Summary
Presenteras här är ett protokoll med hjälp av en temperaturkontrollerad Mikroskop skede som gör att en provbehållare som skall monteras på ett vertikalt Mikroskop.
Abstract
Proverna placeras vanligtvis på ett horisontellt Mikroskop Stadium för mikroskopisk observation. Men för att iaktta inverkan av gravitationen på ett prov eller studera flytande beteende, är det nödvändigt att göra mikroskopet skede vertikalt. För att åstadkomma detta, ett sidledes inverterat Mikroskop lutas av 90 ° har utarbetats. För att observera prover med detta Mikroskop, måste provbehållare som petriskålar eller glas diabilder säkras till scenen vertikalt. En anordning som kan säkra provbehållare på plats i ett vertikalt Mikroskop skede har utvecklats och beskrivs här. Fastsättning av denna enhet på scenen tillåter observation av provet dynamik i vertikalplanet. Förmågan att reglera temperaturen med en silikon gummi värmare tillåter också observation av temperaturberoende prov beteenden. Dessutom överförs temperaturdata till en Internet-Server. Temperaturinställningar och logg övervakning kan fjärrstyras från en dator eller smarttelefon.
Introduction
Optisk mikroskopi är en teknik som används för att öka observerbara Detaljer via förstoring av ett prov med linser och synligt ljus. I optisk mikroskopi, ljus riktas på ett prov, sedan sänds, reflekteras, eller fluorescerande ljus fångas av förstoringsglas för observation. Olika typer av Mikroskop finns tillgängliga som skiljer sig i design för att rymma olika användningsområden och observationsmetoder. De olika designerna inkluderar ett upprätt Mikroskop, som är uppbyggt för att belysa ett prov underifrån för observation ovanifrån, och ett inverterat Mikroskop, som belyser provet från ovan för observation underifrån. Upprätt Mikroskop är den vanligaste och mest använda designen. Inverterade Mikroskop används ofta för att observera prover som inte kan tillåta en lins nära i avstånd från ovan, såsom odlade celler anhängare till botten av en behållare. Många forskargrupper har rapporterat observationer inom ett brett spektrum av fält med inverterade Mikroskop1,2,3,4,5,6,7. Många ytterligare enheter har också utvecklats som utnyttjar funktionerna i inverterade Mikroskop8,9,10,11,12,13 .
För närvarande, i alla konventionella Mikroskop konstruktioner, mikroskopet scenen är horisontell och är därför olämpligt för observation av prover som producerar rörelse i vertikalplanet, (på grund av tyngdkraften, flytkraft, rörelse, etc.). För att göra dessa observationer möjliga, måste mikroskopet scenen och ljusbanan roteras till vertikal. Den vertikala etappen krävs för att vertikalt montera glas rutschbanor eller provbehållare såsom en petriskålar till scenen. För att ta itu med detta har en sidledes inverterad Mikroskop lutas av 90 ° redan utarbetats. Men att fästa prover med tejp eller andra lim ger inte den nödvändiga långsiktiga orörlighet. Beskrivs här är en enhet som kan uppnå den nödvändiga stabiliteten. Denna enhet tillåter observation över tiden för prov förflyttning i vertikalplanet. Montering av en kisel gummi värmare har också gjort det möjligt att observera påverkan av temperaturvariationer på prov beteende. Temperaturdata överförs till en Internet-Server via Wi-Fi, och temperaturinställningar och logg övervakning kan fjärrstyras från en dator eller smarttelefon. Till vår kännedom har det stadium som fästs på ett sidolutande Mikroskop lutas med 90 ° ännu inte rapporterats i tidigare studier.
Mikroskopet arrangerar består av tre Aluminum pläterar. Den mellersta aluminium plattan är monterad på den nedre aluminium plattan som fäster på scenen. Silikon gummit som innehåller temperaturgivaren är fäst mellan mellersta och övre aluminiumplåtar. Gummiband används för att anbringa provet. Klor är fästa i vänster och höger fyra punkter i den övre aluminium plattan för att säkra gummibanden. Temperatur regulatorns styrkrets får en signal från temperaturgivaren inbäddad i silikon gummi och modulerar elkraft med PWM-metoden (Pulse Width Modulation). Temperaturen kan gradvis ökas till 50 ° c i steg om 1 ° c. Den här enheten är användbar för tillämpningar där vertikala prov rörelser kan vara temperaturberoende.
Denna rapport ger exempel på temperatureffekter på det flytande fenomenet med kiselalger. Som exempel på diatomobservationsstudier har mätningar av sänkningshastighet av cell kluster, rörelse analyser, ultrafina strukturstudier, etc. rapporterats14,15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. den specifika vikten av kiselalger som flyter i vatten med fotosyntetiska organismer är något högre än vatten, så de tenderar att sjunka. men de kommer att stiga om även liten konvektion sker. För att studera detta fenomen, en glasfiber är fäst vertikalt till ett Mikroskop skede, och effekterna av ökande temperatur på av kiselalger vertikal rörelse observeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. design
- Tillverkning av aluminiumplåtar
- Skär en 101 mm hål i mitten av en aluminiumplåt av dimensioner 150 mm x 200 mm x 2 mm som skall användas som framkant plattan med en laser bearbetningsmaskin. Maskin klor vid åtta punkter för att fästa två gummiband över längden, eller två över bredden på denna platta (se kompletterande figur 1a och kompletterande figur 2A).
- Skär en 130 mm hål i mitten av en annan 150 mm x 200 mm x 5 mm aluminiumplåt som skall användas som mellersta övre plattan med en laser bearbetningsmaskin. Maskin åtta Hack för att fästa gummiband på två punkter över längden, eller två över bredden på denna platta (se kompletterande figur 1b och kompletterande figur 2b).
- Skär ett hål på 130 mm i mitten av en 150 mm x 200 mm x 4 mm aluminiumplåt som ska användas som mellersta nedre plattan med en laser bearbetningsmaskin (se kompletterande figur 1c och tilläggs figur 2C).
- Skär ett 30 mm hål i mitten av en 150 mm x 200 mm x 1,5 mm aluminiumplåt som ska användas som bottenplatta (se kompletterande figur 1d och kompletterande figur 2D).
- Tillverkning av två aluminium piedestal
- Skär ett 30 mm hål i mitten av aluminium plattan (100 mm diameter, 3 mm tjocklek) och gör ett snäpp från ena sidan med måtten 42 mm bred x 30 mm djup (se kompletterande figur 3a).
- Skär ett 30 mm hål i mitten av plattan i en aluminiumplåt (100 mm diameter, 4 mm tjocklek) och borra tre 3 mm hål belägna 25 mm från mitten, fördelade 120 ° från varandra (se kompletterande figur 3b).
- Tillverkning av tre pressade kork skivor
- Skär ett 20 mm hål i mitten av den pressade kork skivan (100 mm diameter, 2 mm tjocklek) med en vattens kärnings maskin. Gör en klippa 42 mm över x 30 mm djup, sedan en klippa 4 mm bred x 5 mm djup (se kompletterande figur 4a).
- Skär en 20 mm hål i mitten av den pressade kork skiva av dimensioner 100 mm diameter, 1 mm tjocklek med en vattenstråleskärmaskin. Gör en klippa 42 mm över x 30 mm djup, en klippa 4 mm bred x 40 mm djup (se kompletterande figur 4b).
- Skär en pressad kork plåt från en 100 mm diameter skiva med en 42 mm bredd och 30 mm djup. Två ark med 1 mm tjocklek och ett ark med 2 mm tjocklek krävs (se kompletterande figur 4c).
- Tillverkning av silikon gummi värmare
- Fabricera en värmare med en 100 mm diameter skiva av 2,5 mm tjockt kisel gummi med inbyggd Nikromtråd och skär ett 20 mm hål i mitten av skivan (se kompletterande figur 5).
- Montera delar som beskrivs i steg 1.1 – 1.4 genom att stapla dem som visas i kompletterande figur 6.
- För att konstruera ett Mikroskop skede, se kompletterande figur 6, tvärsnitt av Mikroskop stadiet. Fix
och 
sedan 
och 
med skruvar. Fix och 
med skruvar. Fix och 
, och, och, och och och med lim. 
och 
sedan 
och 
med skruvar. Fix 
med skruvar. Fix 
, och, och, och och och med lim. 
2. Hardware design konturer
- Förbered en "strömförsörjning och programmerings krets" som visas i kompletterande figur 7. Leverera 12 V DC till aggregatets styrenhet från J4-terminalen ansluten till AC-adaptern. Minska spänningen från 12 V DC till 3,3 V DC för kretsen strömförsörjning med hjälp av en regulator eftersom CPU matningsspänningen är 3,3 V DC.
Obs: USB 1 är en Terminal för 5 V DC och seriell signal för Development PC. Även om 5 V DC inte är nödvändigt, används den som strömkälla för att programmera processorn. Detta är också omvandlas till 3,3 V DC av regulatorn. J1 är en kontrollsignal terminal vid tiden för programmering. Den här kretsen är inrymd i det styrenhets fall som visas i kompletterande figur 8. - Förbered en "värmare styrkrets" som visas i kompletterande figur 7. Byt till 12 V DC med Q5 (P Channel MOS FET) och förse aggregatet med den. Q5 är ett kopplingselement som styr 12 V DC med PWM för att justera mängden ström som tillförs aggregatet.
Obs: kretsen inkluderar en lysdiod för att visuellt bekräfta att spänningen tillförs aggregatet. Den här driv signalen (HEATER_C) är en PWM-signal från processorn. När en överhettnings signal upptäcks av Skyddskretsen, växlar brytaren signalen till låg, och driften av MOS-FET stannar. Den här kretsen är inrymd i det styrenhets fall som visas i kompletterande figur 8. - Förbered en "kopplings krets förvärmaren het" som visas i kompletterande figur 7. Installera en USB-kontakt för anslutning med värmaren sektion.
Obs: denna krets är inrymt i styrenheten fallet visas i kompletterande figur 8. - Förbered en "kopplings krets för temperaturgivare" som visas i kompletterande figur 7. Montera anslutningsdonet (Euroblock-kärlet 2P) för att ansluta temperaturgivaren.
Obs: denna krets är inrymt i styrenheten fallet visas i kompletterande figur 8. - För en "A/D-omvandlare" som visas i kompletterande figur 7, använd Ads 1015 som en annons konverteringsenhet.
Obs: annons konverteringsenhet omvandlar värdena för temperatursensorn och överhettnings detekterings sensorn från spänning till digitala värden. Detta är en 12-bitars multiplexer annons konverteringsenhet och är ansluten till processorn med I2C-gränssnittet. Den här kretsen är inrymd i det styrenhets fall som visas i kompletterande figur 8. - Gör en "skyddskrets" som visas i kompletterande figur 7 genom att ansluta överhettnings detekterings givaren (OHS) signalen till den inverterande ingången på op amp. Jämför denna signal med spänningen i trimnings motståndet som är anslutet till den icke-inverterande ingången.
- Se till att när spänningen blir lägre än spänningen i trimnings motståndet, går utgången på OP-förstärkaren hög, den anslutna NPN transistor Q2 slås på och BRYTAR signalen blir låg.
- Se till att Q4 slås på och den anslutna överhettnings indikatorn LED D6 tänds.
Obs: denna krets är inrymt i styrenheten fallet visas i kompletterande figur 8.
- För en "display avsnitt" som visas i kompletterande figur 7, Använd 192 x 64 prickar för OLED. Anslut med processorn via I2C-gränssnittet.
- Återställ OLED genom att separera GND av OLED av CPU-signalen IO0 med hjälp av en NPN transistor Q1 ansluten till GND av OLED.
Obs: denna OLED visar olika typer av information. Den här kretsen är inrymd i det styrenhets fall som visas i kompletterande figur 8.
- Återställ OLED genom att separera GND av OLED av CPU-signalen IO0 med hjälp av en NPN transistor Q1 ansluten till GND av OLED.
- För en "LED & roterande kodare med push switch" i kompletterande figur 7, montera en roterande kodare av lödtenn som fungerar som en push-switch och innehåller två lysdioder.
- Anslut en lysdiod till VCC för användning som strömlampa. Den andra är ansluten till processorn för användning som en indikator under värmaren drift.
- Använd en push switch kontakt för värmare START/stopp som är ansluten till CPU. Anslut A-och B-utgångarna för Rotary encoder till IO-ingången i CPU-avbrottet.
Obs: denna krets är inrymt i styrenheten fallet visas i kompletterande figur 8.
- För processorn i kompletterande figur 7, Använd CPU Wroom-02d.
- Utdata från IO12, IO13 till "displayenheten" eftersom gränssnittet på displayen är I2C standard. Anslut IO0 till "displayenhet" och Återställ OLED.
- Anslut IO15 till "värmare styrenhet" och kontrollera den ström som levereras till aggregatet genom PWM utgång.
- Anslut IO2 till "LED & Rotary encoder med push switch" och tända START LED. Anslut IO4 och IO14 till "LED & Rotary encoder med push switch" och ta emot signalerna (REA och REB) från Rotary encoder för att bestämma den inställda temperaturen. Anslut IO5 till "LED & Rotary encoder med push switch" och starta/stoppa värmaren.
3. Beskrivning av programvarans utformning
- Använd Arduino CORE för WROOM-02D för processorn som styrenhet för det här systemet.
Obs: som inmatningsenheter används start/stopp-brytaren, rotationsgivare, temperaturgivare (termistor). Som utdataenheter används en lysdiod, teckendisplay (OLED) och värmare. Kommunikationsenheten använder Wi-Fi. - Beskrivning av operationen
- Detektera driften av rotationsencoder som visas i LED & rotationsencoder med tryckbrytaren i kompletterande figur 7, lagra den som den inställda temperaturen och visa den på OLED. Ställ in ingången på processorn som fas terminalerna REA och REB är anslutna till som en avbrotts ingång och bearbeta rotationen (framåt och bakåt) på Rotary encoder genom att avbryta. Ställ in den på + 1 för framåtrotation och-1 för omvänd rotation. Skriv den inställda temperaturen till den globala variabeln och använda den för värmare temperaturkontroll. Samtidigt uppdatera den inställda Temperaturdisplayen på OLED.
- Identifiera start och stopp av CPU IO 5 genom att starta/stoppa switch (SW-S) som visas i processorn i kompletterande figur 7. Tillståndet för start/stopp-knappen är en timer avbrotts process varje 50 ms.
Obs: eftersom växeln är en momentan switch, det vänder tillståndet för start/stopp när den trycks och släpps. Det här tillståndet lagras i den globala variabeln. - Använd en termistor för temperaturgivaren. Läs de uppmätta värdena från prov sensorn (se "anslutnings krets för värmare anslutning" i kompletterande figur 7) i processorn efter A/d-omvandlare (se "a/d-omvandlare" i kompletterande figur 7). Ange strömmen till värmaren genom att vrida på IO15-porten i "CPU" av kompletterande figur 7.
Obs: det finns två typer av temperatursensorer. En används för att mäta temperaturen på provet och kontrollera värmaren på den inställda temperaturen, och den andra är ansluten till en värmare och används för värme förebyggande. Anslut termistor till 3,3 V via ett motstånd och registrera förändringen i motståndet som en förändring i spänningen. Ta bort ett brus med metoden för glidande medelvärde. - Använd en termistor för temperatur förebyggande temperaturgivare. Överhettnings detektering utförs med hjälp av en termistor (R2) ("kopplings krets för värme anslutning" i kompletterande figur 7), och när det inställda värdet överskrids stängs värmarens ström av ("skyddskrets" i kompletterande figur 7).
Obs: denna sensor är inbyggd i en krets och inte genom processorn. Denna sensor är oberoende av processorn och jämfört med motståndet värde som fastställts av motstånd trimmer av en differential förstärkare på ett analogt sätt. När den upptäcker att temperaturen har överskridit det inställda värdet, ingriper den i FET switch, som styrströmmen till aggregatet och med tvång stoppar den nuvarande försörjningen. Syftet är att förhindra att temperaturen hos värmaren överskrider en viss nivå även i en situation där processorn inte fungerar korrekt. - Slå på lysdioden i "LED & Rotary encoder med push switch" av den kompletterande siffran 7 av processorn (i "CPU" av kompletterande figur 7), när utrustningen är i drift.
- Visa den inställda temperaturen och uppmätt värde till OLED i "display avsnitt" av kompletterande figur 7 av processorn (i "CPU" av kompletterande figur 7).
- Kör FET switch i "värmare kontrollkrets" av kompletterande figur 7 med PWM från CPU för att styra värmaren.
- Kontrollera värmaren med PID, baserat på uppmätta temperaturer som fås av temperaturgivaren. Använd Arduino ' s pid_v1. h bibliotek för PID-bearbetning.
Obs: processorn kalibrerar tiden, kommunicerar med servern, överför data och tar emot instruktioner från servern. När sensor temperaturen överskrider den inställda temperaturen, är strömmen till värmaren satt till 0, och överskridandet dämpas. - Använd den inbyggda Wi-Fi-anslutningsfunktionen på processorn och Anslut till Internet. Sända ställa in temperatur, värmare temperatur, etc. till den utsedda servern via Wi-Fi.
4. system konfiguration
- Byggsystemet enligt kompletterande figur 9.
- Utrusta en Wi-Fi med styrenheten.
- Använd en termistor som sensor för temperaturmätning. Anslut termistortråden till "SENSOR"-terminalen på handkontrollens hölje. Ta emot temperatur signalen mätt med termistor.
- Anslut ett Mikroskop steg som innehåller gummi värmare och "värmare" av styrenheten fallet med en dedikerad kabel. Kontrollera strömmen till gummi värmaren.
- Ändra den inställda temperaturen med ratten på handkontrollen.
Obs: Temperaturlogg övervakning, temperaturinställning kan fjärrstyras från en PC eller smartphone. - Överför uppmätt temperatur, inställd temperatur och tidsinformation vid mätning från styrenheten till servern via Internet. Data mätningen cykeltid är 5 s och cykeltid fördataöverföring till servern är 1 min.
- Tillgång till servern från Controller sidan med jämna mellanrum och överföra mätdata som lagras i processorn för styrenheten till servern för analys och Graphing.
- Mer information om hur du använder servern finns i tilläggsmaterialet.
5. utformningen av det sidledes inverterade mikroskopet
- Fix två aluminiumplattor av 15 mm i tjocklek vertikalt med skruvar för att skapa en grundläggande montera.
- Fäst en jigg (en plats) på den horisontella delen av bas fästet.
- Placera mikroskopet skede delen vertikalt, fäst jiggar (två ställen) till den vertikala delen av bas stativet och fäst botten av mikroskopet till bas stativet.
- Fäst mikroskopet steg med skruvar.
6. funktionssätt
Anmärkning: här är det prov som används en blandning av fet modifierad basal sötvatten näringslösning flytande odlingssubstrat, Natriummetasilikat, vitaminer, och sterilt vatten. 800 μL av detta prov späds i 10 mL färskvatten.
- Observationsmetod
- Injicera 1 000 μL av det preparerade provet i en egentillverkad glas kammare.
Obs: den egentillverkade glas kammaren arrangerar två glid glasögon parallellt och fixar dem med ett lim. En normal petriskål har en stor tjocklek och cellerna flyr i djup riktningen i kammaren, vilket gör det svårt att observera med ett mikroskop. För att förhindra detta görs kammaren med en liten djup riktning, vilket gör det möjligt att förhindra att cellerna flyr i djup riktningen i kammaren. En låg temperatur botas epoxiharts lim används för att binda runt glaset för att förhindra provet släppa från kammaren. - Anslut en separat förberedd videokamera till mikroskopet. Anslut en videokamera med hjälp av mikroskopets dedikerade objektiv adapter och skjut provet.
- Använd ett Mikroskop med en 10X okularet och 200x mål.
- Fäst det vertikala mikroskopet i ett Mikroskop på fyra ställen med 4 mm skruvar.
Anmärkning: se kompletterande figur 1a och kompletterande figur 2A för konstruktionsritningar av aluminiumplåtar. I detta experiment användes ett inverterat Mikroskop. Detta lutades av 90 °, och den fabricerade Mikroskop skede var fäst med skruvar. Se figur 1. - Säkra provet med två gummiband med de fyra klor som gjorts på längden. Placera ett prov på ett Mikroskop Stadium vinkelrätt mot markytan.
- Ställ in temperaturen till 40 ° c med regulatorn som visas i kompletterande figur 8. Vrid på Controller-ratten för att ställa in temperaturen. Kontrollera den inställda temperaturen på displayen. Tryck på ratten för att starta temperaturkontroll, och den blå lysdioden tänds. Tryck på vredet igen för att stänga av lysdioden och stoppa temperaturkontrollen.
Obs: den uppmätta temperaturen visas i realtid och aggregatet styrs för att nå den inställda temperaturen. När temperaturkontrollen startar tänds den blå lysdioden och förblir så medan aggregatet är i drift. När värmaren överhettas, den röda LED-lampor, och värmaren stannar automatiskt. - Se "Server bruksanvisning" i Tilläggsinformation för serverdrift.
Obs: en server för datalagring krävs. Serverns databas använder My-SQL.
- Injicera 1 000 μL av det preparerade provet i en egentillverkad glas kammare.
7. mätning av yttemperaturfördelningen hos gummi värmare
- Mät fördelningen av gummi värmaren yttemperatur genom Termografi för att kontrollera temperaturen enhetlighet.
- Fäst mikroskopet skede som ingår en gummi värmare med ett stativ.
- Ändra inställnings temperaturen för gummi värmaren ytan till 35 ° c, 45 ° c, 55 ° c och 65 ° c, och mät med Termografi framifrån (se kompletterande figur 10).
8. test av temperaturrespons
- Starta temperaturkontroll genom att ställa in provtemperaturen till 30 ° c. Vänta tills mätvärdet når 30 ° c och stabiliseras. Öka den förinställda temperaturen stegvis med 5 ° c från 30 ° c till 50 ° c och vänta tills det uppmätta värdet stabiliseras efter respektive förinställd temperatur.
- Sänk den förinställda temperaturen stegvis med 5 ° c från 50 ° c till 30 ° c och upptäck spårnings förmågan hos det uppmätta värdet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar gummi värmarens temperaturfördelning. Yttemperaturen på gummi värmaren var enhetlig vid varje temperatur. Figur 3 visar den uppmätta temperaturens lyhördhet för att ställa in temperaturförändringar. Den orangefärgade linjen visar den inställda temperaturen och den blå linjen visar förändringen av provtemperaturen. Överskridandet av det uppmätta värdet på inställnings förändringen är liten och spårningen är snabb.
Diatomceller observerades för att ge ett specifikt exempel på användning av denna enhet. Den bana analys av rörliga av kiselalger celler är en användbar metod för att utvärdera motilitet av diatomceller. Men även om en normal inverterad Mikroskop iakttar provet horisontellt, är det inte lämpligt för observation av påverkan av gravitation eller flytande rörelse i vertikal riktning.
I detta experiment var mikroskopet skede med temperaturregulator fäst vid ett inverterat Mikroskop som hade roterats 90 °. Den temperaturberoende vertikala rörelsen hos kiselalger har registrerats. Med denna metod upptäcktes den vertikala rörelse av kiselalger som visas i figur 4. Som ett resultat av observation med 100 individer av kiselalger var medelhastigheten 7,01 μm/s vid rumstemperatur och 470,1 μm/s vid 40 ° c. Effekterna av termisk konvektion på den vertikala flytande fenomen av diatomceller visualiserades genom direkt observation.
Bild 1: fotografi av anordningen som är fixerad i Mikroskop stadiet. Utseendet på anordningen som är fast i Mikroskop stadiet. Enheten är fixerad i Mikroskop stadiet med fyra skruvar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: temperaturfördelning av gummi värmare. Fördelningen av gummi värmare mätt med Termografi. Värmarens temperatur ändrades stegvis från omgivningstemperatur till 35 ° c, 45 ° c, 55 ° c och 65 ° c. Temperaturen var jämnt fördelad över värmaren vid varje temperatur. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: temperatur signalens lyhördhet. Detta visar svaret när den inställda temperaturen höjs från 30 ° c till 50 ° c och sänks från 50 ° c till 30 ° c. Den inställda temperaturen ändrades i steg om 5 ° c. I stall tillståndet är den uppmätta temperaturen inom ± 1,5 ° c av det inställda värdet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: den Locus av av kiselalger rörelse. De vertikala banor av av kiselalger rörelse på grund av temperaturförändringar har plottas. De blå linjerna visar banor av diatomceller vid 25 ° c för 27,06 s och vid 40 ° c för 0,2 s. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: konstruktionsritning av aluminiumplåtar (med mått). (A) plattan är 2 mm tjock x 150 mm bred x 200 mm lång, med ett Centrerat hål på 101 mm diameter för att möjliggöra införande av gummi värmare. Varje platta kant har två maskinbearbetade klor som gummiband kan fästas för att säkra prover på scenen. För att fästa denna vertikala etapp på ett Mikroskop med 4 mm skruv, borras 4,2 mm skruvhålen på fyra platser symmetriskt kring det centrala hålet. (B) plattan är 5 mm tjock x 150 mm bred x 200 mm lång, med ett Centrerat hål på 130 mm i diameter. Maskin notch platser för att matcha klo platser på Forefront plattan för att möjliggöra fastsättning av prov säkring gummiband över scenen. För fastsättning av scenen i ett Mikroskop borras fyra 4,2 mm skruv hål i matchande platser till de i frontplåten. (C) plattan är 4 mm tjock x 150 mm bred x 200 mm lång, med ett Centrerat hål på 130 mm i diameter. En 30 mm span skärs ut ur mitten av den högra 200 mm ytan av plattan, till djupet av det centrala hålet. Detta syfte med Cut-out är att tillåta fastsättning av värmaren kontakten på höger sida. I samma positioner som i framkant plattan borras fyra 4,2 mm skruvhålen för fastsättning av scenen till ett mikroskop. D) plattan är 1,5 mm tjock x 150 mm bred x 200 mm lång, med ett Centrerat hål på 30 mm i diameter. I samma positioner som i framkant plattan borras fyra 4,2 mm skruvhålen för fastsättning av scenen till ett mikroskop. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: konstruktionsritning av aluminiumplåtar (utan mått). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: design ritning av aluminium piedestaler. A) monteras på ovansidan: diametern är 100 mm, tjocklek 3 mm. Ett hål på 30 mm i diameter borras i mitten och en utstansningar på 42 mm bredd x 30 mm djup görs på ena sidan. (B) installeras på den nedre sidan: diametern är 100 mm, tjocklek 4 mm. Ett hål på 30 mm i diameter borras i mitten, och tre 3 mm hål har placerats på 120 ° till varandra på ett avstånd av 25 mm från centrum. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 4: design ritning av pressade kork skivor. (A) installeras på ovansidan mellan silikon gummi värmare och den övre aluminium piedestalen: diametern är 100 mm, tjocklek är 2 mm. Ett hål på 20 mm diameter borras i mitten, och två skär (42 mm breda x 30 mm djupa, 4 mm breda x 40 mm) görs i rät vinkel mot varandra i skivans sidor. (B) installeras på den nedre sidan mellan kisel gummi värmare och nedre aluminium piedestal: diameter är 100 mm, tjocklek är 1 mm. Ett hål på 20 mm diameter borras i mitten. (C) detta stöd är 42 mm brett × 30 mm djup, och skär från omkretsen av en 100 mm diameter skiva. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 5: specifikation av silikon gummi värmare. Diametern är 100 mm och tjockleken är 2,5 mm. Ett hål på 20 mm diameter borras i mitten. Strömförsörjningen är 12 V, med 18 W lastkapacitet. Aggregatet består av Nikromtråd, med en bly tråd ansluten till elektroden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 6: tvärsnitt av Mikroskop stadiet. Detta är en sektions bild av mikroskopet skede. Aluminium piedestalen fästs på baksidan av aluminium plattan och gummi värmaren monteras på den yttersta ytan. Den pressade kork installeras för isolering mellan gummi värmare och aluminium piedestal. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 7: närmare uppgifter om krets diagrammet. Detta indikerar den krets som är inbyggd i styrenheten. Krets diagrammet är uppdelat i nio delar beroende på individuella funktioner. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 8: konstruktionsritning av plast regulator fodral. Dimensionerna är 143,9 mm längd x 85,3 mm djup x 25 mm bredd. Inställningsratten för temperatur, drift/överhettnings lampa och indikator är placerad på höljet till plast styrenheten. Temperaturen kan ställas in medan du tittar på indikatorn genom att vrida på set-ratten. Om du trycker på detta reglage startas temperaturreglaget. Den uppmätta temperaturen visas i realtid och värmaren styrs så att den når och håller den inställda temperaturen. När temperaturregulatorn är påslagen tänds den blå lysdioden och lyser medan aggregatet är i drift. När värmaren blir överhettad tänds den röda lysdioden och aggregatet stannar automatiskt. Tryck på temperaturkontrollvredet igen för att stoppa den. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 9: system konfiguration. Mikroskop scenen med en inbyggd styrenhet är ansluten till gummi värmare med en dedikerad kabel. Uppmätta prov temperatur signaler tas emot och strömmen till gummi värmaren sänds av styrenheten. Uppmätta signaler från styrenheten skickas trådlöst till servern via internetroutern. Servern sammanställer mätdata för analys och grafering. Temperaturlogg övervakning och temperaturinställningar kan fjärrstyras via en dator eller smartphone. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 10: temperaturfördelningsmätning med Termografi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trajectory analys av rörliga diatomceller är en användbar metod för att utvärdera av kiselalger motilitet. Men medan ett normalt inverterat Mikroskop iakttar prover horisontellt, är det inte lämpligt för observationer av inverkan av gravitation eller flytande rörelse i vertikal riktning. Utvecklad och beskrivs här är ett vertikalt Mikroskop skede med temperaturkontroll och bifogas ett inverterat Mikroskop, som har roterats av 90 °. Detta Mikroskop skede med temperaturkontroll tillåter observation av temperaturberoende vertikal rörelse av diatomceller.
Ett kritiskt steg i protokollet är styrningen krets design. En brytar krets genomfördes för att garantera säkerheten. När sensorn är frånkopplad från provet eller mikrokontroller inte fungerar korrekt, strömmen till aggregatet är avskurna av en krets som skiljer sig från mikrokontroller.
Eftersom styrsystemet antog PID-systemet för att kontrollera strömmen av aggregatet, krävs en teknik för att hitta den optimala parametern för PID. Jämfört med den befintliga metoden är fjärrmanövrering och övervakning möjlig genom Wi-Fi-funktion, datainsamling på en server och temperatur inställnings funktionen. Eftersom strukturen på scenen del bifogas mikroskopet är komplicerat, förenkling av denna struktur motiverar en framtida studie.
Denna utrustning använder en värmare för att höja temperaturen, men kylning är odrivna; Därför kan den inställda temperaturen inte vara under rumstemperatur. Kylprover till temperaturer lägre än rumstemperatur kommer att kräva en komplicerad kyl anordning, som är under övervägande för framtida arbete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna har inga erkännanden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AC adapter 12V2A | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | AD-D120P200 | Tokyo, Japan |
| ADS1015 Substrate | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | adafruit PRODUCT ID: 1083 | Tokyo, Japan |
| Alminium Plate (Back Side Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 1.5mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Forefront Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 2mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 4mm | Gifu, Japan |
| Alminium Plate (Middle Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | W 150mm×L 200?×T 5mm | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Lower Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Aluminum Pedestal (Upper Plate) | Inoval Co., Ltd. | D 100mm×T 3mm (30Φ) | Gifu, Japan |
| Bold Modified Basal Freshwater Nutrient Solution | Sigma-Aldrich Co. LLC | B5282-500ML | St. Louis, USA |
| Controller Case | Marutsu Elec Co., Ltd. | pff-13-3-9 | Tokyo, Japan |
| CPU | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | ESP-WROOM-02D | Tokyo, Japan |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | CKX 53 | Tokyo, Japan |
| Low temperature hardening epoxy resin adhesive | ThreeBond Co., Ltd. | TB2086M | Tokyo, Japan |
| Multi-turn semi-fixed volume Vertical type 500 Ω | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | 3296W-1-501LF | Tokyo, Japan |
| OLED module | Akihabara Inc. | M096P4W | Tokyo, Japan |
| Pressed Cork (For supporting electrode ) | Tera Co., Ltd. | W 42mm×L 30? | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Lower Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 0.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Pressed Cork (Upper Disk) | Tera Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Ishikawa, Japan |
| Rotary encoder with switch with 2 color LED | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | P-05772 | Tokyo, Japan |
| Silicone rubber heater | Three High Co., Ltd. | D 100mm×T 2.5mm (20Φ) | Kanagawa, Japan |
| Substrate | Seeed Technology Co., Ltd. | mh5.0 | Shenzhen, China |
| Temperature sensor | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | NXFT15XH103FA2B050 | Tokyo, Japan |
| Three-terminal DC / DC regulator 3.3 V | Marutsu Elec Co., Ltd. | BR301 | Tokyo, Japan |
| Universal Flexible Arm | Banggood Technology Co., Ltd. | YP-003-2 | Hong Kong, China |
| USB cable USB-A - MicroUSB | Akizuki Denshi Tsusho Co., Ltd. | USB CABLE A-MICROB | Tokyo, Japan |
| Video Canera | Sony Corporation | HDR-CX590 | Tokyo, Japan |
References
- Drum, R. W.
- McBride, T. P. Preparing Random Distributions of Datom Values on Microscope Slides. Limnology and Oceangraphy. 33, 1627-1629 (1988).
- Liu, X. Y., Lu, Z., Sun, Y. Orientation Control of Biological Cells Under Inverted Microscopy. IEEE-ASME Transactions on Mechatronics. 16, 918-924 (2011).
- Kahle, J., et al. Applications of a Compact, Easy-to-Use Inverted Fluorescence Microscope. American Laboratory. 43, 11-14 (2011).
- Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. , 114-120 (2016).
- Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 10 (2017).
- Hedde, P. N., Malacrida, L., Ahrar, S., Siryaporn, A., Gratton, E. sideSPIM - selective plane illumination based on a conventional inverted microscope. Biomedical Optics Express. 8, 3918-3937 (2017).
- Crowe, W. E., Wills, N. K. A simple Method for Monitoring Changes in Cell Height using Fluorescent Microbeads and an Ussing-type Chamber for the Inverted Microscope. Pflugers Archiv-Europian journal of Physiology. , 349-357 (1991).
- Bavister, B. D. A Minichamber Device for Maintaining a Constant Carbon-Dioxide in Air Atmosphere during Prolonged Culture of Cells on the Stage of an Inverted Microscope. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 24, 759-763 (1988).
- Makler, A. A New version of the 10-MU-M Chamber and its use for Semen Analysis with Inverted Microscope. Archives of Andrology. 13, 195-197 (1984).
- Xu, Z., et al. Flexible microassembly methods for micro/nanofluidic chips with an inverted microscope. Microelectronic Engineering. 97, 1-7 (2012).
- Datyner, N. B., Gintant, G. A., Cohen, I. S. Versatile Temperature Controlled Tissue Bath for Studies of Isolated Cells using an Inverted Microscope. Pflugers Archive- Europian Journal of Physiology. 403, 318-323 (1985).
- Claudet, C., Bednar, J. Magneto-optical tweezers built around an inverted microscope. Applied Optics. 44, 3454-3457 (2005).
- Yamaoka, N., Suetomo, Y., Yoshihisa, T., Sonobe, S. Motion analysis and ultrastructural study of a colonial diatom, Bacillaria paxillifer. Microscopy. 65, 211-221 (2016).
- Apoya-Horton, M. D., Yin, L., Underwood, G. J. C., Gretz, M. R. Movement modalities and responses to environmental changes of the mudflat diatom Cylindrotheca closterium (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 42, 379-390 (2006).
- Bannon, C. C., Campbell, D. A. Sinking towards destiny: High throughput measurement of phytoplankton sinking rates through time-resolved fluorescence plate spectroscopy. PLoS One. 12, 16 (2017).
- Clarkson, N., Davies, M. S., Dixey, R. Diatom motility and low frequency electromagnetic fields - A new technique in the search for independent replication of results. Bioelectromagnetics. 20, 94-100 (1999).
- Iwasa, K., Shimizu, A.
- Edgar, L. A.
- Edgar, L. A.
- Iversen, M. H., Ploug, H. Temperature effects on carbon-specific respiration rate and sinking velocity of diatom aggregates - potential implications for deep ocean export processes. Biogeosciences. 10, 4073-4085 (2013).
- Riebesell, U. Comparison of Sinking and Sedimentation-Rate Measurements in a Diatom Winter Spring Bloom. Marine Ecology Progress Series. 54, 109-119 (1989).
- Drum, R. W., Hopkins, J. T. Diatom Locomotion - An Explanation. Protoplasma. 62, (1966).
