopet scenen, der inkorporerede en gummi varmer med en stativ.
- Skift indstillings temperaturen på overfladen af gummi varmer til 35 °C, 45 °C, 55 °C og 65 °C, og mål med termo grafien forfra (Se supplerende figur 10).
8. test af temperatur respons
- Start temperaturstyring ved at indstille prøvens indstillede temperatur til 30 °C. Vent, indtil måle værdien når 30 °C og stabiliserer sig. Forøg den forudindstillede temperatur trinvis med 5 °C fra 30 °C til 50 °C, og vent, indtil den målte værdi stabiliserer sig efter den respektive forudindstillede temperatur.
- Den forudindstillede temperatur nedsættes med 5 °C fra 50 °C til 30 °C, og den målte værdi detekterer sporings evnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 viser temperaturfordelingen af gummi varmer. Overfladetemperaturen af gummi varmeren var ensartet ved hver temperatur. Figur 3 viser reaktionstemperaturen for den målte temperatur for at indstille temperaturændringer. Den orange linje viser den indstillede temperatur og blå linje viser ændringen af prøvetemperaturen. Overskuddet af den målte værdi til indstillingen ændring er lille, og sporing er hurtig.
Diatom celler blev observeret for at give et specifikt eksempel på brugen af denne enhed. Den forløbs analyse af bevægelige Diatom celler er en nyttig tilgang til at evaluere motilitet af Diatom celler. Men selv om et normalt inverteret mikroskop observerer prøven horisontalt, er den ikke egnet til observation af tyngdekraften eller den flydende bevægelse i den lodrette retning.
I dette eksperiment blev mikroskop stadiet med temperaturregulator fastgjort til et inverteret mikroskop, som var blevet drejet 90 °. Temperaturafhængig vertikal bevægelse af diatomer blev registreret med succes. Med denne metode, locus af lodrette bevægelse af diatomer blev detekteret som vist i figur 4. Som et resultat af observation med 100 individer af diatomer, den gennemsnitlige hastighed var 7,01 μm/s ved stuetemperatur og 470,1 μm/s ved 40 °C. Virkningerne af termisk konvektion på det lodrette flydende fænomen af Diatom celler blev visualiseret ved direkte observation.
Figur 1: fotografi af den enhed, som er fastgjort til mikroskop stadiet. Enhedens udseende, som er fastgjort til mikroskop stadiet. Enheden er fastgjort til mikroskop scenen med fire skruer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: temperaturfordeling af gummi varmer. Fordelingen af gummi varmer som målt ved termo grafi. Varmelegeme temperaturen blev ændret trinvise fra omgivende temperatur til 35 °C, 45 °C, 55 °C og 65 °C. Temperaturen blev jævnt fordelt over varmelegemet ved hver temperatur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: temperatur signalets reaktionsevne. Dette viser reaktionen, når den indstillede temperatur hæves fra 30 °C til 50 °C og sænkes fra 50 °C til 30 °C. Den indstillede temperatur blev ændret i intervaller på 5 °C. I stald tilstand er den målte temperatur inden for ± 1,5 °C af den indstillede værdi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Lokus af Diatom bevægelse. De lodrette forløbskurver for Diatom bevægelse på grund af temperaturændringer er plottet. De blå linjer viser Diatom-cellernes forløbskurver ved 25 °C for 27,06 s og ved 40 °C for 0,2 s. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: design tegning af aluminiumsplader (med dimensioner). (A) pladen er 2 mm tyk x 150 mm bred x 200 mm lang, med et centreret 101 mm diameter hul for at tillade indsættelse af gummi varmer. Hver plade kant har to bearbejdede kløer, som der kan fastgøres gummibånd til for at sikre prøverne på scenen. For at fastgøre denne lodrette fase til et mikroskop med 4 mm skruer, er 4,2 mm skruehuller boret på fire steder symmetrisk omkring det centrale hul. (B) pladen er 5 mm tyk x 150 mm bred x 200 mm lang, med en centreret 130 mm diameter hul. Maskin indhak steder til at matche klolokationer på Forefront Plate at tillade fastgørelse af prøve-sikring gummibånd på tværs af scenen. Til fastgørelse af scenen til et mikroskop, er fire 4,2 mm skruehuller boret i matchende steder til dem i forkant pladen. (C) pladen er 4 mm tyk x 150 mm bred x 200 mm lang, med en centreret 130 mm diameter hul. En 30 mm span skæres ud af midten af højre 200 mm forsiden af pladen, til dybden af det centrale hul. Dette formål med udskæring er at tillade fastgørelse af varmelegeme stikket på højre side. I de samme positioner som i forkant pladen, er fire 4,2 mm skruehuller boret til fastgørelse af scenen til et mikroskop. (D) pladen er 1,5 mm tyk x 150 mm bred x 200 mm lang, med et centreret 30 mm diameter hul. I de samme positioner som i forkant pladen, er fire 4,2 mm skruehuller boret til fastgørelse af scenen til et mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 2: design tegning af aluminiumsplader (uden dimensioner). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 3: design tegning af aluminiums Piedekaler. (A) skal monteres på over siden: diameter er 100 mm, tykkelse er 3 mm. Et hul med en diameter på 30 mm bores i midten, og en udskæring på 42 mm bredde x 30 mm dybde er lavet på den ene side. B) monteres på den nedre side: diameter er 100 mm, tykkelse er 4 mm. Et hul med en diameter på 30 mm bores i midten, og tre 3 mm huller er placeret ved 120 ° i en afstand af 25 mm fra midten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 4: design tegning af pressede kork skiver. (A) skal monteres på den øvre side mellem silicium gummi varmer og den øvre aluminiums sokkel: diameter er 100 mm, tykkelse er 2 mm. Et hul med en diameter på 20 mm bores i midten, og to snit (42 mm bred x 30 mm dyb, 4 mm bred x 40 mm) er lavet vinkelret på hinanden i siderne af skiven. (B) monteres på den nedre side mellem silicium gummi varmer og den nedre aluminiums sokkel: diameter er 100 mm, tykkelse er 1 mm. Et hul med en diameter på 20 mm bores i midten. (C) denne støtte er 42 mm bred × 30 mm dyb, og skåret fra omkredsen af en 100 mm diameter skive. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 5: specifikation af silikone gummi varmer. Diameteren er 100 mm og tykkelsen er 2,5 mm. Et hul med en diameter på 20 mm bores i midten. Strømforsyningen er 12 V, med en belastningskapacitet på 18 W. Varmelegeme består af Nichrome wire, med en ledning forbundet til elektroden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 6: tværsnit af mikroskop stadiet. Dette er en sektions visning af mikroskop stadiet. Aluminiums piedestal er fastgjort til bagsiden aluminiumsplade og gummi varmer er installeret på den yderste overflade. Den pressede kork er installeret til isolering mellem gummi varmer og aluminium piedestal. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 7: oplysninger om kredsløbs diagrammet. Dette indikerer kredsløbet bygget i controlleren. Kredsløbet diagram er opdelt i ni dele i henhold til individuelle funktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 8: design tegning af plastic controller sag. Dimensionerne er 143,9 mm længde x 85,3 mm dybde x 25 mm bredde. Temperatur indstillingsknappen, betjenings-/overophednings lampen og indikatoren er placeret på plastic controller-etuiet. Temperaturen kan indstilles, mens du ser indikatoren ved at dreje på set-knappen. Hvis du trykker på denne knap, starter temperaturregulatoren. Den målte temperatur vises i realtid, og varmelegemet styres, så den når og holder den indstillede temperatur. Når temperaturregulatoren er tændt, lyser den blå LED op og forbliver tændt, mens varmelegemet er i drift. Når varmelegeme overophedet, den røde LED kommer på og varmelegeme automatisk stopper. Hvis du trykker på temperaturregulator knappen igen, stoppes den. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 9: system konfiguration. Mikroskop scenen med en indbygget controller er forbundet til gummi varmer med et dedikeret kabel. Målte prøvetemperatur signaler modtages, og strømmen til gummi varmeren transmitteres af controlleren. Målte signaler fra controlleren sendes trådløst til serveren via internet routeren. Serveren kompilerer målingsdata til analyse og graftegning. Overvågning af temperaturloggen og temperaturindstillinger kan fjernstyres via en PC eller smartphone. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 10: måling af temperaturfordeling ved termo grafi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trajectory analyse af bevægelige Diatom celler er en nyttig tilgang til at evaluere Diatom motilitet. Men mens en normal inverteret mikroskop observerer prøver horisontalt, er det ikke egnet til observationer af påvirkning af tyngdekraften eller flydende bevægelse i den lodrette retning. Udviklet og beskrevet her er et vertikalt mikroskop stadie med temperaturstyring og fastgjort til et inverteret mikroskop, som er blevet roteret med 90 °. Dette mikroskop fase med temperaturkontrol tillader observation af temperaturafhængig vertikal bevægelse af Diatom celler.
Et kritisk skridt i protokollen er controlleren kredsløb design. En afbryder kredsløb blev implementeret for at sikre sikkerheden. Når sensoren frakobles prøven, eller mikrocontrolleren ikke fungerer korrekt, afbrydes strømmen til varmelegemet af et andet kredsløb end mikrocontrolleren.
Da kontrolsystemet vedtog PID-systemet til at styrestrøm af varmelegeme, en teknik til at finde den optimale parameter af PID er påkrævet. Sammenlignet med den eksisterende metode er fjernbetjening og overvågning mulig ved hjælp af Wi-Fi-funktion, dataindsamling på en server og temperatur indstillingsfunktionen. Da strukturen i den fase del, der er knyttet til mikroskopet, er kompliceret, berettiger forenklingen af denne struktur til en fremtidig undersøgelse.
Dette udstyr bruger et varmelegeme til at hæve temperaturen, men afkøling er udrevet; Derfor kan den indstillede temperatur ikke være under stuetemperatur. Køle prøver til temperaturer lavere end stuetemperatur vil kræve en kompliceret køleanordning, som er under overvejelse for fremtidigt arbejde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne har ingen bekræftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30? | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A - MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W.
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM - selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields - A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A.
- Edgar, L. A.
- Edgar, L. A.
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates - potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion - An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
